Name: improving reproducibility to meet minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 guidelines in nanoparticle tracking analysis
Uploaded: 2021-11-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Improving Reproducibility to Meet Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 Guidelines in Nanoparticle Tracking Analysis at JoVE.com

Çalışma, Kansas eyaleti tarafından Midwest Karşılaştırmalı Kök Hücre Biyolojisi Enstitüsü'ne (MICSCB), Johnson Kanser Araştırma Merkezi'nden MLW'ye ve NIH R21AG066488'den LKC'ye desteklendi. OLS, MICSCB'den GRA desteği aldı. Yazarlar, bu projede kullanılan lipozomları sağladığı için Dr. Santosh Aryal'a ve yararlı konuşmalar ve geri bildirimler için Weiss ve Christenson laboratuvarlarının üyelerine teşekkür ediyor. Dr. Hong He'ye teknik destek için teşekkür edilir. MLW, Betti Goren Weiss'a desteği ve danışmanlığı için teşekkür eder.

1. Genel protokol yönergeleri
<ol><li>Mikroskopu bir hava tablasında veya en azından titreşimsiz bir masada tutun. Yabancı titreşimlerin (örneğin, yere ayak vurma, masaya dokunma, kapı kapatma, laboratuvar trafiği) minimumda tutulduğundan emin olun.</li>
	<li>Lazer Modül'ün sıcaklığını tüm video kayıtları için sabit bir sıcaklıkta ayarlayın ve koruyun. NOT: Seçilen sıcaklık 25 °C idi, çünkü nanopartikül boyutu analizörü bu sıcaklıkta kalibre edildi. Bu nedenle, c...

<ol>
	<li>Lotvall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+experimental+requirements+for+definition+of+extracellular+vesicles+and+their+functions:+a+position+statement+from+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles.">Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).</li><li>Thery, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Consortium, E. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EV-TRACK:+transparent+reporting+and+centralizing+knowledge+in+extracellular+vesicle+research.">EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research.</a> Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).</li><li>Gardiner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+used+for+the+isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles:+results+of+a+worldwide+survey.">Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 5, 32945 (2016).</li><li>Maas, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possibilities+and+limitations+of+current+technologies+for+quantification+of+biological+extracellular+vesicles+and+synthetic+mimics.">Possibilities and limitations of current technologies for quantification of biological extracellular vesicles and synthetic mimics.</a> Journal of Controlled Release. 200, 87-96 (2015).</li><li>Danaei, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+particle+size+and+polydispersity+index+on+the+clinical+applications+of+lipidic+nanocarrier+systems.">Impact of particle size and polydispersity index on the clinical applications of lipidic nanocarrier systems.</a> Pharmaceutics. 10 (2), 57 (2018).</li><li>Kestens, V., Bozatzidis, V., De Temmerman, P. J., Ramaye, Y., Roebben, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+particle+tracking+analysis+method+for+the+size+determination+of+nano-+and+microparticles.">Validation of a particle tracking analysis method for the size determination of nano- and microparticles.</a> Journal of Nanoparticle Research. 19 (8), 271 (2017).</li><li>Filipe, V., Hawe, A., Jiskoot, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+evaluation+of+nanoparticle+tracking+analysis+(NTA)+by+NanoSight+for+the+measurement+of+nanoparticles+and+protein+aggregates.">Critical evaluation of nanoparticle tracking analysis (NTA) by NanoSight for the measurement of nanoparticles and protein aggregates.</a> Pharmaceutical Research. 27 (5), 796-810 (2010).</li><li>Hole, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interlaboratory+comparison+of+size+measurements+on+nanoparticles+using+nanoparticle+tracking+analysis+(NTA).">Interlaboratory comparison of size measurements on nanoparticles using nanoparticle tracking analysis (NTA).</a> Journal of Nanoparticle Research. 15 (12), 2101 (2013).</li><li>Malvern analytical Ltd. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NanoSight LM10 Operating Manual-P550H. , (2013).</li><li>Kim, A., Ng, W. B., Bernt, W., Cho, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+size+estimation+of+nanoparticle+tracking+analysis+on+polydisperse+macromolecule+assembly.">Validation of size estimation of nanoparticle tracking analysis on polydisperse macromolecule assembly.</a> Scientific Reports. 9 (1), 2639 (2019).</li><li>Gollwitzer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+techniques+for+size+measurement+of+nanoparticles+in+cell+culture+medium.">A comparison of techniques for size measurement of nanoparticles in cell culture medium.</a> Analytical Methods. 8 (26), 5272-5282 (2016).</li><li>vander Pol, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+size+distribution+of+exosomes+and+microvesicles+determined+by+transmission+electron+microscopy,+flow+cytometry,+nanoparticle+tracking+analysis,+and+resistive+pulse+sensing.">Particle size distribution of exosomes and microvesicles determined by transmission electron microscopy, flow cytometry, nanoparticle tracking analysis, and resistive pulse sensing.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (7), 1182-1192 (2014).</li></ol>

Nanopartiküllerin boyutunu ve konsantrasyonunu tahmin etmek için çeşitli yöntemler vardır11. Bunlar, dinamik ışık saçılması (DLS), santrifüjlü çökeltme ve tek parçacık seviyesi analizi-elektron mikroskobu, NTA, atomik kuvvet mikroskobu ve ayarlanabilir dirençli darbe algılama dahil olmak üzere bir popülasyondan boyut tahmini üreten topluluk yöntemlerini içerir. Bunlardan DLS ve NTA, ideal bir ortamda Brownian hareketine dayanan tahribatsız boyut ve konsantrasyon ölçüm ...

EV'lerin ve diğer nanometre ölçekli parçacıkların doğru ve tekrarlanabilir analizi, araştırma ve endüstri genelinde çok sayıda zorluk ortaya koymaktadır. EV araştırmasının çoğaltılması, kısmen, veri toplama ile ilişkili gerekli parametrelerin raporlanmasında tekdüzelik olmaması nedeniyle zor olmuştur. Bu eksiklikleri gidermek için ISEV, EV araştırmacıları için asgari bir biyokimyasal, biyofiziksel ve fonksiyonel standartlar kümesi olarak endüstri kılavuzları önerdi ve bunları genellikle MISEV20141 olarak adlandırılan bir pozisyon beyanı olarak yayınladı. EV araştırmasının hızlanan hızı, güncellenmiş bir kılavuz gerektiriyordu ve "MISEV2018: ISEV'in bir pozisyon beyanı", MISEV2014 kılavuzlarınıgenişletti 2. MISEV2018 makalesi, tablolar, önerilen protokollerin ana hatları ve belirli EV ile ilişkili karakterizasyonu belgelemek için izlenecek adımları içeriyordu. Deneylerin yorumlanmasını ve çoğaltılmasını kolaylaştırmak için bir başka önlem olarak, EV-TRACK, EV biyolojisinin ve yayınlanan sonuçlar için kullanılan metodolojinin daha şeffaf bir şekilde raporlanmasını sağlamak için kitle kaynaklı bir bilgi tabanı (http://evtrack.org) olarak geliştirilmiştir3. Yöntemlerin standartlaştırılmış raporlaması için bu önerilere rağmen, alan yayınlanan sonuçların çoğaltılması ve doğrulanması konusunda acı çekmeye devam etmektedir.
Ulusal Sağlık Enstitüleri ve Ulusal Bilim Vakfı'nın kalite değerlendirme araçlarına yönelik çabalarına uyan bu makale, ISEV'in veri değerlendirme araçlarının laboratuvarlar arasında sonuçların çoğaltılması amacıyla uygulanabilmesi için yöntemlerin ve ayrıntıların standartlaştırılmış bir şekilde raporlanmasını gerektirdiğini göstermektedir. Hücre kaynaklarının raporlanması, hücre kültürü prosedürleri ve EV izolasyon yöntemleri, EV popülasyonunun niteliklerini tanımlamak için önemli faktörlerdir. NTA cihazları arasında, algılama ayarları, taşıyıcı sıvının kırılma indisi, polidispersiteye katkıda bulunan heterojen parçacık popülasyonları, standartlaştırılmış raporlama gereksinimlerinin eksikliği ve gözlemciler arası ve gözlemciler arası ölçüm sonuçlarının bulunmaması gibi faktörler, laboratuvarlar arasında NTA karşılaştırmasını zorlaştırır veya imkansız hale getirir.
2006'dan beri kullanımda olan NTA, şu anda EV araştırmacılarının yaklaşık% 80'i tarafından kullanılan nanopartikül boyutu ve konsantrasyon tayini için popüler bir yöntemdir4. MISEV2018 Kılavuzları, NTA'nın popüler seçeneklerden biri olduğu iki tür tek vezikül analizi gerektirir. NTA, geniş erişilebilirliği, numune başına düşük maliyeti ve basit kurucu teorisi (Stokes-Einstein denklemi) nedeniyle EV karakterizasyonu için ortak kullanımda olmaya devam etmektedir. NTA tarafından yapılan EV değerlendirmesi, lazer ışık saçılması ve Brownian hareket analizi kullanılarak bir partikül boyutu dağılımı ve konsantrasyon tahmini oluşturur ve alt algılama sınırı EV'nin kırılma indisi tarafından belirlenir. Bilinen viskozite ve sıcaklığa sahip akışkan bir numune kullanıldığında, EV'lerin yörüngeleri, ortalama kare yer değiştirmelerini iki boyutta belirlemek için izlenir. Bu, parçacık difüzyon katsayısının hesaplanmasını ve modifiye edilmiş bir Stokes-Einstein denklemi 5,6,7 ile küreye eşdeğer bir hidrodinamik çapa dönüştürülmesini sağlar. NTA'nın parçacık-parçacık analizi, heterojen bir EV popülasyonundaki aglomeralar veya daha büyük parçacıklar tarafından diğer karakterizasyon yöntemlerinden daha az girişime sahiptir7. Birkaç büyük parçacık boyutlandırma doğruluğu üzerinde minimum etkiye sahip olsa da, küçük miktarlarda büyük, yüksek ışık saçan parçacıkların varlığı, azaltılmış yazılım EV algılama ve izleme8 nedeniyle daha küçük parçacıkların algılanmasında kayda değer bir azalmaya neden olur. Bir ölçüm tekniği olarak, NTA'nın genellikle daha büyük parçacıklara veya parçacık agregalarına karşı önyargılı olmadığı düşünülür, ancak bireysel parçacık analizi9 yoluyla çok boyutlu popülasyonları çözebilir. Parçacıklar tarafından ışık saçılmasının kullanılması nedeniyle, NTA analizinin sınırlamalarından biri, EV'lere kıyasla benzer kırılma ve boyut özelliklerine sahip toz, plastik veya toz gibi herhangi bir partikülün bu karakterizasyon yöntemiyle gerçek EV'lerden ayırt edilememesidir.
NanoSight LM10 (nanopartikül boyutu analizörü) ve LM14 (lazer modülü) 2006'dan beri satılmaktadır ve bu cihazın daha yeni modelleri geliştirilmiş olmasına rağmen, bu özel model birçok temel tesiste bulunur ve güvenilir bir iş gücü olarak kabul edilir. Boyut ve konsantrasyonun yüksek çözünürlüklü ölçümleri için NTA ayarlarını uygun şekilde optimize etmek için eğitim gereklidir. Optimum video kayıtları için gereken iki önemli ayar (1) kamera seviyesi ve (2) algılama eşiğidir. Bunlar, numunenin özelliklerine göre operatör tarafından ayarlanmalıdır. NTA analizinin en önemli kısıtlamalarından biri, 107 ila 109 partikül / mL arasındaki numune konsantrasyonlarının önerilmesidir, bu numune seyreltmesini sağlamak içingerekli olabilir 10. Fosfat tamponlu salin, 0,15 M salin veya ultra saf su gibi seyreltme için kullanılan çözeltiler, NTA ölçümlerini etkileyebilecek 220 μm'den küçük parçacıklardan nadiren arındırılmıştır. Seyreltme için kullanılan çözeltilerin NTA karakterizasyonu, analiz edilen nanopartikül örnekleri ile aynı kamera seviyesinde ve algılama eşiğinde yapılmalıdır. EV numune seyreltmeleri için kullanılan seyrelticilerde bulunan nanopartiküllerin büyüklüğü ve konsantrasyonu, EV'lerin NTA analizini içeren yayınlara nadiren dahil edilir.
Bu protokol, kamera seviyesinin, algılama eşiğinin veya örnek filtrasyonunun NTA veri kümesi üzerindeki sistematik etkilerini analiz etmek için seçilen kamera seviyeleri, algılama eşikleri ve numunelerin mekanik filtrelenmesi kullanılarak değerlendirilen sentetik EV benzeri lipozomların NTA analizini kullanır. Lipozomlar Ek Dosya S1'de açıklandığı gibi sentezlendi. Bu deneyde sentetik lipozomlar, boyut homojenlikleri, fiziksel özellikleri ve 4 ° C'de depolamadaki stabiliteleri nedeniyle kullanılmıştır. EV'lerin gerçek örnekleri kullanılmış olsa da, EV'lerin depolama sırasındaki heterojenliği ve stabilitesi bu çalışmayı ve yorumlanmasını zorlaştırmış olabilir. (A) lipozomlardan ve (B) EV'lerden NTA raporlarındaki benzerlikler, bu makalede lipozomlar için ortaya konan sistematik etkilerin muhtemelen EV karakterizasyonu için de geçerli olacağını göstermektedir (Şekil 1). Bu bulgular birlikte, kritik yazılım ayarlarının tam raporlanmasının ve seyreltici, seyreltme ve filtreleme gibi örnek işlemenin tanımının NTA verilerinin tekrarlanabilirliğini etkilediği fikrini desteklemektedir.
Bu makalenin amacı, NTA ayarlarının (sıcaklık, kamera seviyesi ve algılama eşiği) ve numune hazırlamanın değiştirilmesinin toplanan sonuçları değiştirdiğini göstermektir: sistematik, boyut ve konsantrasyonda önemli farklılıklar elde edilmiştir. NTA, MISEV2018 karakterizasyon spesifikasyonunu yerine getirmek için popüler seçeneklerden biri olduğundan, bu sonuçlar tekrarlanabilirliği sağlamak için numune hazırlama ve NTA ayarlarının raporlanmasının önemini göstermektedir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63059/63059fig01.jpg"> Şekil 1: Temsilci NTA, lipozomları EV'lerle karşılaştırmak için rapor verir. (A) Lipozomlar: 12 Mart 2020'de NTA'da karakterize edilen filtrelenmemiş numune. (B) EV'ler: 26 Ağustos 2021 tarihinde NTA'da karakterize edilen filtrelenmemiş numune. Kısaltmalar: NTA = Nanopartikül izleme analizi; EV'ler = hücre dışı veziküller. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63059/63059fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Automatic Pipetter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes, Conical, Nunc 15 mL</td>
			<td>Thermo Sci.</td>
			<td>339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens Cleaner</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens Paper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight LM-10</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight LM-14 Laser Module</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosight NTA Software Ver. 3.2</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper Towels</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips, 1-200 &#181;L, Filtered, Sterile, Low Binding</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>P -3243-200X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips, 50-1,000 &#181;L, Filtered, Sterile</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>P-3243-1250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline, Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered (No Ca or Mg)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standards, Latex Transfer- 100 nm (3 mL)</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>NTA4088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standards, Latex Transfer- 50 nm&#160; (3 mL)</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>NTA4087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter, 33 mm, .22 &#181;m, MCE, Sterile</td>
			<td>Fisher brand</td>
			<td>09-720-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, TB, 1 mL, slip tip</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waste fluid container</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improving reproducibility to meet minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 guidelines in nanoparticle tracking analysis

Nanopartikül izleme analizi (NTA), 2006 yılından bu yana hücre dışı vezikül (EV) araştırmaları için kullanılan çeşitli karakterizasyon yöntemlerinden biri olmuştur. Birçoğu, NTA cihazlarının ve yazılım paketlerinin minimum eğitimin ardından kolayca kullanılabileceğini ve boyut kalibrasyonunun şirket içinde mümkün olduğunu düşünmektedir. Hem NTA edinimi hem de yazılım analizi EV karakterizasyonunu oluşturduğundan, Hücre Dışı Vezikül Çalışmaları için Minimal Bilgi 2018'de (MISEV2018) ele alınmıştır. Ek olarak, EV deneylerinin sağlamlığını artırmak için Şeffaf Raporlama ve Hücre Dışı Vezikül Araştırmalarında Merkezi Bilgi (EV-TRACK) tarafından izlenmiştir (örneğin, kontrolsüz faktörler nedeniyle deneysel varyasyonu en aza indirmek).
Yöntemlerin ve kontrollerin raporlanmasını teşvik etme çabalarına rağmen, yayınlanan birçok araştırma makalesi, orijinal NTA gözlemlerini çoğaltmak için gereken kritik ayarları rapor etmede başarısız olmaktadır. Çok az sayıda makale, negatif kontrollerin veya seyrelticilerin NTA karakterizasyonunu, fosfat tamponlu salin veya ultra saf damıtılmış su gibi ticari olarak temin edilebilen ürünlerin partikülsüz olduğunu varsayarak açıkça bildirmektedir. Benzer şekilde, pozitif kontroller veya boyut standartları, parçacık boyutlandırmasını doğrulamak için araştırmacılar tarafından nadiren rapor edilir. Stokes-Einstein denklemi, parçacık yer değiştirmesini belirlemek için numune viskozitesini ve sıcaklık değişkenlerini içerir. Bu nedenle, tüm numune video toplama işlemi sırasında kararlı lazer odası sıcaklığının raporlanması, doğru replikasyon için önemli bir kontrol ölçüsüdür. Numunelerin veya seyrelticilerin filtrasyonu da rutin olarak rapor edilmez ve eğer öyleyse, filtrenin özellikleri (üretici, membran malzemesi, gözenek boyutu) ve depolama koşulları nadiren dahil edilir. Uluslararası Hücre Dışı Vezikül Derneği'nin (ISEV) kabul edilebilir deneysel ayrıntıların asgari standartları, EV'lerin karakterizasyonu için iyi belgelenmiş bir NTA protokolü içermelidir. Aşağıdaki deney, bireysel araştırmacı tarafından bir NTA analiz protokolünün oluşturulması gerektiğine ve tek vezikül karakterizasyonu için MISEV2018 gereksinimlerini yerine getirme seçeneklerinden biri olarak NTA karakterizasyonunu kullanan yayın yöntemlerine dahil edilmesi gerektiğine dair kanıtlar sunmaktadır.

Tablo 1 , lipozom örnekleri (18 filtrelenmiş ve 18 filtrelenmemiş) ve temsili bir DPBS seyreltici için NTA videolarının sonuçlarını içermektedir. Bu yazıda kamera seviyesi veya algılama eşiğinden bağımsız olarak iki grup arasındaki karşılaştırmalar tamamlanmıştır. Filtrelenmiş numunelerin ortalama parçacık çapı 108.5 nm, parçacık modu 86.2 nm ve konsantrasyonu 7.4 × 108 parçacık/mL idi. Buna karşılık, filtrelenmemiş numunelerin ortalama parçacık çapı ...

Watch this Scientific Journal Video about Improving Reproducibility to Meet Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 Guidelines in Nanoparticle Tracking Analysis at JoVE.com

Improving Reproducibility to Meet Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 Guidelines in Nanoparticle Tracking Analysis

Nanopartikül izleme analizi (NTA), hücre dışı vezikülleri karakterize etmek için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Bu makale, NTA deneysel parametrelerini ve kontrollerini ve ayrıca MISEV2018 ve EV-TRACK tarafından laboratuvarlar arasında tekrarlanabilirlik için önerilen kılavuzları desteklemek için gerekli numunelerin ve seyrelticilerin tek tip bir analiz ve karakterizasyon yöntemini vurgulamaktadır.

Hücre Dışı Vezikül Çalışmaları için Minimum Bilgiyi Karşılamak için Yeniden Üretilebilirliğin Geliştirilmesi 2018 Nanopartikül İzleme Analizinde Kılavuzlar

Nanoparticle tracking analysis (NTA) has been one of several characterization methods used for extracellular vesicle (EV) research since 2006. Many ...

Bu protokol, NanoSight LM10'un acemi operatörleri için geliştirilmiştir. Adım adım talimatları izleyerek, doğru ve tekrarlanabilir sonuçlar elde edilebilir. Bu teknik, kullanıcının beceri düzeyinden bağımsız olarak birden fazla deneme çalıştırmasında tutarlı sonuçlar elde edilmesine yardımcı olur.Nanopartikül karakterizasyonu, özellikle nicelleştirme, hücre dışı vezikül araştırma alanında bir zorluk olmaya devam etmektedir. Bu protokol, süspansiyondaki nanopartiküllerin tutarlı bir boyut ve konsantrasyon analizine izin verir. Lazer Modül'ün cam yüzeylerini kaliteli bir lens temizleyici ve lens kağıdı ile temizleyerek başlayın.Modülün montajından önce, O-ring contasının akış hücresi kapağının oluğuna düzgün bir şekilde oturduğundan emin olun. Ardından, akış hücresi kapağını lazer modülünün üzerine yerleştirin ve elektrik kontaklarının doğru yönde olduğundan emin olun. Ardından, dört yaylı başparmak vidasını akış hücresi plakasından geçirin ve lazer modülünün dişlerini ayrı ayrı sıkmadan takın.Akış hücresi kapağına eşit basınç uygularken, başparmak vidalarını sıkışana kadar alternatif çapraz bir şekilde düzgün bir şekilde sıkın. İki adet bir mililitrelik tüberkülin şırıngasını bir mililitre DPBS ile üç kez kayar kilit adaptörleriyle yıkayın. Şırıngayı boş bir seyreltici veya numune rezervuarı olarak hizmet etmek üzere kalan porta yerleştirmeden önce pistonu ilk tüberkülin şırıngasından çıkarın ve atın.Ardından ikinci şırıngayı bir mililitre DPBS ile doldurun ve akış hücresi kapağının giriş portuna takın. DPBS lazer modülüne yavaşça enjekte edilirken havanın odadan temizlenmesini sağlamak için lazer modülünü çıkış şırınga portu yükseltilmiş olarak eğin önünde tutun. Giriş bağlantı noktasına bir mililitre hava enjekte ederek kalan DPBS'leri lazer modülden yıkayın.Kızarma işlemini iki kez tekrarlayın. Son yıkamadan sonra, lazer modülünü mümkün olduğunca tamamen boşaltın ve odaklama ve konumlandırma için modülü yükleyin. Yazılımı açın.Sol üst köşedeki kutudaki yakalama sekmesinin altında, kamerayı başlat'ı tıklatın. Kamera beş dakika sonra otomatik olarak kapanırsa, yeniden başlatmak için kamerayı başlat'ı tıklatın. Aynı sekmede, lazer çizgisini aydınlatmak ve parçacık tanımlamayı ve odaklamayı basitleştirmek için kamera seviyesini 14 ila 16 olarak ayarlayın.Kafa parçasının sol tarafındaki üst kaydırıcıyı içeri veya dışarı hareket ettirerek, görüntüyü kameradan göz merceklerine yönlendirin. Görüş alanında, parmak izi ve merkez olarak adlandırılan artan yoğunluk alanını bulun ve parmak izini dikey olarak odaklayın. Görüş alanında, lazer çizgisini ortalayın, ardından ışığı bilgisayar ekranında gözlemlendiği gibi kameraya yönlendirmek için üst kaydırıcıyı hareket ettirin.Bilgisayar ekranındaki görüntü, mikroskop göz merceklerindeki görünümden bir ayna görüntüsüdür. Netleme düğmesiyle ekrandaki tek tek hareket eden parçacıkların görüntüsünü keskinleştirmek için odağı ayarlayın. Numuneleri yüklemek için, numunenin bir mililitresini durulanmış bir mililitre tüberkülin şırıngasına çekin ve şırıngayı akış hücresi kapağının giriş portuna takın.Çıkış portuna bağlı açık şırıngada sıvı belirginleşene kadar pistonu ilerletmeye devam edin. Modül, lazer modülünden havanın temizlenmesini sağlamak için eğilmelidir. Kamera görünümünde, odağı lazer çizgisinin sağında, eşit sayıda parçacıktan oluşan bir alana taşıyın.Yatay ışık bantlarını ortalamak için dikey yönü ayarlayın ve en yüksek sayıda parçacık görünene kadar yeniden odaklanın. Sonraki tüm önlemler için odağın konumunu tutarlı tuttuğunuzdan emin olun. Kamera seviyesini, karanlık bilgi sembolünün kamera görünümünün sağ üst köşesinde aralıklı olarak yanıp söneceği şekilde ayarlayın.Nanopartikül izleme analizi veya NTA için, süreyi 30 veya 60 saniyeye ve video sayısını beş olarak ayarlayın. Varolan temel dosya adını değiştirmek için, yeni bir dosya adıyla oluşturulan veriler için yeni bir depolama sitesinin sekmesini tıklatın. Ardından, istenen sıcaklığı girmek için hedef sıcaklık kutusunu işaretleyin ve standart ölçümü yeniden kullanmak için komut dosyası oluştur'a tıklayın.Örnek yüklendikten ve deneme çalışmaya hazır olduğunda, komut dosyası oluştur ve çalıştır'ı tıklayın. Rapor ayrıntılarını ayarla açılır ekranında, alanları işleç, numune ve seyreltici hakkında gerekli bilgilerle doldurun. İstenen tüm alanlar doldurulduğunda, komut dosyasını başlatmak için ayarlar Tamam'ı tıklatın.Her video çekiminden önce, pistonu manuel olarak ilerletmek için bir istem arayın. Numunenin yaklaşık 0.05 mililitresini lazer odasına enjekte edin. Parçacıklar dinlenmeye başladığında, Tamam'ı tıklatın. Beşinci video çekimini tamamladıktan sonra, işlem kutusuyla birlikte bir ayar onay kutusu görünecektir.Kareler video ekranının altından manuel olarak ilerletildiğinden, ekranda parçacık oluşturan mavi haçların sayısına dikkat edin ve numunenin işlenmesi için algılama eşiğini ayarlayın. Tamamlandığına dair bir iletişim kutusu bildirimi görüntülenmeden önce videoların sonuçların histogramında otomatik olarak işlenmesini bekleyin, ardından Tamam'a basın. Dışa aktarma ayarları kutusu göründükten sonra, dışa aktar'ı tıklatarak sonuçları kaydedin. Geçerli denemede listelenen yakalama videolarının beşini de vurgulayın.Ardından, seçilen dosyaları işle'yi tıklayın ve algılama eşiğini değiştirmek için işlem kutusunda ayar onay kutusunun yanıp sönmesini bekleyin, ardından algılama eşiğini istediğiniz düzeye ayarlayın ve ayara gidin ve Tamam'ı tıklayın. Videolar, sonuçların histogramında otomatik olarak işlenecek ve tamamlandığına dair bir iletişim kutusu bildirimi görüntülenecektir. Temsili analiz, lipozom örnekleri için nanoizleme analizinin sonuçları veya NTA ve temsili bir DPBS seyrelticisi OK.In tıklayın. Filtrelenmiş numunelerin ortalama parçacık çapı 108 nanometre ve mililitre başına sekizinci parçacıklara 7.4 kat 10 konsantrasyonu vardı.Buna karşılık, filtrelenmemiş numunelerin ortalama parçacık çapı 159 nanometre ve mililitre başına sekizinci parçacıklara 7.6 çarpı 10 konsantrasyonu vardı. Birleşik kamera seviyelerinde, algılama eşiği ikiden beşe çıkarıldıkça, ortalama ve mod partikül boyutu, filtrelenmiş numunelerin partikül boyutlarında önemli bir düşüş gösterdi. Algılama eşiği artırıldıkça birleşik kamera seviyelerindeki parçacık konsantrasyonları azaltıldı.Filtrelenmiş ve filtrelenmemiş numuneler arasında partikül konsantrasyonlarında anlamlı bir fark tespit edilmemiştir. Kombine algılama eşiklerinde, kamera seviyesi 12'den 14'e yükseldikçe, filtrelenmiş numunelerin ortalama ve mod parçacık boyutunda bir azalma kaydedildi. Kombine algılama eşiklerindeki parçacık konsantrasyonları, kamera seviyeleri 12'den 14'e yükseldikçe arttı.Filtrelenmiş ve filtrelenmemiş örnekler arasında anlamlı bir fark gözlenmemiştir. Doğru görüntüleme alanını bulmak için 4.1 ile 5.2 arasındaki adımlar önemlidir. Birden fazla deneme çalıştırmasında tutarlı sonuçlar elde etmek, bu tekrarlanabilir beceriye bağlıdır.Dinamik ışık saçılması genellikle nanopartikül izleme analizine eşlik etmek için öncelikle parçacıkların yüzey yükü olan zeta potansiyelini elde etmek için kullanılır. Nanopartikül analizi için NTA, hücre dışı vezikül araştırmaları için yararlı olan parçacıkların nicelleştirilmesinde çok değerli bir yöntem olmaya devam etmektedir.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Devirli Basınç Biyoreaktör Tasarım Ex vivo</emAort Kalp Vanalar> Eğitim

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Polimerik Gen Taşıyıcı Değerlendirilmesi Nanoparçacık İzleme Analizi ve Yüksek throughput Flow Sitometri tarafından Nanopartiküller

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions

Fizyolojik Akış Koşullarında Sirkülasyon Hücre Kemokin-yönettiği Ekstravazasyon Eğitim Bir Roman Üç boyutlu Akış Odası Cihazı

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell ...

Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

Partikül izleme Microrheology kullanarak 3D Tümör Modelleri Ekstrasellüler Matriks Rijitliğinin Boyuna Ölçümü

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and ...

Quantification and Size-profiling of Extracellular Vesicles Using Tunable Resistive Pulse Sensing

Sayımı ve Ayarlanabilir Dirençli Darbe Algılama Yöntemi Ekstrasellüler Veziküller boyutu-profil

Extracellular vesicles (EVs), including &#8216;microvesicles&#8217; and &#8216;exosomes&#8217;, are highly abundant in bodily fluids. Recent years have ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

Modifiye İki foton mikroskop 3D Orbital Takip: Hücre içi veziküllerin İzlemeye Bir Uygulama

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Paper-based Devices for Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles

Ekstrasellüler Veziküller Yalıtım ve Karakterizasyonu için kağıt tabanlı cihazlar

Extracellular vesicles (EVs), membranous particles released from various types of cells, hold a great potential for clinical applications. They contain ...

Retroductal Nanoparticle Injection to the Murine Submandibular Gland

Fare Submandibular bezi Retroductal nanopartikül enjeksiyon

Two common goals of salivary gland therapeutics are prevention and cure of tissue dysfunction following either autoimmune or radiation injury. By locally ...

Evaluation of the Storage Stability of Extracellular Vesicles

Ekstrasellüler veziküllerin depolama Istikrarı değerlendirilmesi

Extracellular vesicles (EVs) are promising targets in current research, to be used as drugs, drug-carriers, and biomarkers. For their clinical ...

In Vivo Two-Color 2-Photon Imaging of Genetically-Tagged Reporter Cells in the Skin

İn vivo Iki renkli 2-foton görüntüleme genetiği etiketlenmiş Reporter hücrelerinin cilt içinde

Fibroblasts are mesenchymal cells that change their morphology upon activation, ultimately influencing the microenvironment of the tissue they are located ...