Name: monitoring breast cancer growth and metastatic colony formation in mice using bioluminescence
Uploaded: 2021-11-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Breast Cancer Growth and Metastatic Colony Formation in Mice using Bioluminescence at JoVE.com

Y.D.S. laboratuvarı üyelerine teşekkür ederiz. Kudüs'teki Hadassah Tıp Merkezi'ndeki Wohl Translasyonel Tıp Enstitüsü'ne küçük hayvan görüntüleme tesisini sağladığı için teşekkür ederiz. Bu çalışma, İsrail Kanser Araştırma Fonu'ndan Araştırma Kariyer Geliştirme Ödülü ile desteklenmiştir.

Tüm fare deneyleri, İbrani Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi onaylı protokol MD-21-16429-5 kapsamında gerçekleştirildi. Buna ek olarak, İbrani Üniversitesi Laboratuvar Hayvanları Bakımı Değerlendirme ve Akreditasyon Derneği (AAALAC) tarafından onaylanmıştır.
1. Hücre hattı bakımı
NOT: Bu protokolde insan meme kanseri hücre hatları (MCF-7, MDA-MB-468 ve MDA-MB-231) kullanılmıştır.
<ol><li>Dulbecco'nun modifiye...

<ol>
	<li>Waks, A. G., Winer, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+cancer+treatment:+A+review.">Breast cancer treatment: A review.</a> JAMA. 321 (3), 288-300 (2019).</li><li>Jin, X., Mu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+breast+cancer+metastasis.">Targeting breast cancer metastasis.</a> Breast Cancer: Basic and Clinical Research. 9, 23-34 (2015).</li><li>Saha, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+bioluminescence+imaging+of+tumor+hypoxia+dynamics+of+breast+cancer+brain+metastasis+in+a+mouse+model.">In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics of breast cancer brain metastasis in a mouse model.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (56), e3175 (2011).</li><li>Rashid, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+tail+vein+injection+a+relevant+breast+cancer+lung+metastasis+model.">Is tail vein injection a relevant breast cancer lung metastasis model.</a> Journal of Thoracic Disease. 5 (4), 385-392 (2013).</li><li>Fantozzi, A., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+breast+cancer+metastasis.">Mouse models of breast cancer metastasis.</a> Breast Cancer Research. 8 (4), 212 (2006).</li><li>Kocat&#252;rk, B., Versteeg, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthotopic+injection+of+breast+cancer+cells+into+the+mammary+fat+pad+of+mice+to+study+tumor+growth.">Orthotopic injection of breast cancer cells into the mammary fat pad of mice to study tumor growth.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e51967 (2015).</li><li>Baker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+whole+picture.">The whole picture.</a> Nature. 463 (7283), 977-979 (2010).</li><li>Wang, Y., Tseng, J. -. C., Sun, Y., Beck, A. H., Kung, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+imaging+of+tumor+burden+and+molecular+pathways+in+mouse+models+of+cancer.">Noninvasive imaging of tumor burden and molecular pathways in mouse models of cancer.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (2), 135-144 (2015).</li><li>Kim, J. E., Kalimuthu, S., Ahn, B. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+cell+tracking+with+bioluminescence+imaging.">In vivo cell tracking with bioluminescence imaging.</a> Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 49 (1), 3-10 (2015).</li><li>Paschall, A. V., Liu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+orthotopic+mouse+model+of+spontaneous+breast+cancer+metastasis.">An orthotopic mouse model of spontaneous breast cancer metastasis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (114), (2016).</li><li>Morten, B. C., Scott, R. J., Avery-Kiejda, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Three+Different+Methods+for+Determining+Cell+Proliferation+in+Breast+Cancer+Cell+Lines.">Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines.</a> Journal of Visualized Experiments. (115), e54040 (2016).</li><li>Zimmerman, M., Hu, X., Liu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+metastasis+and+CTL+adoptive+transfer+immunotherapy+mouse+model.">Experimental metastasis and CTL adoptive transfer immunotherapy mouse model.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (45), e2077 (2010).</li><li>Lv, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthotopic+transplantation+of+breast+tumors+as+preclinical+models+for+breast+cancer.">Orthotopic transplantation of breast tumors as preclinical models for breast cancer.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e61173 (2020).</li><li>Cheng, R. Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+triple+negative+breast+cancer+using+orthotopic+breast+cancer+model.">Studying triple negative breast cancer using orthotopic breast cancer model.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), e60316 (2020).</li><li>Bajikar, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-suppressor+inactivation+of+GDF11+occurs+by+precursor+sequestration+in+triple-negative+breast+cancer.">Tumor-suppressor inactivation of GDF11 occurs by precursor sequestration in triple-negative breast cancer.</a> Developmental Cell. 43 (4), 418-435 (2017).</li><li>Khatib, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glutathione+peroxidase+8+(GPX8)/IL-6/STAT3+axis+is+essential+in+maintaining+an+aggressive+breast+cancer+phenotype.">The glutathione peroxidase 8 (GPX8)/IL-6/STAT3 axis is essential in maintaining an aggressive breast cancer phenotype.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (35), 21420-21431 (2020).</li></ol>

Hayvan temelli deneyler kanser araştırmaları için zorunludur 7,8,9 ve gerçekten de birçok protokol geliştirilmiştir 3,6,10,11,12,13,14. Bununla birlikte, bu çalışmaların çoğu biyolojik...

Meme kanserleri dünya çapında sık görülen kanser türleridir ve Amerika Birleşik Devletleri'nde her yıl yaklaşık 250.000 yeni vaka teşhis edilmektedir1. Yüksek insidansına rağmen, yeni bir antikanser ilaç seti meme kanseri hasta sonuçlarını önemli ölçüde iyileştirmiştir2. Bununla birlikte, birçok hasta hastalık nüksetmesi ve hasta morbidite ve mortalitesinin birincil nedeni olan hayati organlara metastatik yayılım2 yaşadığından bu tedaviler hala yetersizdir. Bu nedenle, meme kanseri araştırmalarındaki temel zorluklardan biri, gelişimlerini engellemek için yeni araçlar geliştirmek üzere distal metastazların oluşumunu düzenleyen moleküler mekanizmaları tanımlamaktır.
Kanser metastazı, hücrelerin birincil tümörden ayrıldığı ve kan dolaşımı yoluyla komşu dokuları istila ettiği dinamik bir süreçtir. Böylece, hücrelerin benzer bir metastatik kaskaddan geçtiği hayvan modelleri, bu süreci yöneten mekanizmaların tanımlanmasını kolaylaştırabilir 3,4. Ek olarak, bu in vivo modeller meme kanseri terapötik ajanlarının geliştirilmesi için gereklidir 5,6. Bununla birlikte, bu ortotopik modeller gerçek tümör büyüme kinetiğini gösteremez, çünkü etki sadece sonlandırma üzerine belirlenir. Bu nedenle, tümör gelişimini ve metastatik kolonizasyonu gerçek zamanlı olarak tespit etmek için lusiferaz bazlı bir araç kurduk. Ek olarak, bu hücreler metastatik kolonileri tespit etmek için GFP'yi eksprese eder. Bu yaklaşım nispeten basittir ve herhangi bir invaziv prosedür içermez3. Bu nedenle, lusiferaz ve floresan tespitini birleştirmek, meme kanseri terapötikleri ve hastalık yönetimi ile ilgili klinik öncesi çalışmaları ilerletmek için yararlı bir stratejidir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.7 mL eppendorf tubes</td>
			<td>Lifegene</td>
			<td>LMCT1.7B-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L tips</td>
			<td>Lifegene</td>
			<td>LRT10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L tips</td>
			<td>Lifegene</td>
			<td>LRT1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>Lifegene</td>
			<td>LTB15-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L tips</td>
			<td>Lifegene</td>
			<td>LRT200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well cell culture plate</td>
			<td>COSTAR</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well Plates BLACK flat bottom</td>
			<td>Bar Naor</td>
			<td>BN30496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated Cell Counters</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A50298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria III sorter</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Microlance 3 Needles 27 G (3/4&#39;&#39;)</td>
			<td>BD</td>
			<td>302200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Plastipak Syringes 1 mL x 120</td>
			<td>BD</td>
			<td>303172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 100 mm x 20 mm Style Dish</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 150 mm x 20 mm Style Dish</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>430599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess cell counting chamber slides</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium (DMEM), high glucose, no glutamine</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>01-055-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse 80i microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eppendorf Centrifuge 5810 R</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>EP5820740000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>04-127-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FUW GFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Gifted from Dr. Yossi Buganim&#39;s lab (Hebrew University of Jerusalem)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Gifted from Dr. Lior Nissim&#39;s lab (Hebrew University of Jerusalem)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane, USP Terrell</td>
			<td>Piramal</td>
			<td>NDC 66794-01-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Spectrum In Vivo Imaging System</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>124262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine Solution</td>
			<td>Biological industries</td>
			<td>03-020-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Image Software</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>bioluminescence measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF-7</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC HTB-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC HTB-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-468</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC HTB-132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes</td>
			<td>NORMAX</td>
			<td>2430-475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Hylabs</td>
			<td>BP655/500D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCMV-dR8.2-dvpr</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#8455</td>
			<td>Provided by David M. Sabatini&#8217;s lab (Whitehead institute, Boston, USA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCMV-VSV-G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#8454</td>
			<td>Provided by David M. Sabatini&#8217;s lab (Whitehead institute, Boston, USA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-031-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 90 mm (90x15)</td>
			<td>MINI PLAST</td>
			<td>820-090-01-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes 10ml</td>
			<td>Lifegene</td>
			<td>LG-GSP010010S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes 25ml</td>
			<td>Lifegene</td>
			<td>LG-GSP010050S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes 5ml</td>
			<td>Lifegene</td>
			<td>LG-GSP010005S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLX304 Luciferase-V5 blast plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#98580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>#107689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 9</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent Reservoirs</td>
			<td>Bar Naor</td>
			<td>BN20621STR200TC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMZ18 Stereo microscopes</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Bio-Lab</td>
			<td>190359400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filters</td>
			<td>Lifegene</td>
			<td>LG-FPV403030S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue 0.5% solution</td>
			<td>Biological industries</td>
			<td>03-102-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA Solution B (0.25%), EDTA (0.05%)</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-052-1a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum driven Filters</td>
			<td>SOFRA LIFE SCIENCE</td>
			<td>SPE-22-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virusolve</td>
			<td></td>
			<td>disinfectant</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VivoGlo Luciferin, In Vivo Grade</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>#6366236001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring breast cancer growth and metastatic colony formation in mice using bioluminescence

Meme kanseri sık görülen heterojen bir malignitedir ve kadınlarda özellikle uzak organ metastazı nedeniyle mortalitenin ikinci önde gelen nedenidir. Kanser hücrelerinin meme yağ yastığına enjekte edildiği yaygın olarak kullanılan ortopik fare modelleri de dahil olmak üzere çeşitli hayvan modelleri oluşturulmuştur. Bununla birlikte, bu modeller tümör büyüme kinetiğini ve metastatik kolonizasyonu izlemeye yardımcı olamaz. Farelerde kanser hücrelerini gerçek zamanlı olarak izlemek için en yeni araçlar, tümör biyolojisinin anlaşılmasını önemli ölçüde ilerletecektir. 
Burada, lusiferaz ve yeşil floresan proteini (GFP) kararlı bir şekilde eksprese eden meme kanseri hücre hatları oluşturulmuştur. Spesifik olarak, bu teknik, in vitro lusiferaz aktivitesinin ölçülmesiyle başlatılan ve ardından kanser hücrelerinin obez olmayan diyabetik-şiddetli kombine immün yetmezlik (NOD-SCID) farelerinin meme yağ pedlerine implantasyonu ile başlatılan iki ardışık adım içerir. Enjeksiyondan sonra, hem tümör büyümesi hem de metastatik kolonizasyon, noninvaziv biyolüminesans görüntüleme sistemi tarafından gerçek zamanlı olarak izlenir. Daha sonra, akciğerlerdeki GFP eksprese eden metastazların miktarı, gözlemlenen biyolüminesans sonuçlarını doğrulamak için floresan mikroskobu ile incelenecektir. Lusiferaz ve floresan bazlı tespit araçlarını birleştiren bu sofistike sistem, meme kanseri terapötiklerinde ve hastalık yönetiminde kullanım için büyük potansiyele sahip olan kanser metastazını in vivo olarak değerlendirir.

GFP ve lusiferaz vektörlerini eksprese eden meme kanseri hücre hatları (MDA-MB-231, MCF-7 ve MDA-MB-468) ürettik. Spesifik olarak, bu sıralı bir enfeksiyon ile elde edildi. İlk olarak, meme kanseri hücre hatları, floresan GFP'yi eksprese eden bir lentivirüs vektörü ile enfekte edildi. GFP-pozitif hücreler (GFP +) enfeksiyondan 2 gün sonra sıralandı (Şekil 1A, B) ve pLX304 Luciferase-V5 vektörü ile enfekte edildi. Daha sonra, belirtilen (GFP <sup...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Breast Cancer Growth and Metastatic Colony Formation in Mice using Bioluminescence at JoVE.com

Monitoring Breast Cancer Growth and Metastatic Colony Formation in Mice using Bioluminescence

Burada, çeşitli meme kanseri hücre hatlarında lusiferaz ve yeşil floresan protein ekspresyonunu içeren noninvaziv bir izleme yöntemini tanımladık. Bu protokol, farelerde tümör oluşumunu ve metastatik kolonizasyonu gerçek zamanlı olarak izlemek için bir teknik sağlar.

Biyolüminesans Kullanarak Farelerde Meme Kanseri Büyümesi ve Metastatik Koloni Oluşumunun İzlenmesi

Breast cancer is a frequent heterogeneous malignancy and the second leading cause of mortality in women, mainly due to distant organ metastasis. Several ...

Bu sofistike, invaziv olmayan aracı kullanarak, meme kanseri tedavisi ve hastalık yönetiminde büyük bir potansiyele sahip olan farelerde tümör büyüme kinetiğini ve metastatik kolonizasyonu gerçek zamanlı olarak izleyebiliriz. Lusiferaz ve floresan tespitinin birleştirilmesi, meme kanseri progresyonu ve hastalık yönetimi ile ilgili klinik öncesi çalışmaları ilerletmek için yararlı bir stratejidir. Bu, antikanser ilaç çalışmaları için uygulanabilir.Bu protokol meme kanseri ile sınırlı değildir ve akciğer ve pankreas gibi diğer karsinomlara uygulanabilir. MCF-7, MDA-MB-468 ve MDA-MB-231 GFP ve lusiferaz pozitif hücreleri ayrı ayrı 16 santimetrelik bir plakada %80 akıcılığa kadar büyüterek başlayın. Hücreleri tripsinizasyonla topladıktan sonra, her bir kuyucukta artan sayıda hücreyi siyah bir 96 delikli plakaya tohumlayın.Ardından, tüm kuyucukları 100 mikrolitre DMEM ile doldurun ve 37 santigrat derece,% 5 CO2 inkübatöründe 16 ila 24 saat boyunca inkübe edin. PBS'de mililitre başına 1.5 miligram konsantrasyonda lusiferin çözeltisi hazırlayın ve çözeltiyi eksi 20 santigrat derecede saklayın. Kuluçka sonrası, her bir oyuğa 100 mikrolitre lusiferin çözeltisi eklemeden önce hücreleri PBS ile bir kez nazikçe yıkayın.İki dakika bekleyin ve ardından biyolüminesans kullanarak tüm meme kanseri hücrelerinde lusiferaz aktivitesini ölçün. Fareye enjekte etmeden önce, beş milyon MCF-7 ve MDA-MB-468 hücresini 200 mikrolitre PBS'ye ve iki milyon MDA-MB-231 GFP ve lusiferaz pozitif hücreleri 100 mikrolitre PBS'ye aktarın. Anestezi uygulanan fareyi, başın üzerine sırtüstü pozisyonda bir koni yerleştirerek enjeksiyon için hazırlayın.Daha sonra, farenin meme bezinin üzerindeki karın bölgesini pamuklu çubukla etanol ile silin ve hazırlanan hücre süspansiyonunun 100 mikrolitresini yavaşça enjekte etmek için yağ yastığının altına 27 gauge'lik bir iğne sokmadan önce dördüncü meme bezini forseps ile kaldırın. Enjeksiyondan sonra, fareyi kaputtan çıkarın ve bilince dönene kadar gözlem altında yeni bir kafese aktarın. Biyolüminesans tespitinden önce, bilinçli fareyi boynunu sol eliyle tutarak ve elini sola eğerek kısıtlayın, bu da farenin yüzünün yukarı doğru alt gövdesi sırtüstü pozisyonda olmasına neden olur.Bir mililitrelik bir şırınga kullanarak farenin sol alt karın çeyreğine intraperitoneal olarak mililitre başına 30 miligram lusiferin 100 mikrolitre enjekte edin. Fareyi anestezi olmadan yedi dakika boyunca tutun, ardından tümör kinetiğini ölçmeden önce anestezi odasında üç dakika bekleyin. Fare kuluçka altındayken, yazılımı açın ve Başlat düğmesine tıklayarak görüntüleme sistemini başlatın.Otomatik pozlama süresi 60 saniyede, bağlama ortamı f/stop one diyafram açıklığında, uyarma filtresi engellenmiş ve emisyon filtresi açık olacak şekilde kurulumu otomatik pozlamada tutun. Başlatma sona erdiğinde, Görüntüleme Sihirbazı ve Biyolüminesans'ı seçin ve ardından görüntü konusunda fareyi seçmek için İleri, Filtreyi Aç'ı tıklatın. Alan görünümünde, 10 santimetrede C aşamasını ve 1,50 santimetrede konu yüksekliğini seçin.Ardından, kapıyı kapatıp Al düğmesini tıklatmadan önce farenin sahne alanına uygun sırtüstü konumda yerleştirildiğinden emin olmak için Image Setup Stage'i (Görüntü Kurulum Aşaması) tıklatın. Ekranda bir görüntünün görünmesini bekleyin. Diğer fare için prosedürü tekrarlayın.Akciğer metastazını tespit etmek için, kalın bir karton kağıt kullanarak primer tümörün güçlü sinyalini örtün ve akciğerlerin sadece ventral tarafını kameraya doğru maruz bırakın. Daha önce açıklandığı gibi aynı parametreleri kullanarak görüntüyü yakalayın. Meme kanseri hücre hatları, floresan GFP'yi eksprese eden bir lentivirüs vektörü ile enfekte edildi ve FAC sıralamasına tabi tutuldu.GFP-pozitif hücreler enfeksiyondan iki gün sonra sıralandı, floresan mikroskopla kaplandı ve görselleştirildi. İn vitro lusiferaz aktivitesi, lusiferaz aktivite düzeylerinde hücre sayısına bağlı bir artış ile doğrulandı. Ek olarak, lusiferaz aktivitesi ile hücre sayısı arasında doğrusal bir korelasyon bulundu.Meme kanseri hücre hatları enjekte edildikten sonra, fareler tümör büyüme kinetiğini belirlemek için her iki haftada bir biyolüminesans okumasına tabi tutuldu. Tümör büyüme kinetiği, MDA-MB-231 hücre hatlarında, daha az agresif hücre hatları olan MCF-7 ve MDA-MB-468'den daha hızlıydı. Lüminesans aktivitesi üç hücre hattı için ölçüldü.Enjeksiyondan altı hafta sonra, hasat edilen tümörlerin GFP ekspresyonunu koruduğu bulundu. Ayrıca, tüm farenin akciğerinden gerçek zamanlı olarak pozitif biyolüminesans okumaları elde edildi. Pozitif metastatik kolonileri doğrulamak için akciğer toplandı ve GFP ve biyolüminesans için metastatik koloniler gözlendi.Enjeksiyon işlemini gerçekleştirirken dikkatli olmak daha önemlidir. Yanlış enjeksiyon, tümör büyüme hızında sapmaya veya tümör yokluğuna neden olabilir. GFP ekspresyonunu saptayarak, akciğer metastazını in vivo ve ex vivo olarak inceleyebiliriz.Ek olarak, immünohistokimya tabanlı boyama ile akciğerlerin histopatolojisini de inceleyebiliriz. Bu teknik, ilaç etkinliği çalışmalarının etkisi gibi yeni soruları keşfetmek için yararlı olabilir.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

İşlevsel Genomik Tarama kullanılması Kanser Hücre Sfero Kültürleri Potansiyel Yeni İlaç Hedefleri Belirlemek İçin

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

Tümör Büyüme ve metastaz Çalışmaları İzlenebilir Muhabirleri ile Meme Kanseri Hasta kaynaklı ksenogratflarının Etiketleme

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

Ultrasonographic Evaluation of Breast Cancer-related Lymphedema

Meme Kanseri ile ilgili Lenfödem Ultrasonografik Olarak Değerlendirilmesi

Lymphedema is one of the most common complications after breast cancer surgery. There are many diagnostic tools for lymphedema, but no standard method yet ...

Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay

Metastatik akciğer kolonizasyon pulmoner metastaz tahlil kullanarak osteosarkom içinde eğitim pratik düşünceler

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung ...

Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts

Preklinik antikanser Coumarin OT48 pulcuklarının, koloni oluşumu deneyleri ve zebra balığı Xenografts Bioactivity değerlendirilmesi

In vitro and in vivo pre-clinical screening of novel therapeutic agents are an essential tool in cancer drug discovery. Although human cancer cell lines ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mice Mammary Fat Pad

Fareler meme yağ yastığı içine meme kanser hücrelerinin Orthotopic enjeksiyon

A proper animal model is crucial for a better understanding of diseases. Animal models established by different methods (subcutaneous injections, ...

Performing Data Mining And Integrative Analysis Of Biomarker in Breast Cancer Using Multiple Publicly Accessible Databases

Veri madenciliği ve meme kanserinde biyomarker Integrative analizi gerçekleştirmek birden çok genel erişilebilir veritabanları kullanma

In recent years, emerging databases were designed to lower the barriers for approaching the intricate cancer genomic datasets, thereby, facilitating ...

In Vivo Inhibition of MicroRNA to Decrease Tumor Growth in Mice

Farelerde Tümör Büyümesini Azaltmak için MikroRNA'nın Vivo İnhibisyonu

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression through their ability to destabilize mRNA and inhibit translation of target mRNAs. An ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

Ortotopik Meme Kanseri Modeli Kullanarak Üçlü Negatif Meme Kanseri Eğitimi

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

Kuyruk Ven Metastaz Tahlilleri ve Gerçek Zamanlı Vivo Görüntüleme Kombine Kullanımı Meme Kanseri Metastatik Kolonizasyon ve Yük Akciğerlerde Quantify için

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...