Name: improving reproducibility to meet minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 guidelines in nanoparticle tracking analysis
Uploaded: 2021-11-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Improving Reproducibility to Meet Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 Guidelines in Nanoparticle Tracking Analysis at JoVE.com

Работа была поддержана штатом Канзас для Института сравнительной биологии стволовых клеток Среднего Запада (MICSCB), Центром исследований рака Джонсона для MLW и NIH R21AG066488 для LKC. МЖС получил поддержку ГРА от МГМСКБ. Авторы благодарят доктора Сантоша Ариала за предоставление липосом, используемых в этом проекте, и членов лабораторий Вайса и Кристенсона за полезные беседы и обратную связь. Д-р Хонг Хэ благодарит за техническую поддержку. MLW благодарит Бетти Горен Вайс за ее поддержку и советы.

1. Общие протокольные рекомендации
<ol><li>Держите микроскоп на воздушном столе или, как минимум, на столе без вибрации. Убедитесь, что посторонние вибрации (например, постукивание ногами по полу, прикосновение к столу, закрытие дверей, лабораторное движение) сведены к минимуму.</li...

<ol>
	<li>Lotvall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+experimental+requirements+for+definition+of+extracellular+vesicles+and+their+functions:+a+position+statement+from+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles.">Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).</li><li>Thery, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Consortium, E. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EV-TRACK:+transparent+reporting+and+centralizing+knowledge+in+extracellular+vesicle+research.">EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research.</a> Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).</li><li>Gardiner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+used+for+the+isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles:+results+of+a+worldwide+survey.">Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 5, 32945 (2016).</li><li>Maas, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possibilities+and+limitations+of+current+technologies+for+quantification+of+biological+extracellular+vesicles+and+synthetic+mimics.">Possibilities and limitations of current technologies for quantification of biological extracellular vesicles and synthetic mimics.</a> Journal of Controlled Release. 200, 87-96 (2015).</li><li>Danaei, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+particle+size+and+polydispersity+index+on+the+clinical+applications+of+lipidic+nanocarrier+systems.">Impact of particle size and polydispersity index on the clinical applications of lipidic nanocarrier systems.</a> Pharmaceutics. 10 (2), 57 (2018).</li><li>Kestens, V., Bozatzidis, V., De Temmerman, P. J., Ramaye, Y., Roebben, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+particle+tracking+analysis+method+for+the+size+determination+of+nano-+and+microparticles.">Validation of a particle tracking analysis method for the size determination of nano- and microparticles.</a> Journal of Nanoparticle Research. 19 (8), 271 (2017).</li><li>Filipe, V., Hawe, A., Jiskoot, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+evaluation+of+nanoparticle+tracking+analysis+(NTA)+by+NanoSight+for+the+measurement+of+nanoparticles+and+protein+aggregates.">Critical evaluation of nanoparticle tracking analysis (NTA) by NanoSight for the measurement of nanoparticles and protein aggregates.</a> Pharmaceutical Research. 27 (5), 796-810 (2010).</li><li>Hole, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interlaboratory+comparison+of+size+measurements+on+nanoparticles+using+nanoparticle+tracking+analysis+(NTA).">Interlaboratory comparison of size measurements on nanoparticles using nanoparticle tracking analysis (NTA).</a> Journal of Nanoparticle Research. 15 (12), 2101 (2013).</li><li>Malvern analytical Ltd. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NanoSight LM10 Operating Manual-P550H. , (2013).</li><li>Kim, A., Ng, W. B., Bernt, W., Cho, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+size+estimation+of+nanoparticle+tracking+analysis+on+polydisperse+macromolecule+assembly.">Validation of size estimation of nanoparticle tracking analysis on polydisperse macromolecule assembly.</a> Scientific Reports. 9 (1), 2639 (2019).</li><li>Gollwitzer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+techniques+for+size+measurement+of+nanoparticles+in+cell+culture+medium.">A comparison of techniques for size measurement of nanoparticles in cell culture medium.</a> Analytical Methods. 8 (26), 5272-5282 (2016).</li><li>vander Pol, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+size+distribution+of+exosomes+and+microvesicles+determined+by+transmission+electron+microscopy,+flow+cytometry,+nanoparticle+tracking+analysis,+and+resistive+pulse+sensing.">Particle size distribution of exosomes and microvesicles determined by transmission electron microscopy, flow cytometry, nanoparticle tracking analysis, and resistive pulse sensing.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (7), 1182-1192 (2014).</li></ol>

Существует несколько методов оценки размера и концентрации наночастиц11. К ним относятся ансамблевые методы, которые генерируют оценку размера популяции, включая динамическое рассеяние света (DLS), центробежное осаждение и анализ на уровне одной частицы - электронную микро?...

Точный и воспроизводимый анализ электромобилей и других нанометровых частиц представляет собой многочисленные проблемы в исследованиях и промышленности. Тиражирование исследований EV было затруднено, в частности, из-за отсутствия единообразия в представлении необходимых параметров, связанных со сбором данных. Чтобы устранить эти недостатки, ISEV предложил отраслевые руководящие принципы в качестве минимального набора биохимических, биофизических и функциональных стандартов для исследователей EV и опубликовал их в виде заявления о позиции, обычно называемого MISEV20141. Ускоряющиеся темпы исследований электромобилей потребовали обновленного руководства, и «MISEV2018: заявление о позиции ISEV» расширило руководящие принципы MISEV20142. Документ MISEV2018 включал таблицы, наброски предлагаемых протоколов и шаги, которые необходимо выполнить для документирования конкретных характеристик, связанных с EV. В качестве дополнительной меры для облегчения интерпретации и тиражирования экспериментов EV-TRACK был разработан в качестве базы знаний краудсорсинга (http://evtrack.org), чтобы обеспечить более прозрачную отчетность о биологии EV и методологии, используемой для опубликованных результатов3. Несмотря на эти рекомендации в отношении стандартизированной отчетности о методах, на местах по-прежнему страдают в том, что касается воспроизведения и подтверждения опубликованных результатов.
В соответствии с усилиями Национальных институтов здравоохранения и Национального научного фонда по инструментам оценки качества, в этом документе предполагается, что ISEV требует стандартизированной отчетности о методах и деталях, чтобы инструменты оценки данных могли применяться с целью воспроизведения результатов между лабораториями. Отчетность об источниках клеток, процедурах культивирования клеток и методах изоляции EV являются важными факторами для определения качеств популяции EV. Среди приборов NTA такие факторы, как настройки обнаружения, показатель преломления жидкости-носителя, гетерогенные популяции частиц, способствующие полидисперсности, отсутствие стандартизированных требований к отчетности и отсутствие результатов измерений внутри и между наблюдателями, затрудняют или делают невозможным сравнение NTA между лабораториями.
Используемый с 2006 года, NTA является популярным методом определения размера наночастиц и концентрации, который в настоящее время используется примерно 80% исследователей EV4. Руководящие принципы MISEV2018 требуют двух форм анализа с одним пузырьком, одним из популярных вариантов которого является NTA. NTA по-прежнему широко используется для характеристики электромобилей из-за его широкой доступности, низкой стоимости за образец и его простой теории основания (уравнение Стокса-Эйнштейна). Оценка EV NTA генерирует оценку распределения и концентрации частиц по размеру с использованием лазерного рассеяния света и броуновского анализа движения, причем нижний предел обнаружения определяется показателем преломления EV. При использовании образца жидкости известной вязкости и температуры траектории электромобилей отслеживаются для определения их среднеквадратичного смещения в двух измерениях. Это позволяет рассчитать коэффициент диффузии частиц и преобразовать его в сферический эквивалентный гидродинамический диаметр по модифицированному уравнению Стокса-Эйнштейна 5,6,7. Анализ NTA от частицы к частице имеет меньшую интерференцию агломератами или более крупными частицами в гетерогенной популяции EV, чем другие методы характеристики7. В то время как несколько более крупных частиц оказывают минимальное влияние на точность определения размеров, присутствие даже незначительных количеств крупных частиц с высоким рассеянием света приводит к заметному снижению обнаружения более мелких частиц из-за снижения программного обнаружения и отслеживания EV8. В качестве метода измерения NTA обычно считается не смещенным в сторону более крупных частиц или агрегатов частиц, но может разрешать множественные популяции с помощью индивидуального анализа частиц9. Из-за использования рассеяния света частицами одним из ограничений анализа NTA является то, что любые частицы, такие как пыль, пластик или порошок с аналогичными преломлениями и размерными характеристиками по сравнению с EV, не могут быть дифференцированы от фактических EV с помощью этого метода характеристики.
NanoSight LM10 (анализатор размера наночастиц) и LM14 (лазерный модуль) продаются с 2006 года, и хотя были разработаны более новые модели этого прибора, эта конкретная модель встречается во многих основных установках и считается надежной рабочей лошадкой. Обучение необходимо для правильной оптимизации настроек NTA для измерений размера и концентрации с высоким разрешением. Двумя важными настройками, необходимыми для оптимальной видеозаписи, являются (1) уровень камеры и (2) порог обнаружения. Они должны быть установлены оператором на основе характеристик образца. Одним из основных ограничений анализа NTA является рекомендация о концентрациях пробы между 107 и 109 частицами/мл, для достижения этого разбавления пробы может потребоваться10. Растворы, используемые для разбавления, такие как фосфатно-буферный физиологический раствор, 0,15 М физиологического раствора или сверхчистая вода, редко свободны от частиц размером менее 220 мкм, что может повлиять на измерения NTA. NTA-характеристика растворов, используемых для разбавления, должна выполняться на том же уровне камеры и пороге обнаружения, что и анализируемые образцы наночастиц. Размер и концентрация наночастиц, присутствующих в разбавителях, используемых для разбавления образцов EV, редко включаются в публикации, связанные с NTA-анализом EV.
Этот протокол использует NTA-анализ синтетических EV-подобных липосом, оцениваемых с использованием выбранных уровней камеры, порогов обнаружения и механической фильтрации образцов для анализа систематических эффектов уровня камеры, порога обнаружения или фильтрации образцов на набор данных NTA. Липосомы были синтезированы, как описано в дополнительном файле S1. Синтетические липосомы были использованы в этом эксперименте из-за их однородности размеров, физических характеристик и стабильности при хранении при 4 °C. Хотя фактические образцы электромобилей могли быть использованы, гетерогенность и стабильность электромобилей во время хранения, возможно, усложнили это исследование и его интерпретацию. Сходство в отчетах NTA с (A) липосомами и (B) EV указывает на то, что систематические эффекты, выявленные для липосом в этой статье, вероятно, также будут применяться к характеристике EV (рисунок 1). В совокупности эти результаты подтверждают представление о том, что полная отчетность о критических настройках программного обеспечения и описание обработки образцов, таких как разбавитель, разбавление и фильтрация, влияют на воспроизводимость данных NTA.
Целью данной работы является демонстрация того, что изменение настроек NTA (температура, уровень камеры и порог обнаружения) и подготовка образцов изменяют собранные результаты: получены систематические, значительные различия в размерах и концентрации. Поскольку NTA является одним из популярных вариантов выполнения спецификации характеристик MISEV2018, эти результаты демонстрируют важность отчетности о подготовке образцов и настройках NTA для обеспечения воспроизводимости.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63059/63059fig01.jpg"> Рисунок 1: Репрезентативные отчеты NTA сравнивают липосомы с EV. (A) Липосомы: нефильтрованный образец, охарактеризованный на NTA 12 марта 2020 года. (B) EV: нефильтрованная выборка, охарактеризованная на NTA 26 августа 2021 года. Сокращения: NTA = анализ отслеживания наночастиц; EV = внеклеточные везикулы. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63059/63059fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Automatic Pipetter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes, Conical, Nunc 15 mL</td>
			<td>Thermo Sci.</td>
			<td>339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens Cleaner</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens Paper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight LM-10</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight LM-14 Laser Module</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosight NTA Software Ver. 3.2</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper Towels</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips, 1-200 &#181;L, Filtered, Sterile, Low Binding</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>P -3243-200X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips, 50-1,000 &#181;L, Filtered, Sterile</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>P-3243-1250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline, Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered (No Ca or Mg)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standards, Latex Transfer- 100 nm (3 mL)</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>NTA4088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standards, Latex Transfer- 50 nm&#160; (3 mL)</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>NTA4087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter, 33 mm, .22 &#181;m, MCE, Sterile</td>
			<td>Fisher brand</td>
			<td>09-720-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, TB, 1 mL, slip tip</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waste fluid container</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improving reproducibility to meet minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 guidelines in nanoparticle tracking analysis

Анализ отслеживания наночастиц (NTA) является одним из нескольких методов характеристики, используемых для исследования внеклеточных везикул (EV) с 2006 года. Многие считают, что приборы NTA и их программные пакеты могут быть легко использованы после минимального обучения и что калибровка размера возможна внутри компании. Поскольку как приобретение NTA, так и анализ программного обеспечения представляют собой характеристику EV, они рассматриваются в Минимальной информации для исследований внеклеточных везикул 2018 (MISEV2018). Кроме того, они контролировались с помощью прозрачной отчетности и централизации знаний в исследованиях внеклеточных везикул (EV-TRACK) для повышения надежности экспериментов с электромобилями (например, минимизации экспериментальных вариаций из-за неконтролируемых факторов).
Несмотря на усилия по поощрению отчетности о методах и средствах контроля, во многих опубликованных исследовательских работах не сообщается о критических настройках, необходимых для воспроизведения оригинальных наблюдений NTA. В немногих работах сообщается о характеристике NTA отрицательных контрольных или разбавителей, очевидно, предполагая, что коммерчески доступные продукты, такие как фосфатно-буферный физиологический раствор или сверхчистая дистиллированная вода, не содержат твердых частиц. Аналогичным образом, исследователи редко сообщают о положительных контрольных показателях или стандартах размера для проверки размера частиц. Уравнение Стокса-Эйнштейна включает в себя переменные вязкости и температуры образца для определения смещения частиц. Таким образом, сообщение о стабильной температуре лазерной камеры в течение всего видеосбора образцов является важной контрольной мерой для точной репликации. Фильтрация образцов или разбавителей также обычно не сообщается, и если это так, то редко включаются особенности фильтра (производитель, мембранный материал, размер пор) и условия хранения. Минимальные стандарты допустимых экспериментальных деталей Международного общества внеклеточных везикул (ISEV) должны включать хорошо документированный протокол NTA для характеристики EV. Следующий эксперимент предоставляет доказательства того, что протокол анализа NTA должен быть установлен отдельным исследователем и включен в методы публикаций, которые используют характеристику NTA в качестве одного из вариантов выполнения требований MISEV2018 для характеристики одного пузырька.

Таблица 1 содержит результаты видео NTA для образцов липосом (18 отфильтрованных и 18 нефильтрованных) и репрезентативного разбавителя DPBS. Сравнения по двум группам были завершены независимо от уровня камеры или порога обнаружения в этой статье. Отфильтрованные образцы имели сре...

Watch this Scientific Journal Video about Improving Reproducibility to Meet Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 Guidelines in Nanoparticle Tracking Analysis at JoVE.com

Improving Reproducibility to Meet Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 Guidelines in Nanoparticle Tracking Analysis

Анализ отслеживания наночастиц (NTA) является широко используемым методом для характеристики внеклеточных везикул. В этой статье освещаются экспериментальные параметры и средства контроля NTA, а также единый метод анализа и характеристики образцов и разбавителей, необходимых для дополнения руководящих принципов, предложенных MISEV2018 и EV-TRACK для воспроизводимости между лабораториями.

Улучшение воспроизводимости для соответствия минимальной информации для исследований внеклеточных везикул 2018 Guidelines in Nanoparticle Tracking Analysis

Nanoparticle tracking analysis (NTA) has been one of several characterization methods used for extracellular vesicle (EV) research since 2006. Many ...

Этот протокол был разработан для начинающих операторов NanoSight LM10. Следуя пошаговым инструкциям, можно получить точные и воспроизводимые результаты. Этот метод помогает обеспечить согласованные результаты в нескольких пробных запусках независимо от уровня квалификации пользователя.Характеристика наночастиц, особенно количественная оценка, продолжает оставаться проблемой в области исследований внеклеточных пузырьков. Этот протокол позволяет проводить последовательный анализ размера и концентрации наночастиц в суспензии. Начните с очистки стеклянных поверхностей лазерного модуля с помощью хорошего качества очистителя линз и бумаги для линз.Перед сборкой модуля убедитесь, что уплотнительное кольцо правильно установлено в канавке крышки проточной ячейки. Затем поместите крышку проточной ячейки на лазерный модуль, убедившись, что электрические контакты находятся в правильной ориентации. Затем поместите четыре подпружиненных винта большого пальца через пластину проточной ячейки и задействуйте резьбу лазерного модуля без затяжки по отдельности.Оказывая равномерное давление на крышку проточной ячейки, равномерно затягивайте винты большого пальца попеременно по диагонали до плотного расположения. Промывайте два одномиллилитрового туберкулиновых шприца с адаптерами скользящего замка три раза одним миллилитром DPBS. Извлеките и выбросьте плунжер из первого туберкулинового шприца, прежде чем вставить шприц в оставшийся порт, чтобы он служил в качестве пустого разбавителя или резервуара для образцов.Затем заполните второй шприц одним миллилитром DPBS и прикрепите его к входному порту крышки проточной ячейки. Держите лазерный модуль наклоненным с поднятым портом выходного шприца, чтобы воздух выдувался из камеры при медленном впрыскивании DPBS в лазерный модуль. Смывайте оставшуюся DPBS из лазерного модуля, впрыскивая один миллилитр воздуха во входной порт.Повторите промывку дважды. После последнего смыва очистите лазерный модуль как можно полнее и загрузите модуль для фокусировки и позиционирования. Откройте программное обеспечение.На вкладке захвата в левом верхнем углу нажмите кнопку Запустить камеру. Если фотокамера автоматически выключается через пять минут, нажмите кнопку Запустить камеру, чтобы перезапустить ее. На той же вкладке отрегулируйте уровень камеры до 14-16, чтобы осветлить лазерную линию и упростить идентификацию и фокусировку частиц.Перемещая верхний ползунок с левой стороны головного убора внутрь или наружу, переместите изображение с камеры на окуляры. В поле зрения найдите область повышенной плотности, называемую отпечатком большого пальца и центром, и сфокусируйте отпечаток пальца вертикально. В поле зрения центрируйте лазерную линию, затем переместите верхний ползунок, чтобы направить свет на камеру, как это наблюдается на экране компьютера.Изображение на экране компьютера является зеркальным отражением от вида в микроскопе окуляров. Отрегулируйте фокусировку, чтобы повысить резкость изображения отдельных движущихся частиц на экране с помощью ручки фокусировки. Чтобы загрузить образцы, вытяните один миллилитр образца в промытый один миллилитр туберкулиновый шприц и прикрепите шприц к входному отверстию крышки проточной ячейки.Продолжайте продвигать плунжер до тех пор, пока жидкость не появится в открытом шприце, прикрепленном к выходному отверстию. Модуль должен быть наклонен, чтобы воздух мог быть выдуваемым из лазерного модуля. В представлении камеры переместите фокус вправо от лазерной линии в область равномерного числа частиц.Отрегулируйте вертикальную ориентацию, чтобы центрировать горизонтальные полосы света и перефокусироваться до тех пор, пока не появится наибольшее количество частиц. Обеспечить сохранение положения фокуса последовательным для всех последующих мер. Отрегулируйте уровень камеры до такой степени, что темный информационный символ периодически мигает и выключается в правом верхнем углу обзора камеры.Для анализа отслеживания наночастиц, или NTA, установите продолжительность 30 или 60 секунд, а количество видео — пять. Чтобы изменить существующее базовое имя файла, щелкните вкладку нового сайта хранения для созданных данных с новым именем файла. Затем установите флажок целевой температуры, чтобы ввести желаемую температуру, и нажмите на создать скрипт для повторного использования стандартного измерения.После загрузки образца и готовности эксперимента к запуску щелкните Создать и запустить сценарий. Во всплывающем окне «Сведения о заданных деталях отчета» заполните поля необходимой информацией об операторе, образце и разбавителе. Когда все нужные поля будут заполнены, нажмите кнопку Параметры ОК, чтобы запустить сценарий.Перед каждым захватом видео ищите подсказку для продвижения плунжера вручную. Введите приблизительно 0,05 миллилитра образца в лазерную камеру. Когда частицы остановятся, нажмите кнопку ОК. После завершения пятого видеозахвата вместе с полем процесса появится окно подтверждения настроек.Поскольку кадры продвигаются вручную из нижней части видеоэкрана, обратите внимание на количество синих крестиков, образующих частицы на экране, и установите порог обнаружения для обработки образца. Подождите, пока видео будут автоматически обработаны в гистограмме результатов, прежде чем отобразится уведомление о завершении в диалоговом окне, затем нажмите OK. После появления окна параметров экспорта сохраните результаты, нажав кнопку Экспорт. Выделите все пять видеороликов захвата, перечисленных в текущем эксперименте.Затем щелкните Обработать выбранные файлы и подождите, пока в поле процесса появится окно подтверждения настроек, чтобы изменить порог обнаружения, затем отрегулируйте порог обнаружения до нужного уровня, перейдите к настройкам и нажмите кнопку ОК. Видео будут обработаны автоматически в гистограмме результатов и появится диалоговое окно с уведомлением о завершении. Нажмите OK.In репрезентативного анализа, показаны результаты нанотрекингового анализа или NTA для образцов липосом и репрезентативного разбавителя DPBS. Отфильтрованные образцы имели средний диаметр частиц 108 нанометров и концентрацию в 7,4 раза больше 10 до восьмых частиц на миллилитр.Напротив, нефильтрованные образцы имели средний диаметр частиц 159 нанометров и концентрацию в 7,6 раз от 10 до восьмой частицы на миллилитр. На комбинированных уровнях камеры, поскольку порог обнаружения был увеличен с двух до пяти, средний и режимный размер частиц показал значительное уменьшение размеров частиц отфильтрованных образцов. Концентрации частиц на комбинированных уровнях камеры были снижены по мере увеличения порога обнаружения.Существенной разницы в концентрациях частиц между отфильтрованными и нефильтрованными образцами обнаружено не было. При комбинированных порогах обнаружения, когда уровень камеры увеличивался с 12 до 14, отмечалось уменьшение среднего и размеров частиц режима отфильтрованных образцов. Концентрации частиц при комбинированных порогах обнаружения увеличились по мере увеличения уровней камеры с 12 до 14.Существенных различий между отфильтрованными и нефильтрованными образцами не наблюдалось. Шаги с 4.1 по 5.2 важны для поиска правильной области просмотра. Достижение последовательных результатов в ходе нескольких пробных запусков зависит от этого повторяемого навыка.Динамическое рассеяние света часто используется в качестве компаньона к анализу отслеживания наночастиц в первую очередь для получения дзета-потенциала, который является поверхностным зарядом частиц. Для анализа наночастиц NTA продолжает оставаться очень ценным методом количественной оценки частиц, полезным для исследования внеклеточных пузырьков.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Дизайн Циклические биореактора давление для Ex Vivo Изучение аортального клапанов сердца

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Оценка Полимерные доставки генов наночастиц наночастиц Анализ отслеживания и высокой пропускной проточной цитометрии

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions

Роман трехмерного течения палаты по изучению устройства хемокинами направлены Экстравазация клеток, циркулирующих в физиологических условиях потока

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell ...

Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

Продольная Измерение внеклеточного матрикса жесткости в 3D Опухолевые модели с помощью частиц отслеживания микрореология

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and ...

Quantification and Size-profiling of Extracellular Vesicles Using Tunable Resistive Pulse Sensing

Количественное и размер-профилирование внеклеточной везикул с использованием перестраиваемый Резистивный Pulse Sensing

Extracellular vesicles (EVs), including &#8216;microvesicles&#8217; and &#8216;exosomes&#8217;, are highly abundant in bodily fluids. Recent years have ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

3D Орбитальная слежения в модифицированной двухфотонного микроскопа: Приложение к отслеживая внутриклеточного везикулы

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Paper-based Devices for Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles

Бумажные основе Приборы для выделения и характеристики внеклеточной пузырьков

Extracellular vesicles (EVs), membranous particles released from various types of cells, hold a great potential for clinical applications. They contain ...

Retroductal Nanoparticle Injection to the Murine Submandibular Gland

Инъекции Retroductal наночастиц в мышиных подчелюстной железы

Two common goals of salivary gland therapeutics are prevention and cure of tissue dysfunction following either autoimmune or radiation injury. By locally ...

Evaluation of the Storage Stability of Extracellular Vesicles

Оценка стабильности хранения внеклеточного везикулы

Extracellular vesicles (EVs) are promising targets in current research, to be used as drugs, drug-carriers, and biomarkers. For their clinical ...

In Vivo Two-Color 2-Photon Imaging of Genetically-Tagged Reporter Cells in the Skin

В Vivo Двухцветные 2-фотон-изображения генетически-tagged репортер ателье клетки в коже

Fibroblasts are mesenchymal cells that change their morphology upon activation, ultimately influencing the microenvironment of the tissue they are located ...