Name: improving reproducibility to meet minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 guidelines in nanoparticle tracking analysis
Uploaded: 2021-11-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Improving Reproducibility to Meet Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 Guidelines in Nanoparticle Tracking Analysis at JoVE.com

Arbetet stöddes av delstaten Kansas till Midwest Institute for Comparative Stem Cell Biology (MICSCB), Johnson Cancer Research Center till MLW och NIH R21AG066488 till LKC. OLS fick GRA-stöd från MICSCB. Författarna tackar Dr. Santosh Aryal för att ha tillhandahållit liposomerna som används i detta projekt och medlemmarna i Weiss och Christenson-laboratorierna för hjälpsamma samtal och feedback. Dr. Hong Han tackas för teknisk support. MLW tackar Betti Goren Weiss för hennes stöd och råd.

1. Allmänna riktlinjer för protokollet
<ol><li>Håll mikroskopet på ett luftbord eller åtminstone på ett vibrationsfritt bord. Se till att externa vibrationer (t.ex. fotknackning på golvet, beröring av bordet, dörrstängningar, laboratorietrafik) hålls till ett minimum.</li>
	<li>Ställ in och behåll lasermodulens temperatur vid en konstant temperatur för alla videoinspelningar. OBS: Den valda temperaturen var 25 ° C eftersom nanopartikelstorleksanalysatorn kalibrerades vid den temperatu...

<ol>
	<li>Lotvall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+experimental+requirements+for+definition+of+extracellular+vesicles+and+their+functions:+a+position+statement+from+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles.">Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).</li><li>Thery, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Consortium, E. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EV-TRACK:+transparent+reporting+and+centralizing+knowledge+in+extracellular+vesicle+research.">EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research.</a> Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).</li><li>Gardiner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+used+for+the+isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles:+results+of+a+worldwide+survey.">Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 5, 32945 (2016).</li><li>Maas, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possibilities+and+limitations+of+current+technologies+for+quantification+of+biological+extracellular+vesicles+and+synthetic+mimics.">Possibilities and limitations of current technologies for quantification of biological extracellular vesicles and synthetic mimics.</a> Journal of Controlled Release. 200, 87-96 (2015).</li><li>Danaei, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+particle+size+and+polydispersity+index+on+the+clinical+applications+of+lipidic+nanocarrier+systems.">Impact of particle size and polydispersity index on the clinical applications of lipidic nanocarrier systems.</a> Pharmaceutics. 10 (2), 57 (2018).</li><li>Kestens, V., Bozatzidis, V., De Temmerman, P. J., Ramaye, Y., Roebben, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+particle+tracking+analysis+method+for+the+size+determination+of+nano-+and+microparticles.">Validation of a particle tracking analysis method for the size determination of nano- and microparticles.</a> Journal of Nanoparticle Research. 19 (8), 271 (2017).</li><li>Filipe, V., Hawe, A., Jiskoot, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+evaluation+of+nanoparticle+tracking+analysis+(NTA)+by+NanoSight+for+the+measurement+of+nanoparticles+and+protein+aggregates.">Critical evaluation of nanoparticle tracking analysis (NTA) by NanoSight for the measurement of nanoparticles and protein aggregates.</a> Pharmaceutical Research. 27 (5), 796-810 (2010).</li><li>Hole, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interlaboratory+comparison+of+size+measurements+on+nanoparticles+using+nanoparticle+tracking+analysis+(NTA).">Interlaboratory comparison of size measurements on nanoparticles using nanoparticle tracking analysis (NTA).</a> Journal of Nanoparticle Research. 15 (12), 2101 (2013).</li><li>Malvern analytical Ltd. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NanoSight LM10 Operating Manual-P550H. , (2013).</li><li>Kim, A., Ng, W. B., Bernt, W., Cho, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+size+estimation+of+nanoparticle+tracking+analysis+on+polydisperse+macromolecule+assembly.">Validation of size estimation of nanoparticle tracking analysis on polydisperse macromolecule assembly.</a> Scientific Reports. 9 (1), 2639 (2019).</li><li>Gollwitzer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+techniques+for+size+measurement+of+nanoparticles+in+cell+culture+medium.">A comparison of techniques for size measurement of nanoparticles in cell culture medium.</a> Analytical Methods. 8 (26), 5272-5282 (2016).</li><li>vander Pol, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+size+distribution+of+exosomes+and+microvesicles+determined+by+transmission+electron+microscopy,+flow+cytometry,+nanoparticle+tracking+analysis,+and+resistive+pulse+sensing.">Particle size distribution of exosomes and microvesicles determined by transmission electron microscopy, flow cytometry, nanoparticle tracking analysis, and resistive pulse sensing.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (7), 1182-1192 (2014).</li></ol>

Det finns flera metoder tillgängliga för att uppskatta storleken och koncentrationen av nanopartiklar11. Dessa inkluderar ensemblemetoder som genererar en storleksuppskattning från en population, inklusive dynamisk ljusspridning (DLS), centrifugalsedimentering och enpartikelnivåanalys-elektronmikroskopi, NTA, atomkraftsmikroskopi och avstämbar resistiv pulsavkänning. Av dessa används DLS och NTA i stor utsträckning, icke-destruktiva storleks- och koncentrationsmätningsmetoder, baserade p?...

Noggrann och repeterbar analys av elbilar och andra partiklar i nanometerskala utgör många utmaningar inom forskning och industri. Replikering av EV-forskning har varit svårt, delvis på grund av bristen på enhetlighet i rapporteringen av nödvändiga parametrar i samband med datainsamling. För att ta itu med dessa brister föreslog ISEV branschriktlinjer som en minimal uppsättning biokemiska, biofysiska och funktionella standarder för EV-forskare och publicerade dem som ett ställningstagande, vanligen kallat MISEV20141. Den accelererande takten i EV-forskningen krävde en uppdaterad riktlinje, och "MISEV2018: a position statement of the ISEV" utvidgade MISEV2014-riktlinjerna2. MISEV2018-papperet innehöll tabeller, konturer av föreslagna protokoll och steg att följa för att dokumentera specifik EV-associerad karakterisering. Som en ytterligare åtgärd för att underlätta tolkning och replikering av experiment utvecklades EV-TRACK som en crowdsourcing-kunskapsbas (http://evtrack.org) för att möjliggöra en mer transparent rapportering av EV-biologi och den metod som används för publicerade resultat3. Trots dessa rekommendationer för standardiserad rapportering av metoder fortsätter fältet att lida när det gäller replikering och bekräftelse av publicerade resultat.
I överensstämmelse med National Institutes of Healths och National Science Foundations ansträngningar för kvalitetsbedömningsverktyg, föreslår detta dokument att ISEV kräver standardiserad rapportering av metoder och detaljer så att databedömningsverktyg kan tillämpas med målet att replikera resultat mellan laboratorier. Rapportering av cellkällor, cellodlingsförfaranden och EV-isoleringsmetoder är viktiga faktorer för att definiera EV-populationens egenskaper. Bland NTA-instrument gör faktorer som detektionsinställningar, brytningsindex för bärarvätska, heterogena partikelpopulationer som bidrar till polydispersitet, brist på standardiserade rapporteringskrav och frånvarande mätresultat inom och mellan observatörer NTA-jämförelse mellan laboratorier svår eller omöjlig.
NTA har använts sedan 2006 och är en populär metod för nanopartikelstorlek och koncentrationsbestämning som för närvarande används av cirka 80% av EV-forskarna4. MISEV2018-riktlinjerna kräver två former av en-vesiklaranalys, varav NTA är ett av de populära alternativen. NTA fortsätter att vara i allmänt bruk för EV-karakterisering på grund av dess breda tillgänglighet, låga kostnad per prov och dess enkla grundteori (Stokes-Einstein-ekvationen). EV-bedömning av NTA genererar en partikelstorleksfördelning och koncentrationsuppskattning med hjälp av laserljusspridning och brunisk rörelseanalys, med den nedre detektionsgränsen bestämd av EV: s brytningsindex. Vid användning av ett vätskeprov med känd viskositet och temperatur spåras EV: s banor för att bestämma deras genomsnittliga kvadratiska förskjutning i två dimensioner. Detta gör att partikeldiffusionskoefficienten kan beräknas och omvandlas till en sfärekvivalent hydrodynamisk diameter med en modifierad Stokes-Einstein-ekvation 5,6,7. NTA:s partikel-till-partikelanalys har mindre interferens av agglomerat eller större partiklar i en heterogen population av elbilar än andra karakteriseringsmetoder7. Medan några större partiklar har minimal inverkan på storleksnoggrannheten, resulterar närvaron av jämna små mängder stora, höga ljusspridningspartiklar i en anmärkningsvärd minskning av detekteringen av mindre partiklar på grund av minskad programvara EV-detektering och spårning8. Som mätteknik anses NTA i allmänhet inte vara partisk mot större partiklar eller aggregat av partiklar utan kan lösa populationer av flera storlekar genom individuell partikelanalys9. På grund av användningen av ljusspridning av partiklar är en av begränsningarna med NTA-analys att alla partiklar som damm, plast eller pulver med liknande brytnings- och storleksattribut jämfört med elbilar inte kan särskiljas från faktiska elbilar med denna karakteriseringsmetod.
NanoSight LM10 (nanopartikelstorleksanalysator) och LM14 (lasermodul) har sålts sedan 2006, och även om nyare modeller av detta instrument har utvecklats, finns just denna modell i många kärnanläggningar och anses vara en pålitlig arbetshäst. Utbildning behövs för att korrekt optimera NTA-inställningarna för högupplösta mätningar av storlek och koncentration. De två viktiga inställningar som behövs för optimala videoinspelningar är (1) kameranivån och (2) detekteringströskeln. Dessa måste fastställas av operatören på grundval av provets egenskaper. En av de största begränsningarna med NTA-analys är rekommendationen av provkoncentrationer mellan 107 och 109 partiklar/ml, för att uppnå detta kan provutspädning krävas10. Lösningar som används för utspädning, såsom fosfatbuffrad saltlösning, 0,15 M saltlösning eller ultrarent vatten, är sällan fria från partiklar som är mindre än 220 μm stora, vilket kan påverka NTA-mätningarna. NTA-karakterisering av de lösningar som används för utspädning bör utföras på samma kameranivå och detektionströskel som de nanopartikelprover som analyseras. Storleken och koncentrationen av nanopartiklar som finns i utspädningsmedel som används för ev-provutspädningar ingår sällan i publikationer som involverar NTA-analys av elfordon.
Detta protokoll använder NTA-analys av syntetiska EV-liknande liposomer utvärderade med hjälp av utvalda kameranivåer, detektionströsklar och mekanisk filtrering av proverna för att analysera de systematiska effekterna av kameranivå, detektionströskel eller provfiltrering på NTA-datasetet. Liposomer syntetiserades enligt beskrivningen i tilläggsfil S1. Syntetiska liposomer användes i detta experiment på grund av deras storleksenhetlighet, fysiska egenskaper och stabilitet vid lagring vid 4 ° C. Även om faktiska prover av elbilar kunde ha använts, kan heterogeniteten och stabiliteten hos elbilar under lagring ha komplicerat denna studie och dess tolkning. Likheter i NTA-rapporterna från (A) liposomer och (B) EVs indikerar att de systematiska effekterna som avslöjas för liposomer i detta papper sannolikt också kommer att gälla för EV-karakterisering (Figur 1). Tillsammans stöder dessa resultat uppfattningen att fullständig rapportering av kritiska programvaruinställningar och beskrivningen av provbehandling, såsom utspädningsmedel, utspädning och filtrering, påverkar reproducerbarheten av NTA-data.
Syftet med detta dokument är att visa att varierande NTA-inställningar (temperatur, kameranivå och detektionströskel) och provberedning förändrar de insamlade resultaten: systematiska, signifikanta skillnader i storlek och koncentration erhölls. Eftersom NTA är ett av de populära alternativen för att uppfylla MISEV2018-karakteriseringsspecifikationen, visar dessa resultat vikten av att rapportera provberedning och NTA-inställningar för att säkerställa reproducerbarhet.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63059/63059fig01.jpg"> Figur 1: Representativa NTA-rapporter för att jämföra liposomer med elbilar. A) Liposomer: ofiltrerat prov som karakteriseras på NTA den 12 mars 2020. (B) Elfordon: ofiltrerat prov som karakteriserades på NTA den 26 augusti 2021. Förkortningar: NTA = Nanopartikelspårningsanalys; EVs = extracellulära vesiklar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63059/63059fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Automatic Pipetter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes, Conical, Nunc 15 mL</td>
			<td>Thermo Sci.</td>
			<td>339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens Cleaner</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens Paper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight LM-10</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight LM-14 Laser Module</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosight NTA Software Ver. 3.2</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper Towels</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips, 1-200 &#181;L, Filtered, Sterile, Low Binding</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>P -3243-200X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips, 50-1,000 &#181;L, Filtered, Sterile</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>P-3243-1250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline, Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered (No Ca or Mg)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standards, Latex Transfer- 100 nm (3 mL)</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>NTA4088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standards, Latex Transfer- 50 nm&#160; (3 mL)</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>NTA4087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter, 33 mm, .22 &#181;m, MCE, Sterile</td>
			<td>Fisher brand</td>
			<td>09-720-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, TB, 1 mL, slip tip</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waste fluid container</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improving reproducibility to meet minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 guidelines in nanoparticle tracking analysis

Nanopartikelspårningsanalys (NTA) har varit en av flera karakteriseringsmetoder som används för forskning om extracellulär vesikel (EV) sedan 2006. Många anser att NTA-instrument och deras mjukvarupaket enkelt kan användas efter minimal utbildning och att storlekskalibrering är möjlig internt. Eftersom både NTA-förvärv och mjukvaruanalys utgör EV-karakterisering behandlas de i Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 (MISEV2018). Dessutom har de övervakats av Transparent Reporting and Centralizing Knowledge in Extracellular Vesicle Research (EV-TRACK) för att förbättra robustheten hos EV-experiment (t.ex. minimera experimentell variation på grund av okontrollerade faktorer).
Trots ansträngningar för att uppmuntra rapportering av metoder och kontroller misslyckas många publicerade forskningsartiklar med att rapportera kritiska inställningar som behövs för att reproducera de ursprungliga NTA-observationerna. Få artiklar rapporterar NTA-karakteriseringen av negativa kontroller eller utspädningsmedel, uppenbarligen förutsatt att kommersiellt tillgängliga produkter, såsom fosfatbuffrad saltlösning eller ultrarent destillerat vatten, är partikelfria. På samma sätt rapporteras positiva kontroller eller storleksstandarder sällan av forskare för att verifiera partikelstorlek. Stokes-Einstein-ekvationen innehåller provviskositet och temperaturvariabler för att bestämma partikelförskjutning. Att rapportera den stabila laserkammartemperaturen under hela provvideoinsamlingen är därför en viktig kontrollåtgärd för korrekt replikering. Filtrering av prover eller utspädningsmedel rapporteras inte heller rutinmässigt, och i så fall ingår sällan filtrets detaljer (tillverkare, membranmaterial, porstorlek) och lagringsförhållanden. International Society for Extracellular Vesicle (ISEV) minimala standarder för acceptabla experimentella detaljer bör innehålla ett väldokumenterat NTA-protokoll för karakterisering av elbilar. Följande experiment ger bevis för att ett NTA-analysprotokoll måste upprättas av den enskilda forskaren och inkluderas i metoderna för publikationer som använder NTA-karakterisering som ett av alternativen för att uppfylla MISEV2018-kraven för enstaka vesiklarakterisering.

Tabell 1 innehåller resultaten från NTA-videorna för liposomproverna (18 filtrerade och 18 ofiltrerade) och ett representativt DPBS-utspädningsmedel. Jämförelser mellan de två grupperna slutfördes oavsett kameranivå eller detekteringströskel i detta papper. Filtrerade prover hade en genomsnittlig partikeldiameter på 108,5 nm, ett partikelläge på 86,2 nm och en koncentration på 7,4 × 108 partiklar/ml. Däremot hade ofiltrerade prover en genomsnittlig partikeldiameter på 159,1 nm...

Watch this Scientific Journal Video about Improving Reproducibility to Meet Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 Guidelines in Nanoparticle Tracking Analysis at JoVE.com

Improving Reproducibility to Meet Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 Guidelines in Nanoparticle Tracking Analysis

Nanopartikelspårningsanalys (NTA) är en allmänt använd metod för att karakterisera extracellulära vesiklar. Detta dokument belyser NTA-experimentella parametrar och kontroller plus en enhetlig metod för analys och karakterisering av prover och utspädningsmedel som är nödvändiga för att komplettera de riktlinjer som föreslås av MISEV2018 och EV-TRACK för reproducerbarhet mellan laboratorier.

Förbättra reproducerbarheten för att möta minimal information för studier av extracellulära vesiklar 2018 riktlinjer i nanopartikelspårningsanalys

Nanoparticle tracking analysis (NTA) has been one of several characterization methods used for extracellular vesicle (EV) research since 2006. Many ...

Detta protokoll utvecklades för nybörjare av NanoSight LM10. Genom att följa steg-för-steg-instruktionerna kan exakta och reproducerbara resultat erhållas. Den här tekniken hjälper till att säkerställa konsekventa resultat över flera utvärderingskörningar oavsett användarens färdighetsnivå.Nanopartikelkarakterisering, särskilt kvantifiering, fortsätter att vara en utmaning inom det extracellulära vesikelforskningsområdet. Detta protokoll möjliggör en konsekvent storleks- och koncentrationsanalys av nanopartiklar i suspension. Börja med att rengöra lasermodulens glasytor med en linsrengörare av god kvalitet och linspapper.Innan du monterar modulen, se till att O-ringtätningen sitter ordentligt i spåret på flödescellkåpan. Placera sedan flödescellkåpan på lasermodulen och se till att elektriska kontakter är i rätt riktning. Placera sedan de fyra fjäderbelastade tumskruvarna genom flödescellplattan och koppla in lasermodulens gängor utan att dra åt individuellt.Medan du sätter jämnt tryck ner på flödescellkåpan, dra åt tumskruvarna jämnt på ett alternerande diagonalt sätt tills de sitter tätt. Spola två en milliliter tuberkulinsprutor med glidlåsadaptrar tre gånger med en milliliter DPBS. Ta bort och kasta kolven från den första tuberkulinsprutan innan du sätter in sprutan i den återstående porten för att fungera som ett tömt utspädningsmedel eller provbehållare.Fyll sedan den andra sprutan med en milliliter DPBS och fäst den på inloppsporten på flödescellkåpan. Håll lasermodulen lutad med utloppssprutan förhöjd så att luft kan rensas från kammaren när DPBS injiceras långsamt i lasermodulen. Spola resterande DPBS från lasermodulen genom att injicera en milliliter luft i inloppsporten.Upprepa spolningen två gånger. Efter den sista spolningen, töm lasermodulen så fullständigt som möjligt och ladda modulen för fokusering och positionering. Öppna programvaran.Klicka på starta kamera under inspelningsfliken i det övre vänstra hörnet. Om kameran stängs av automatiskt efter fem minuter klickar du på Starta kameran för att starta om den. På samma flik justerar du kameranivån till 14 till 16 för att lysa upp laserlinjen och förenkla partikelidentifiering och fokus.Genom att flytta den övre skjutreglaget på vänster sida av huvudstycket in eller ut, avled bilden från kameran till okularen. I synfältet hittar du området med ökad densitet, kallad tumavtryck och centrum, och fokuserar tumavtrycket vertikalt. I synfältet centrerar du laserlinjen och flyttar sedan den övre skjutreglaget för att avleda ljus till kameran som observerats på datorskärmen.Bilden på datorskärmen är en spegelbild från vyn i mikroskopokularna. Justera fokus för att skärpa bilden av enskilda rörliga partiklar på skärmen med fokusratten. För att ladda proverna, dra upp en milliliter av provet i en sköljd en milliliter tuberkulinspruta och fäst sprutan i inloppsporten på flödescellkåpan.Fortsätt att föra kolven framåt tills vätska är uppenbar i den öppna sprutan som är fäst vid utloppsporten. Modulen ska lutas så att luft kan rensas från lasermodulen. I kameravyn flyttar du fokus till höger om laserlinjen till ett område med ett enhetligt antal partiklar.Justera den vertikala orienteringen för att centrera de horisontella ljusbanden och fokusera om tills det högsta antalet partiklar är i sikte. Se till att fokuspositionen bibehålls konsekvent för alla efterföljande åtgärder. Justera kameranivån så att den mörka informationssymbolen blinkar intermittent på och av längst upp till höger i kameravyn.För nanopartikelspårningsanalys, eller NTA, ställer du in varaktigheten på 30 eller 60 sekunder och antalet videor till fem. Om du vill ändra det befintliga basfilnamnet klickar du på fliken för en ny lagringsplats för genererade data med ett nytt filnamn. Markera sedan måltemperaturrutan för att mata in önskad temperatur och klicka på skapa skript för att återanvända standardmätningen.När exemplet har lästs in och experimentet är klart att köras klickar du på skapa och kör skript. På popup-skärmen med ange rapportinformation fyller du i fälten med nödvändig information om operatorn, provet och utspädningsmedlet. När alla önskade fält har fyllts i klickar du på inställningar OK för att initiera skriptet.Före varje videoinspelning letar du efter en uppmaning om att flytta fram kolven manuellt. Injicera cirka 0,05 ml av provet i laserkammaren. När partiklarna vilar klickar du på OK. När du har slutfört den femte videoinspelningen visas en inställningsbekräftelseruta tillsammans med processrutan.När ramarna avanceras manuellt från botten av videoskärmen, notera antalet blå kors som gör partiklar på skärmen och ställ in detektionströskeln för bearbetning av provet. Vänta tills videorna bearbetas automatiskt i ett histogram med resultat innan ett dialogmeddelande om slutförande visas och tryck sedan på OK. När rutan Exportinställningar visas sparar du resultaten genom att klicka på Exportera. Markera alla fem inspelningsvideor som listas i det aktuella experimentet.Klicka sedan på bearbeta valda filer och vänta tills inställningsbekräftelserutan visas i processrutan för att blinka för att ändra detekteringströskeln, justera sedan detekteringströskeln till önskad nivå och gå till inställning och klicka på OK. Videorna bearbetas automatiskt i ett histogram med resultat och en dialogruta om slutförande visas. Klicka OK.In den representativa analysen visas resultaten av nanotrackinganalysen, eller NTA, för liposomproverna och ett representativt DPBS-utspädningsmedel. Filtrerade prover hade en genomsnittlig partikeldiameter på 108 nanometer och en koncentration av 7,4 gånger 10 till de åttonde partiklarna per milliliter.Däremot hade ofiltrerade prover en genomsnittlig partikeldiameter på 159 nanometer och en koncentration av 7,6 gånger 10 till de åttonde partiklarna per milliliter. Vid kombinerade kameranivåer, när detektionströskeln höjdes från två till fem, visade medel- och lägespartikelstorleken en signifikant minskning av partikelstorlekarna hos de filtrerade proverna. Partikelkoncentrationerna vid kombinerade kameranivåer minskade i takt med att detektionströskeln höjdes.Ingen signifikant skillnad i partikelkoncentrationer mellan filtrerade och ofiltrerade prover detekterades. Vid kombinerade detektionströsklar, när kameranivån ökade från 12 till 14, noterades en minskning av medelvärdet och lägets partikelstorlek för de filtrerade proverna. Partikelkoncentrationerna vid kombinerade detektionströsklar ökade när kameranivåerna ökade från 12 till 14.Inga signifikanta skillnader mellan filtrerade och ofiltrerade prover observerades. Steg 4.1 till 5.2 är viktiga för att hitta rätt visningsområde. Att uppnå konsekventa resultat över flera testkörningar beror på denna repeterbara färdighet.Dynamisk ljusspridning används ofta som en följeslagare till nanopartikelspårningsanalys främst för att få zetapotentialen, vilket är partiklarnas ytladdning. För nanopartikelanalys fortsätter NTA att vara en mycket värdefull metod för kvantifiering av partiklar som är användbara för extracellulär vesikelforskning.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design av en cyklisk tryck Bioreaktor för Ex vivo Studie av Aorta hjärtklaffar

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Utvärdering av polymera Gene Delivery nanopartiklar genom nanopartikel Tracking Analys och hög kapacitet flödescytometri

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions

A Novel Tredimensionell strömningskammare Device att studera Chemokine-riktad Extravasering av celler som cirkulerar under fysiologiska flödesförhållanden

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell ...

Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

Längsgående Mätning av extracellulär matrix Stelhet i 3D tumörmodeller Använda Partikel-tracking Microrheology

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and ...

Quantification and Size-profiling of Extracellular Vesicles Using Tunable Resistive Pulse Sensing

Kvantifiering och storlek-profilering av extracellulärt Blåsor Använda Avstämbara Resistiv Pulse Sensing

Extracellular vesicles (EVs), including &#8216;microvesicles&#8217; and &#8216;exosomes&#8217;, are highly abundant in bodily fluids. Recent years have ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

3D Orbital Tracking i en modifierad Två-foton Mikroskop: En ansökan till spårning av intracellulära vesiklar

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Paper-based Devices for Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles

Pappersbaserade enheter för Isolering och karakterisering av extracellulär Blåsor

Extracellular vesicles (EVs), membranous particles released from various types of cells, hold a great potential for clinical applications. They contain ...

Retroductal Nanoparticle Injection to the Murine Submandibular Gland

Retroductal nanopartiklar injektion till murina Submandibular körtel

Two common goals of salivary gland therapeutics are prevention and cure of tissue dysfunction following either autoimmune or radiation injury. By locally ...

Evaluation of the Storage Stability of Extracellular Vesicles

Utvärdering av lagrings stabiliteten hos extracellulära vesikler

Extracellular vesicles (EVs) are promising targets in current research, to be used as drugs, drug-carriers, and biomarkers. For their clinical ...

In Vivo Two-Color 2-Photon Imaging of Genetically-Tagged Reporter Cells in the Skin

In vivo tvåfärgad 2-Photon Imaging av genetiskt märkta reporter celler i huden

Fibroblasts are mesenchymal cells that change their morphology upon activation, ultimately influencing the microenvironment of the tissue they are located ...