Name: monitoring breast cancer growth and metastatic colony formation in mice using bioluminescence
Uploaded: 2021-11-05T13:00:00
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Ringraziamo i membri del laboratorio Y.D.S. Vorremmo ringraziare il Wohl Institute for Translational Medicine presso l'Hadassah Medical Center, Gerusalemme, per aver fornito la struttura di imaging per piccoli animali. Questo studio è stato supportato dal Research Career Development Award dell'Israel Cancer Research Fund.

Tutti gli esperimenti sui topi sono stati condotti nell'ambito del protocollo MD-21-16429-5 approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università Ebraica. Inoltre, l'Università Ebraica è certificata dall'Associazione per la valutazione e l'accreditamento della cura degli animali da laboratorio (AAALAC).
1. Manutenzione della linea cellulare
NOTA: Le linee cellulari del cancro al seno umano (MCF-7, MDA-MB-468 e MDA-MB-231) sono state...

<ol>
	<li>Waks, A. G., Winer, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+cancer+treatment:+A+review.">Breast cancer treatment: A review.</a> JAMA. 321 (3), 288-300 (2019).</li><li>Jin, X., Mu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+breast+cancer+metastasis.">Targeting breast cancer metastasis.</a> Breast Cancer: Basic and Clinical Research. 9, 23-34 (2015).</li><li>Saha, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+bioluminescence+imaging+of+tumor+hypoxia+dynamics+of+breast+cancer+brain+metastasis+in+a+mouse+model.">In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics of breast cancer brain metastasis in a mouse model.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (56), e3175 (2011).</li><li>Rashid, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+tail+vein+injection+a+relevant+breast+cancer+lung+metastasis+model.">Is tail vein injection a relevant breast cancer lung metastasis model.</a> Journal of Thoracic Disease. 5 (4), 385-392 (2013).</li><li>Fantozzi, A., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+breast+cancer+metastasis.">Mouse models of breast cancer metastasis.</a> Breast Cancer Research. 8 (4), 212 (2006).</li><li>Kocat&#252;rk, B., Versteeg, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthotopic+injection+of+breast+cancer+cells+into+the+mammary+fat+pad+of+mice+to+study+tumor+growth.">Orthotopic injection of breast cancer cells into the mammary fat pad of mice to study tumor growth.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e51967 (2015).</li><li>Baker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+whole+picture.">The whole picture.</a> Nature. 463 (7283), 977-979 (2010).</li><li>Wang, Y., Tseng, J. -. C., Sun, Y., Beck, A. H., Kung, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+imaging+of+tumor+burden+and+molecular+pathways+in+mouse+models+of+cancer.">Noninvasive imaging of tumor burden and molecular pathways in mouse models of cancer.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (2), 135-144 (2015).</li><li>Kim, J. E., Kalimuthu, S., Ahn, B. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+cell+tracking+with+bioluminescence+imaging.">In vivo cell tracking with bioluminescence imaging.</a> Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 49 (1), 3-10 (2015).</li><li>Paschall, A. 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(115), e54040 (2016).</li><li>Zimmerman, M., Hu, X., Liu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+metastasis+and+CTL+adoptive+transfer+immunotherapy+mouse+model.">Experimental metastasis and CTL adoptive transfer immunotherapy mouse model.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (45), e2077 (2010).</li><li>Lv, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthotopic+transplantation+of+breast+tumors+as+preclinical+models+for+breast+cancer.">Orthotopic transplantation of breast tumors as preclinical models for breast cancer.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e61173 (2020).</li><li>Cheng, R. Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+triple+negative+breast+cancer+using+orthotopic+breast+cancer+model.">Studying triple negative breast cancer using orthotopic breast cancer model.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), e60316 (2020).</li><li>Bajikar, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-suppressor+inactivation+of+GDF11+occurs+by+precursor+sequestration+in+triple-negative+breast+cancer.">Tumor-suppressor inactivation of GDF11 occurs by precursor sequestration in triple-negative breast cancer.</a> Developmental Cell. 43 (4), 418-435 (2017).</li><li>Khatib, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glutathione+peroxidase+8+(GPX8)/IL-6/STAT3+axis+is+essential+in+maintaining+an+aggressive+breast+cancer+phenotype.">The glutathione peroxidase 8 (GPX8)/IL-6/STAT3 axis is essential in maintaining an aggressive breast cancer phenotype.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (35), 21420-21431 (2020).</li></ol>

Gli esperimenti su animali sono obbligatori per la ricerca sul cancro 7,8,9, e in effetti molti protocolli sono stati sviluppati 3,6,10,11,12,13,14. Tuttavia, la maggior parte di questi studi ha det...

I tumori al seno sono tipi frequenti di cancro in tutto il mondo, con circa 250.000 nuovi casi diagnosticati ogni anno negli Stati Uniti1. Nonostante la sua alta incidenza, una nuova serie di farmaci antitumorali ha migliorato significativamente gli esiti delle pazienti con cancro al seno2. Tuttavia, questi trattamenti sono ancora inadeguati, poiché molti pazienti sperimentano una recidiva della malattia e una diffusione metastatica agli organi vitali2, che è la causa principale della morbilità e della mortalità del paziente. Pertanto, una delle principali sfide nella ricerca sul cancro al seno è identificare i meccanismi molecolari che regolano la formazione di metastasi distali per sviluppare nuovi mezzi per inibire il loro sviluppo.
Le metastasi del cancro sono un processo dinamico in cui le cellule si staccano dal tumore primario e invadono i tessuti vicini attraverso la circolazione sanguigna. Pertanto, i modelli animali in cui le cellule subiscono una cascata metastatica simile possono facilitare l'identificazione dei meccanismi che governano questo processo 3,4. Inoltre, questi modelli in vivo sono essenziali per lo sviluppo di agenti terapeutici per il cancro al seno 5,6. Tuttavia, questi modelli ortotopici non possono indicare l'effettiva cinetica di crescita del tumore in quanto l'effetto è determinato solo al termine. Pertanto, abbiamo istituito uno strumento basato sulla luciferasi per rilevare lo sviluppo del tumore e la colonizzazione metastatica in tempo reale. Inoltre, queste cellule esprimono GFP per rilevare le colonie metastatiche. Questo approccio è relativamente semplice e non comporta alcuna procedura invasiva3. Pertanto, la combinazione di luciferasi e rilevamento della fluorescenza è una strategia utile per far progredire gli studi preclinici sulle terapie del cancro al seno e sulla gestione della malattia.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.7 mL eppendorf tubes</td>
			<td>Lifegene</td>
			<td>LMCT1.7B-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L tips</td>
			<td>Lifegene</td>
			<td>LRT10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L tips</td>
			<td>Lifegene</td>
			<td>LRT1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>Lifegene</td>
			<td>LTB15-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L tips</td>
			<td>Lifegene</td>
			<td>LRT200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well cell culture plate</td>
			<td>COSTAR</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well Plates BLACK flat bottom</td>
			<td>Bar Naor</td>
			<td>BN30496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated Cell Counters</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A50298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria III sorter</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Microlance 3 Needles 27 G (3/4&#39;&#39;)</td>
			<td>BD</td>
			<td>302200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Plastipak Syringes 1 mL x 120</td>
			<td>BD</td>
			<td>303172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 100 mm x 20 mm Style Dish</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 150 mm x 20 mm Style Dish</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>430599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess cell counting chamber slides</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium (DMEM), high glucose, no glutamine</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>01-055-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse 80i microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eppendorf Centrifuge 5810 R</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>EP5820740000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>04-127-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FUW GFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Gifted from Dr. Yossi Buganim&#39;s lab (Hebrew University of Jerusalem)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Gifted from Dr. Lior Nissim&#39;s lab (Hebrew University of Jerusalem)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane, USP Terrell</td>
			<td>Piramal</td>
			<td>NDC 66794-01-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Spectrum In Vivo Imaging System</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>124262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine Solution</td>
			<td>Biological industries</td>
			<td>03-020-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Image Software</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>bioluminescence measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF-7</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC HTB-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC HTB-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-468</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC HTB-132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes</td>
			<td>NORMAX</td>
			<td>2430-475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Hylabs</td>
			<td>BP655/500D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCMV-dR8.2-dvpr</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#8455</td>
			<td>Provided by David M. Sabatini&#8217;s lab (Whitehead institute, Boston, USA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCMV-VSV-G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#8454</td>
			<td>Provided by David M. Sabatini&#8217;s lab (Whitehead institute, Boston, USA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-031-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 90 mm (90x15)</td>
			<td>MINI PLAST</td>
			<td>820-090-01-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes 10ml</td>
			<td>Lifegene</td>
			<td>LG-GSP010010S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes 25ml</td>
			<td>Lifegene</td>
			<td>LG-GSP010050S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes 5ml</td>
			<td>Lifegene</td>
			<td>LG-GSP010005S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLX304 Luciferase-V5 blast plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#98580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>#107689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 9</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent Reservoirs</td>
			<td>Bar Naor</td>
			<td>BN20621STR200TC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMZ18 Stereo microscopes</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Bio-Lab</td>
			<td>190359400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filters</td>
			<td>Lifegene</td>
			<td>LG-FPV403030S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue 0.5% solution</td>
			<td>Biological industries</td>
			<td>03-102-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA Solution B (0.25%), EDTA (0.05%)</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-052-1a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum driven Filters</td>
			<td>SOFRA LIFE SCIENCE</td>
			<td>SPE-22-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virusolve</td>
			<td></td>
			<td>disinfectant</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VivoGlo Luciferin, In Vivo Grade</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>#6366236001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring breast cancer growth and metastatic colony formation in mice using bioluminescence

Il cancro al seno è una frequente neoplasia eterogenea e la seconda causa di mortalità nelle donne, principalmente a causa di metastasi di organi a distanza. Sono stati generati diversi modelli animali, tra cui i modelli murini ortotopici ampiamente utilizzati, in cui le cellule tumorali vengono iniettate nel cuscinetto di grasso mammario. Tuttavia, questi modelli non possono aiutare a monitorare la cinetica di crescita del tumore e la colonizzazione metastatica. Strumenti all'avanguardia per monitorare le cellule tumorali in tempo reale nei topi faranno progredire significativamente la comprensione della biologia tumorale. 
Qui sono state stabilite linee cellulari di cancro al seno che esprimono stabilmente luciferasi e proteina fluorescente verde (GFP). In particolare, questa tecnica contiene due passaggi sequenziali iniziati misurando l'attività della luciferasi in vitro e seguiti dall'impianto delle cellule tumorali in cuscinetti di grasso mammario di topi non obesi diabetici-gravi immunodeficienza combinata (NOD-SCID). Dopo l'iniezione, sia la crescita tumorale che la colonizzazione metastatica vengono monitorate in tempo reale dal sistema di imaging a bioluminescenza non invasivo. Quindi, la quantificazione delle metastasi che esprimono GFP nei polmoni sarà esaminata al microscopio a fluorescenza per convalidare i risultati di bioluminescenza osservati. Questo sofisticato sistema che combina luciferasi e strumenti di rilevamento basati sulla fluorescenza valuta le metastasi del cancro in vivo, che ha un grande potenziale per l'uso nelle terapie del cancro al seno e nella gestione della malattia.

Abbiamo generato linee cellulari di cancro al seno (MDA-MB-231, MCF-7 e MDA-MB-468) che esprimono vettori GFP e luciferasi. In particolare, questo è stato ottenuto da un'infezione sequenziale. In primo luogo, le linee cellulari del cancro al seno sono state infettate da un vettore di lentivirus che esprime GFP fluorescente. Le cellule GFP-positive (GFP+) sono state selezionate 2 giorni dopo l'infezione (Figura 1A,B) e infettate dal vettore pLX304 Luciferasi-V5. Q...

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Monitoring Breast Cancer Growth and Metastatic Colony Formation in Mice using Bioluminescence

Qui, descriviamo un metodo di monitoraggio non invasivo che coinvolge la luciferasi e l'espressione di proteine fluorescenti verdi in varie linee cellulari di cancro al seno. Questo protocollo fornisce una tecnica per monitorare la formazione del tumore e la colonizzazione metastatica in tempo reale nei topi.

Monitoraggio della crescita del cancro al seno e della formazione di colonie metastatiche nei topi utilizzando la bioluminescenza

Breast cancer is a frequent heterogeneous malignancy and the second leading cause of mortality in women, mainly due to distant organ metastasis. Several ...

Utilizzando questo sofisticato strumento non invasivo, possiamo monitorare in tempo reale la cinetica di crescita tumorale e la colonizzazione metastatica nei topi, che ha un grande potenziale nella terapia del cancro al seno e nella gestione della malattia. La combinazione di luciferasi e rilevamento della fluorescenza è una strategia utile per far progredire gli studi preclinici sulla progressione del cancro al seno e sulla gestione della malattia. Questo può essere applicato per studi di farmaci antitumorali.Questo protocollo non è limitato al cancro al seno e potrebbe essere applicato ad altri carcinomi, come il polmone e il pancreas. Inizia coltivando le cellule MCF-7, MDA-MB-468 e MDA-MB-231 GFP e luciferasi-positive separatamente in una piastra da 16 centimetri all'80% di confluenza. Dopo aver raccolto le cellule per tripsinizzazione, seminare un numero crescente di cellule in ciascun pozzo in un piatto nero da 96 pozzetti.Quindi, riempire tutti i pozzetti con 100 microlitri di DMEM e incubare per 16-24 ore in 37 gradi Celsius, incubatore a CO2 al 5%. Preparare la soluzione di luciferina in PBS a una concentrazione di 1,5 milligrammi per millilitro e conservare la soluzione a meno 20 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, lavare delicatamente le cellule con PBS prima di aggiungere 100 microlitri di soluzione di luciferina in ciascun pozzetto.Attendere due minuti, quindi misurare l'attività della luciferasi in tutte le cellule del cancro al seno utilizzando la bioluminescenza. Prima di iniettare il mouse, trasferire cinque milioni di cellule MCF-7 e MDA-MB-468 in 200 microlitri di PBS e due milioni di cellule MDA-MB-231 GFP e luciferasi positive in 100 microlitri PBS. Preparare il topo anestetizzato per l'iniezione posizionando un cono sopra la testa in posizione supina.Quindi, pulire l'area addominale del topo sopra la ghiandola mammaria con etanolo usando un batuffolo di cotone e sollevare la quarta ghiandola mammaria con una pinza prima di inserire un ago calibro 27 sotto il cuscinetto di grasso per iniettare lentamente 100 microlitri della sospensione cellulare preparata. Dopo l'iniezione, togliere il topo dal cappuccio e trasferirlo in una nuova gabbia sotto osservazione fino a quando non ritorna alla coscienza. Prima del rilevamento della bioluminescenza, trattenere il mouse cosciente tenendo il collo con la mano sinistra e inclinando la mano verso sinistra, con conseguente faccia del mouse verso l'alto con la parte inferiore del corpo in posizione supina.Iniettare 100 microlitri di 30 milligrammi per millilitro luciferina per via intraperitoneale nel quadrante addominale inferiore sinistro del topo usando una siringa da un millilitro. Tenere il mouse per sette minuti senza anestesia, seguiti da tre minuti all'interno della camera di anestesia prima di misurare la cinetica del tumore. Mentre il mouse è in incubazione, aprire il software e inizializzare il sistema di imaging facendo clic sul pulsante Inizializza.Mantenere la configurazione in esposizione automatica con il tempo di esposizione in auto a 60 secondi, il mezzo di binning a un'apertura di f / stop uno, il filtro di eccitazione bloccato e il filtro di emissione aperto. Al termine dell'inizializzazione, selezionare Imaging Wizard e Bioluminescence, quindi fare clic su Avanti, Apri filtro per selezionare il mouse nell'oggetto dell'immagine. Nella vista sul campo, selezionare lo stadio C a 10 centimetri e l'altezza del soggetto a 1,50 centimetri.Quindi, fare clic su Image Setup Stage per C.Assicurarsi che il mouse sia posizionato sullo stage nella posizione supina corretta prima di chiudere la porta e fare clic sul pulsante Acquisisci. Attendi che un'immagine appaia sullo schermo. Ripetere la procedura per l'altro mouse.Per rilevare le metastasi polmonari, coprire il forte segnale del tumore primario utilizzando una carta di cartone spessa ed esporre solo il lato ventrale dei polmoni verso la fotocamera. Acquisire l'immagine utilizzando gli stessi parametri descritti in precedenza. Le linee cellulari del cancro al seno sono state infettate da un vettore di lentivirus che esprime GFP fluorescente e soggetto a smistamento FAC.Le cellule GFP-positive sono state ordinate due giorni dopo l'infezione, placcate e visualizzate al microscopio a fluorescenza. L'attività della luciferasi in vitro è stata confermata con un aumento dipendente dal numero cellulare dei livelli di attività della luciferasi. Inoltre, è stata trovata una correlazione lineare tra l'attività della luciferasi e il numero di cellule.Dopo aver iniettato le linee cellulari del cancro al seno, i topi sono stati sottoposti a lettura di bioluminescenza ogni due settimane per determinare la cinetica di crescita del tumore. La cinetica di crescita tumorale era più veloce nelle linee cellulari MDA-MB-231 rispetto alle linee cellulari meno aggressive, MCF-7 e MDA-MB-468. L'attività di luminescenza è stata quantificata per tre linee cellulari.Sei settimane dopo l'iniezione, i tumori raccolti sono stati trovati per mantenere l'espressione GFP. Inoltre, letture positive di bioluminescenza sono state ottenute dal polmone dell'intero topo in tempo reale. Il polmone è stato raccolto per verificare le colonie metastatiche positive e le colonie metastatiche sono state osservate per GFP e bioluminescenza.È più importante fare attenzione durante l'esecuzione della procedura di iniezione. Un'iniezione impropria può portare a deviazione nel tasso di crescita del tumore o assenza di tumore. Possiamo esaminare le metastasi polmonari in vivo ed ex vivo rilevando l'espressione di GFP.Inoltre, possiamo anche studiare l'istopatologia dei polmoni mediante colorazione basata sull'immunoistochimica. Questa tecnica può essere utile per esplorare le nuove domande, come l'effetto degli studi sull'efficacia dei farmaci.

Research

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Cancer Research

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Ricerca

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