Name: improving reproducibility to meet minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 guidelines in nanoparticle tracking analysis
Uploaded: 2021-11-17T13:00:00
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El trabajo fue apoyado por el estado de Kansas al Instituto del Medio Oeste para la Biología Comparada de Células Madre (MICSCB), el Centro de Investigación del Cáncer Johnson a MLW y NIH R21AG066488 a LKC. OLS recibió el apoyo gra del MICSCB. Los autores agradecen al Dr. Santosh Aryal por proporcionar los liposomas utilizados en este proyecto y a los miembros de los laboratorios Weiss y Christenson por conversaciones y comentarios útiles. Se agradece al Dr. Hong He por su apoyo técnico. MLW agradece a Betti Goren Weiss por su apoyo y consejo.

1. Directrices generales del protocolo
<ol><li>Mantenga el microscopio en una mesa de aire o como mínimo en una mesa libre de vibraciones. Asegúrese de que las vibraciones extrañas (por ejemplo, golpes con los pies en el suelo, tocar la mesa, cierres de puertas, tráfico de laboratorio) se mantengan al mínimo.</li>
	<li>Ajuste y mantenga la temperatura del módulo láser a una temperatura constante para todas las grabaciones de video. NOTA: La temperatura elegida fue de 25 °C porque el analizad...

<ol>
	<li>Lotvall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+experimental+requirements+for+definition+of+extracellular+vesicles+and+their+functions:+a+position+statement+from+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles.">Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).</li><li>Thery, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Consortium, E. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EV-TRACK:+transparent+reporting+and+centralizing+knowledge+in+extracellular+vesicle+research.">EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research.</a> Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).</li><li>Gardiner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+used+for+the+isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles:+results+of+a+worldwide+survey.">Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 5, 32945 (2016).</li><li>Maas, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possibilities+and+limitations+of+current+technologies+for+quantification+of+biological+extracellular+vesicles+and+synthetic+mimics.">Possibilities and limitations of current technologies for quantification of biological extracellular vesicles and synthetic mimics.</a> Journal of Controlled Release. 200, 87-96 (2015).</li><li>Danaei, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+particle+size+and+polydispersity+index+on+the+clinical+applications+of+lipidic+nanocarrier+systems.">Impact of particle size and polydispersity index on the clinical applications of lipidic nanocarrier systems.</a> Pharmaceutics. 10 (2), 57 (2018).</li><li>Kestens, V., Bozatzidis, V., De Temmerman, P. J., Ramaye, Y., Roebben, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+particle+tracking+analysis+method+for+the+size+determination+of+nano-+and+microparticles.">Validation of a particle tracking analysis method for the size determination of nano- and microparticles.</a> Journal of Nanoparticle Research. 19 (8), 271 (2017).</li><li>Filipe, V., Hawe, A., Jiskoot, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+evaluation+of+nanoparticle+tracking+analysis+(NTA)+by+NanoSight+for+the+measurement+of+nanoparticles+and+protein+aggregates.">Critical evaluation of nanoparticle tracking analysis (NTA) by NanoSight for the measurement of nanoparticles and protein aggregates.</a> Pharmaceutical Research. 27 (5), 796-810 (2010).</li><li>Hole, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interlaboratory+comparison+of+size+measurements+on+nanoparticles+using+nanoparticle+tracking+analysis+(NTA).">Interlaboratory comparison of size measurements on nanoparticles using nanoparticle tracking analysis (NTA).</a> Journal of Nanoparticle Research. 15 (12), 2101 (2013).</li><li>Malvern analytical Ltd. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NanoSight LM10 Operating Manual-P550H. , (2013).</li><li>Kim, A., Ng, W. B., Bernt, W., Cho, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+size+estimation+of+nanoparticle+tracking+analysis+on+polydisperse+macromolecule+assembly.">Validation of size estimation of nanoparticle tracking analysis on polydisperse macromolecule assembly.</a> Scientific Reports. 9 (1), 2639 (2019).</li><li>Gollwitzer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+techniques+for+size+measurement+of+nanoparticles+in+cell+culture+medium.">A comparison of techniques for size measurement of nanoparticles in cell culture medium.</a> Analytical Methods. 8 (26), 5272-5282 (2016).</li><li>vander Pol, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+size+distribution+of+exosomes+and+microvesicles+determined+by+transmission+electron+microscopy,+flow+cytometry,+nanoparticle+tracking+analysis,+and+resistive+pulse+sensing.">Particle size distribution of exosomes and microvesicles determined by transmission electron microscopy, flow cytometry, nanoparticle tracking analysis, and resistive pulse sensing.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (7), 1182-1192 (2014).</li></ol>

Existen varios métodos disponibles para estimar el tamaño y la concentración de nanopartículas11. Estos incluyen métodos de conjunto que generan una estimación del tamaño de una población, incluida la dispersión dinámica de la luz (DLS), la sedimentación centrífuga y el análisis a nivel de partícula única: microscopía electrónica, NTA, microscopía de fuerza atómica y detección de pulso resistivo sintonizable. De estos, DLS y NTA son métodos de medición de tamaño y concentrac...

El análisis preciso y repetible de vehículos eléctricos y otras partículas a escala nanométrica presenta numerosos desafíos en toda la investigación y la industria. La replicación de la investigación ev ha sido difícil, en parte, debido a la falta de uniformidad en el informe de los parámetros necesarios asociados con la recopilación de datos. Para abordar estas deficiencias, el ISEV propuso pautas de la industria como un conjunto mínimo de estándares bioquímicos, biofísicos y funcionales para los investigadores de vehículos eléctricos y los publicó como una declaración de posición, comúnmente conocida como MISEV20141. El ritmo acelerado de la investigación de vehículos eléctricos requirió una guía actualizada, y la "MISEV2018: una declaración de posición del ISEV" amplió las directrices MISEV20142. El documento MISEV2018 incluyó tablas, esquemas de protocolos sugeridos y pasos a seguir para documentar la caracterización específica asociada a EV. Como medida adicional para facilitar la interpretación y replicación de los experimentos, EV-TRACK se desarrolló como una base de conocimientos de crowdsourcing (http://evtrack.org) para permitir informes más transparentes de la biología de ev y la metodología utilizada para los resultados publicados3. A pesar de estas recomendaciones para la presentación de informes estandarizados de métodos, el campo continúa sufriendo con respecto a la replicación y confirmación de los resultados publicados.
Encajando con el esfuerzo de los Institutos Nacionales de Salud y la Fundación Nacional de Ciencias por las herramientas de evaluación de la calidad, este documento sugiere que ISEV requiere informes estandarizados de métodos y detalles para que las herramientas de evaluación de datos puedan aplicarse con el objetivo de replicar los resultados entre laboratorios. El informe de las fuentes celulares, los procedimientos de cultivo celular y los métodos de aislamiento de EV son factores importantes para definir las cualidades de la población de EV. Entre los instrumentos de NTA, factores como la configuración de detección, el índice de refracción del fluido portador, las poblaciones de partículas heterogéneas que contribuyen a la polidispersidad, la falta de requisitos de informes estandarizados y la ausencia de resultados de medición intra e interobservadores hacen que la comparación de NTA entre laboratorios sea difícil o imposible.
En uso desde 2006, NTA es un método popular para la determinación del tamaño y la concentración de nanopartículas que actualmente es utilizado por aproximadamente el 80% de los investigadores de EV4. Las Directrices MISEV2018 requieren dos formas de análisis de una sola vesícula, de las cuales NTA es una de las opciones populares. NTA sigue siendo de uso común para la caracterización de EV debido a su amplia accesibilidad, bajo costo por muestra y su teoría fundacional directa (la ecuación de Stokes-Einstein). La evaluación de EV por NTA genera una distribución del tamaño de partícula y una estimación de concentración utilizando la dispersión de luz láser y el análisis de movimiento browniano, con el límite inferior de detección determinado por el índice de refracción del EV. Cuando se utiliza una muestra de fluido de viscosidad y temperatura conocidas, se rastrean las trayectorias de los evs para determinar su desplazamiento cuadrático medio en dos dimensiones. Esto permite calcular el coeficiente de difusión de partículas y convertirlo en un diámetro hidrodinámico equivalente a una esfera mediante una ecuación de Stokes-Einstein modificada 5,6,7. El análisis de partícula a partícula de NTA tiene menos interferencia por aglomerados o partículas más grandes en una población heterogénea de EV que otros métodos de caracterización7. Mientras que unas pocas partículas más grandes tienen un impacto mínimo en la precisión del tamaño, la presencia de cantidades incluso diminutas de partículas grandes y de alta dispersión de la luz da como resultado una reducción notable en la detección de partículas más pequeñas debido a la reducción de la detección y el seguimiento de EVpor software 8. Como técnica de medición, generalmente se considera que el NTA no está sesgado hacia partículas más grandes o agregados de partículas, pero puede resolver poblaciones de múltiples tamaños a través del análisis de partículas individuales9. Debido al uso de la dispersión de la luz por partículas, una de las limitaciones del análisis NTA es que cualquier partícula como polvo, plástico o polvo con atributos de refracción y tamaño similares en comparación con los EV no se puede diferenciar de los EV reales por este método de caracterización.
El NanoSight LM10 (analizador de tamaño de nanopartículas) y LM14 (módulo láser) se han vendido desde 2006, y aunque se han desarrollado modelos más nuevos de este instrumento, este modelo en particular se encuentra en muchas instalaciones centrales y se considera un caballo de batalla confiable. Se necesita capacitación para optimizar adecuadamente la configuración de NTA para mediciones de alta resolución de tamaño y concentración. Los dos ajustes importantes necesarios para una grabación de vídeo óptima son (1) el nivel de la cámara y (2) el umbral de detección. Estos deben ser establecidos por el operador en función de las características de la muestra. Una de las principales limitaciones del análisis NTA es la recomendación de concentraciones de muestra entre 107 y 109 partículas/ml, para lograr esta dilución de la muestra puede ser necesaria10. Las soluciones utilizadas para la dilución, como la solución salina tamponada con fosfato, la solución salina de 0,15 M o el agua ultrapura, rara vez están libres de partículas de menos de 220 μm de tamaño, lo que puede afectar las mediciones de NTA. La caracterización NTA de las soluciones utilizadas para la dilución debe realizarse al mismo nivel de cámara y umbral de detección que las muestras de nanopartículas que se están analizando. El tamaño y la concentración de nanopartículas presentes en los diluyentes utilizados para las diluciones de muestras de EV rara vez se incluyen en publicaciones que involucran el análisis NTA de EV.
Este protocolo utiliza el análisis NTA de liposomas sintéticos similares a EV evaluados utilizando niveles de cámara seleccionados, umbrales de detección y filtrado mecánico de las muestras para analizar los efectos sistemáticos del nivel de la cámara, el umbral de detección o la filtración de muestras en el conjunto de datos NTA. Los liposomas se sintetizaron como se describe en el Archivo Suplementario S1. Los liposomas sintéticos se utilizaron en este experimento debido a su uniformidad de tamaño, características físicas y estabilidad en el almacenamiento a 4 ° C. Aunque se podrían haber utilizado muestras reales de EV, la heterogenicidad y estabilidad de los EV durante el almacenamiento pueden haber complicado este estudio y su interpretación. Las similitudes en los informes de NTA de (A) liposomas y (B) EV indican que los efectos sistemáticos revelados para los liposomas en este documento probablemente también se aplicarán a la caracterización de EV (Figura 1). Juntos, estos hallazgos respaldan la noción de que el informe completo de la configuración crítica del software y la descripción del procesamiento de muestras, como el diluyente, la dilución y la filtración, afectan la reproducibilidad de los datos de NTA.
El propósito de este trabajo es demostrar que la variación de los ajustes de NTA (temperatura, nivel de cámara y umbral de detección) y la preparación de la muestra cambia los resultados recogidos: se obtuvieron diferencias sistemáticas y significativas en tamaño y concentración. Como NTA es una de las opciones populares para cumplir con la especificación de caracterización MISEV2018, estos resultados demuestran la importancia de informar la preparación de muestras y la configuración de NTA para garantizar la reproducibilidad.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63059/63059fig01.jpg"> Figura 1: Informes representativos de NTA para comparar liposomas con EV. (A) Liposomas: muestra sin filtrar caracterizada en NTA el 12 de marzo de 2020. (B) EV: muestra sin filtrar caracterizada en NTA el 26 de agosto de 2021. Abreviaturas: NTA = Análisis de seguimiento de nanopartículas; EV = vesículas extracelulares. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63059/63059fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Automatic Pipetter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes, Conical, Nunc 15 mL</td>
			<td>Thermo Sci.</td>
			<td>339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens Cleaner</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens Paper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight LM-10</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight LM-14 Laser Module</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosight NTA Software Ver. 3.2</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper Towels</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips, 1-200 &#181;L, Filtered, Sterile, Low Binding</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>P -3243-200X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips, 50-1,000 &#181;L, Filtered, Sterile</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>P-3243-1250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline, Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered (No Ca or Mg)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standards, Latex Transfer- 100 nm (3 mL)</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>NTA4088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standards, Latex Transfer- 50 nm&#160; (3 mL)</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>NTA4087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter, 33 mm, .22 &#181;m, MCE, Sterile</td>
			<td>Fisher brand</td>
			<td>09-720-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, TB, 1 mL, slip tip</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waste fluid container</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improving reproducibility to meet minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 guidelines in nanoparticle tracking analysis

El análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) ha sido uno de los varios métodos de caracterización utilizados para la investigación de vesículas extracelulares (EV) desde 2006. Muchos consideran que los instrumentos NTA y sus paquetes de software se pueden utilizar fácilmente después de una capacitación mínima y que la calibración del tamaño es factible internamente. Como tanto la adquisición de NTA como el análisis de software constituyen la caracterización de EV, se abordan en Información mínima para estudios de vesículas extracelulares 2018 (MISEV2018). Además, han sido monitoreados por Transparent Reporting y Centralizing Knowledge in Extracellular Vesicle Research (EV-TRACK) para mejorar la robustez de los experimentos ev (por ejemplo, minimizar la variación experimental debido a factores no controlados).
A pesar de los esfuerzos para fomentar el informe de métodos y controles, muchos trabajos de investigación publicados no informan los entornos críticos necesarios para reproducir las observaciones originales de NTA. Pocos artículos informan de la caracterización NTA de controles o diluyentes negativos, asumiendo evidentemente que los productos disponibles comercialmente, como la solución salina tamponada con fosfato o el agua destilada ultrapura, están libres de partículas. Del mismo modo, los controles positivos o los estándares de tamaño rara vez son reportados por los investigadores para verificar el tamaño de las partículas. La ecuación de Stokes-Einstein incorpora variables de viscosidad y temperatura de la muestra para determinar el desplazamiento de partículas. Informar de la temperatura estable de la cámara láser durante toda la recolección de video de muestra es, por lo tanto, una medida de control esencial para una replicación precisa. La filtración de muestras o diluyentes tampoco se informa rutinariamente, y si es así, rara vez se incluyen los detalles del filtro (fabricante, material de membrana, tamaño de poro) y las condiciones de almacenamiento. Los estándares mínimos de detalle experimental aceptable de la Sociedad Internacional de Vesículas Extracelulares (ISEV) deben incluir un protocolo NTA bien documentado para la caracterización de EV. El siguiente experimento proporciona evidencia de que el investigador individual debe establecer un protocolo de análisis NTA e incluirlo en los métodos de publicaciones que utilizan la caracterización NTA como una de las opciones para cumplir con los requisitos MISEV2018 para la caracterización de una sola vesícula.

La Tabla 1 contiene los resultados de los videos NTA para las muestras de liposomas (18 filtradas y 18 sin filtrar) y un diluyente DPBS representativo. Las comparaciones entre los dos grupos se completaron independientemente del nivel de la cámara o el umbral de detección en este documento. Las muestras filtradas tenían un diámetro medio de partículas de 108,5 nm, un modo de partículas de 86,2 nm y una concentración de 7,4 × 108 partículas/ml. Por el contrario, las muestras sin filtra...

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Improving Reproducibility to Meet Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 Guidelines in Nanoparticle Tracking Analysis

El análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) es un método ampliamente utilizado para caracterizar vesículas extracelulares. Este artículo destaca los parámetros y controles experimentales de NTA, además de un método uniforme de análisis y caracterización de muestras y diluyentes necesarios para complementar las pautas propuestas por MISEV2018 y EV-TRACK para la reproducibilidad entre laboratorios.

Mejorar la reproducibilidad para cumplir con la información mínima para estudios de vesículas extracelulares 2018 Directrices en el análisis de seguimiento de nanopartículas

Nanoparticle tracking analysis (NTA) has been one of several characterization methods used for extracellular vesicle (EV) research since 2006. Many ...

Este protocolo fue desarrollado para operadores novatos del NanoSight LM10. Siguiendo las instrucciones paso a paso, se pueden obtener resultados precisos y reproducibles. Esta técnica ayuda a garantizar resultados consistentes en múltiples ejecuciones de prueba, independientemente del nivel de habilidad del usuario.La caracterización de nanopartículas, especialmente la cuantificación, sigue siendo un desafío en el campo de la investigación de vesículas extracelulares. Este protocolo permite un análisis consistente de tamaño y concentración de nanopartículas en suspensión. Comience por limpiar las superficies de vidrio del módulo láser con un limpiador de lentes de buena calidad y papel de lente.Antes del montaje del módulo, asegúrese de que el sello de la junta tórica esté correctamente asentado en la ranura de la cubierta de la celda de flujo. Luego coloque la cubierta de la celda de flujo en el módulo láser, asegurándose de que los contactos eléctricos estén en la orientación adecuada. A continuación, coloque los cuatro tornillos de pulgar cargados por resorte a través de la placa de la celda de flujo y enganche las roscas del módulo láser sin apretar individualmente.Mientras ejerce una presión uniforme sobre la cubierta de la celda de flujo, apriete uniformemente los tornillos del pulgar de manera diagonal alterna hasta que se ajusten. Enjuague dos jeringas de tuberculina de un mililitro con adaptadores de bloqueo deslizante tres veces con un mililitro de DPBS. Retire y deseche el émbolo de la primera jeringa de tuberculina antes de insertar la jeringa en el puerto restante para que sirva como diluyente vacío o depósito de muestra.A continuación, llene la segunda jeringa con un mililitro de DPBS y conéctela al puerto de entrada de la cubierta de la celda de flujo. Mantenga el módulo láser inclinado con el puerto de la jeringa de salida elevado para permitir que el aire se purgue de la cámara a medida que el DPBS se inyecta lentamente en el módulo láser. Enjuague el DPBS restante del módulo láser inyectando un mililitro de aire en el puerto de entrada.Repita el enjuague dos veces. Después del último lavado, vacíe el módulo láser lo más completamente posible y cargue el módulo para enfocar y posicionar. Abra el software.Debajo de la pestaña de captura en el cuadro de la esquina superior izquierda, haga clic en Iniciar cámara. Si la cámara se apaga automáticamente después de cinco minutos, haga clic en Iniciar cámara para reiniciarla. En la misma pestaña, ajuste el nivel de la cámara a 14 a 16 para iluminar la línea láser y simplificar la identificación y el enfoque de partículas.Al mover el control deslizante superior en el lado izquierdo de la pieza principal hacia adentro o hacia afuera, desvíe la imagen de la cámara a los oculares. En el campo de visión, busque el área de mayor densidad, conocida como huella digital y centro, y enfoque la huella digital verticalmente. En el campo de visión, centre la línea láser y, a continuación, mueva el control deslizante superior para desviar la luz hacia la cámara como se observa en la pantalla de la computadora.La imagen en la pantalla de la computadora es una imagen especular de la vista en los oculares del microscopio. Ajuste el enfoque para enfocar la imagen de partículas individuales en movimiento en la pantalla con la perilla de enfoque. Para cargar las muestras, extraiga un mililitro de la muestra en una jeringa de tuberculina de un mililitro enjuagada y conecte la jeringa al puerto de entrada de la cubierta de la celda de flujo.Siga avanzando el émbolo hasta que el líquido sea evidente en la jeringa abierta unida al puerto de salida. El módulo debe estar inclinado para permitir que el aire se purgue del módulo láser. En la vista de la cámara, mueva el enfoque a la derecha de la línea láser a un área de un número uniforme de partículas.Ajuste la orientación vertical para centrar las bandas horizontales de luz y vuelva a enfocar hasta que el mayor número de partículas esté a la vista. Asegúrese de mantener la posición del enfoque consistente para todas las medidas posteriores. Ajuste el nivel de la cámara hasta el punto de que el símbolo de información oscura parpadee intermitentemente en la parte superior derecha de la vista de la cámara.Para el análisis de seguimiento de nanopartículas, o NTA, establezca la duración en 30 o 60 segundos y el número de videos en cinco. Para cambiar el nombre de archivo base existente, haga clic en la ficha de un nuevo sitio de almacenamiento para los datos generados con un nuevo nombre de archivo. Luego marque la casilla de temperatura objetivo para ingresar la temperatura deseada y haga clic en crear script para reutilizar la medición estándar.Una vez que se cargue el ejemplo y el experimento esté listo para ejecutarse, haga clic en crear y ejecutar script. En la pantalla emergente detalles del informe establecido, complete los campos con la información necesaria sobre el operador, la muestra y el diluyente. Cuando se hayan rellenado todos los campos deseados, haga clic en Configuración aceptar para iniciar el script.Antes de cada captura de video, busque un mensaje para avanzar el émbolo manualmente. Inyecte aproximadamente 0,05 mililitros de la muestra en la cámara láser. A medida que las partículas se descansen, haga clic en Aceptar. Al completar la quinta captura de video, aparecerá un cuadro de confirmación de configuración junto con el cuadro de proceso.Como los fotogramas se avanzan manualmente desde la parte inferior de la pantalla de video, observe el número de cruces azules que forman partículas en la pantalla y establezca el umbral de detección para el procesamiento de la muestra. Espere a que los videos se procesen automáticamente en un histograma de resultados antes de que se muestre una notificación de finalización en el cuadro de diálogo, luego presione Aceptar. Después de que aparezca el cuadro de configuración de exportación, guarde los resultados haciendo clic en exportar. Resalte los cinco videos de captura enumerados en el experimento actual.A continuación, haga clic en procesar archivos seleccionados y espere a que aparezca el cuadro de confirmación de configuración en el cuadro de proceso para parpadear para cambiar el umbral de detección, luego ajuste el umbral de detección al nivel deseado y vaya a configuración y haga clic en Aceptar. Los videos se procesarán automáticamente en un histograma de resultados y se mostrará una notificación de finalización en un cuadro de diálogo. Haga clic OK.In el análisis representativo, se muestran los resultados del análisis de nanoseguimiento, o NTA, para las muestras de liposomas y un diluyente DPBS representativo. Las muestras filtradas tenían un diámetro medio de partículas de 108 nanómetros y una concentración de 7,4 veces 10 a las octavas partículas por mililitro.En contraste, las muestras sin filtrar tenían un diámetro medio de partículas de 159 nanómetros y una concentración de 7,6 veces 10 a las octavas partículas por mililitro. A niveles de cámara combinados, a medida que el umbral de detección se incrementó de dos a cinco, el tamaño de partícula medio y de modo mostró una disminución significativa en el tamaño de partícula de las muestras filtradas. Las concentraciones de partículas a niveles de cámara combinados disminuyeron a medida que aumentaba el umbral de detección.No se detectaron diferencias significativas en las concentraciones de partículas entre las muestras filtradas y no filtradas. En los umbrales de detección combinados, a medida que el nivel de la cámara aumentó de 12 a 14, se observó una disminución en el tamaño de partícula medio y de modo de las muestras filtradas. Las concentraciones de partículas en los umbrales de detección combinados aumentaron a medida que los niveles de la cámara aumentaron de 12 a 14.No se observaron diferencias significativas entre las muestras filtradas y no filtradas. Los pasos 4.1 a 5.2 son importantes para encontrar el área de visualización correcta. Lograr resultados consistentes en múltiples ejecuciones de prueba depende de esta habilidad repetible.La dispersión dinámica de la luz se utiliza a menudo como un compañero para el análisis de seguimiento de nanopartículas principalmente para obtener el potencial zeta, que es la carga superficial de las partículas. Para el análisis de nanopartículas, el NTA sigue siendo un método muy valioso de cuantificación de partículas útil para la investigación de vesículas extracelulares.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Investigación

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Extracellular vesicles (EVs), including &#8216;microvesicles&#8217; and &#8216;exosomes&#8217;, are highly abundant in bodily fluids. Recent years have ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

Rastreo Orbital 3D en un microscopio de dos fotones Modificado: una aplicación para el Seguimiento de vesículas intracelulares

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Paper-based Devices for Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles

Dispositivos basados ​​en papel para aislamiento y caracterización de extracelular vesículas

Extracellular vesicles (EVs), membranous particles released from various types of cells, hold a great potential for clinical applications. They contain ...

Retroductal Nanoparticle Injection to the Murine Submandibular Gland

Inyección de nanopartículas de Retroductal a la glándula submaxilar de ratón

Two common goals of salivary gland therapeutics are prevention and cure of tissue dysfunction following either autoimmune or radiation injury. By locally ...

Evaluation of the Storage Stability of Extracellular Vesicles

Evaluación de la estabilidad del almacenamiento de vesículas extracelulares

Extracellular vesicles (EVs) are promising targets in current research, to be used as drugs, drug-carriers, and biomarkers. For their clinical ...

In Vivo Two-Color 2-Photon Imaging of Genetically-Tagged Reporter Cells in the Skin

In Vivo 2-Color 2-Photon Imaging of Genetically-Tagged Reporter Cells in the Skin

Fibroblasts are mesenchymal cells that change their morphology upon activation, ultimately influencing the microenvironment of the tissue they are located ...