Name: isolation and characterization of mouse primary liver sinusoidal endothelial cells
Uploaded: 2021-12-16T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من قبل المعهد الوطني للسكري وأمراض الجهاز الهضمي والكلى التابع للمعاهد الوطنية للصحة (1RO1DK122948 إلى SHI) وآلية منح NIH Silvio O. Conte Digestive Diseases Research Core Centers P30 (DK084567). كما تم تقديم الدعم إلى KF من قبل زمالات البحوث الخارجية للجمعية اليابانية لتعزيز العلوم (JSPS). نود أيضا أن نشيد بالدكتور غريغوري ج. غوريس وستيفن برونك على تصميمهما الأصلي وتحسينهما لجهاز تروية الكولاجيناز.

تم إجراء البروتوكولات الحيوانية على النحو المعتمد من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) في Mayo Clinic. تم شراء الفئران الذكور C57BL / 6J البالغة من العمر ثمانية أسابيع من مختبر جاكسون. تم وضع الفئران في منشأة دورة الضوء والظلام التي يتم التحكم في درجة حرارتها في الساعة 12:12 مع حري?...

<ol>
	<li>Morin, O., Goulet, F., Normand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+sinusoidal+endothelial+cells:+isolation,+purification,+characterization+and+interaction+with+hepatocytes.">Liver sinusoidal endothelial cells: isolation, purification, characterization and interaction with hepatocytes.</a> Revisiones Sobre Biologia Celular: RBC. 15, 1-85 (1988).</li><li>Ibrahim, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sinusoidal+endotheliopathy+in+nonalcoholic+steatohepatitis:+therapeutic+implications.">Sinusoidal endotheliopathy in nonalcoholic steatohepatitis: therapeutic implications.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 321 (1), 67-74 (2021).</li><li>Poisson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+sinusoidal+endothelial+cells:+Physiology+and+role+in+liver+diseases.">Liver sinusoidal endothelial cells: Physiology and role in liver diseases.</a> Journal of Hepatology. 66 (1), 212-227 (2017).</li><li>Marrone, G., Shah, V. H., Gracia-Sancho, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sinusoidal+communication+in+liver+fibrosis+and+regeneration.">Sinusoidal communication in liver fibrosis and regeneration.</a> Journal of Hepatology. 65 (3), 608-617 (2016).</li><li>Shetty, S., Lalor, P. F., Adams, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+sinusoidal+endothelial+cells+-+gatekeepers+of+hepatic+immunity.">Liver sinusoidal endothelial cells - gatekeepers of hepatic immunity.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. 15 (9), 555-567 (2018).</li><li>Smedsr&#248;d, B., Pertoft, H., Gustafson, S., Laurent, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scavenger+functions+of+the+liver+endothelial+cell.">Scavenger functions of the liver endothelial cell.</a> Biochemical Journal. 266 (2), 313-327 (1990).</li><li>DeLeve, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+sinusoidal+endothelial+cells+in+hepatic+fibrosis.">Liver sinusoidal endothelial cells in hepatic fibrosis.</a> Hepatology. 61 (5), 1740-1746 (2015).</li><li>Dar, W. A., Sullivan, E., Bynon, J. S., Eltzschig, H., Ju, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischaemia+reperfusion+injury+in+liver+transplantation:+Cellular+and+molecular+mechanisms.">Ischaemia reperfusion injury in liver transplantation: Cellular and molecular mechanisms.</a> Liver International. 39 (5), 788-801 (2019).</li><li>Furuta, K., Guo, Q., Hirsova, P., Ibrahim, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Roles+of+Liver+Sinusoidal+Endothelial+Cells+in+Nonalcoholic+Steatohepatitis.">Emerging Roles of Liver Sinusoidal Endothelial Cells in Nonalcoholic Steatohepatitis.</a> Biology. 9 (11), 395 (2020).</li><li>Wu, L. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+functional+differences+between+human+liver+cancer+endothelial+cells+and+liver+sinusoidal+endothelial+cells.">Phenotypic and functional differences between human liver cancer endothelial cells and liver sinusoidal endothelial cells.</a> Journal of Vascular Research. 45 (1), 78-86 (2008).</li><li>Meyer, J., Gonelle-Gispert, C., Morel, P., B&#252;hler, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+isolation+and+purification+of+murine+liver+sinusoidal+endothelial+cells:+A+systematic+review.">Methods for isolation and purification of murine liver sinusoidal endothelial cells: A systematic review.</a> PLoS One. 11 (3), 0151945 (2016).</li><li>Meyer, J., Lacotte, S., Morel, P., Gonelle-Gispert, C., Buhler, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+for+mouse+liver+sinusoidal+endothelial+cell+isolation.">An optimized method for mouse liver sinusoidal endothelial cell isolation.</a> Experimental Cell Research. 349 (2), 291-301 (2016).</li><li>Furuta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-induced+endothelial+vascular+cell+adhesion+molecule+1+promotes+nonalcoholic+steatohepatitis+pathogenesis.">Lipid-induced endothelial vascular cell adhesion molecule 1 promotes nonalcoholic steatohepatitis pathogenesis.</a> Journal of Clinical Investigation. 131 (6), (2021).</li><li>Guo, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+&#946;(1)-enriched+extracellular+vesicles+mediate+monocyte+adhesion+and+promote+liver+inflammation+in+murine+NASH.">Integrin &#946;(1)-enriched extracellular vesicles mediate monocyte adhesion and promote liver inflammation in murine NASH.</a> Journal of Hepatology. 71 (1), 1193-1205 (2019).</li><li>Hirsova, P., Ibrahim, S. H., Bronk, S. F., Yagita, H., Gores, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vismodegib+suppresses+TRAIL-mediated+liver+injury+in+a+mouse+model+of+nonalcoholic+steatohepatitis.">Vismodegib suppresses TRAIL-mediated liver injury in a mouse model of nonalcoholic steatohepatitis.</a> PLoS One. 8 (7), 70599 (2013).</li><li>Schrage, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+CD146+is+widely+expressed+on+endothelial+cells+and+is+recognized+by+the+monoclonal+antibody+ME-9F1.">Murine CD146 is widely expressed on endothelial cells and is recognized by the monoclonal antibody ME-9F1.</a> Histochemistry and Cell Biology. 129 (4), 441-451 (2008).</li><li>Olsavszky, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+transcriptomic+network+of+multi-ligand+scavenger+receptor+Stabilin-1-+and+Stabilin-2-deficient+liver+sinusoidal+endothelial+cells.">Exploring the transcriptomic network of multi-ligand scavenger receptor Stabilin-1- and Stabilin-2-deficient liver sinusoidal endothelial cells.</a> Gene. 768, 145284 (2021).</li><li>DeLeve, L. D., Maretti-Mira, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+sinusoidal+endothelial+cell:+An+update.">Liver sinusoidal endothelial cell: An update.</a> Seminars in Liver Disease. 37 (4), 377-387 (2017).</li><li>DeLeve, L. D., Wang, X., Hu, L., McCuskey, M. K., McCuskey, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+liver+sinusoidal+endothelial+cell+phenotype+is+maintained+by+paracrine+and+autocrine+regulation.">Rat liver sinusoidal endothelial cell phenotype is maintained by paracrine and autocrine regulation.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 287 (4), 757-763 (2004).</li><li>Cabral, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+hepatocytes+and+sinusoidal+endothelial+cells+from+mouse+liver+perfusion.">Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).</li><li>Ishiguro, K., Yan, I. K., Patel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+tissue+extracellular+vesicles+from+the+liver.">Isolation of tissue extracellular vesicles from the liver.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e58649 (2019).</li><li>Topp, S. A., Upadhya, G. A., Strasberg, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cold+preservation+of+isolated+sinusoidal+endothelial+cells+in+MMP+9+knockout+mice:+effect+on+morphology+and+platelet+adhesion.">Cold preservation of isolated sinusoidal endothelial cells in MMP 9 knockout mice: effect on morphology and platelet adhesion.</a> Liver Transplantation. 10 (8), 1041-1048 (2004).</li><li>Katz, S. C., Pillarisetty, V. G., Bleier, J. I., Shah, A. B., DeMatteo, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+sinusoidal+endothelial+cells+are+insufficient+to+activate+T+cells.">Liver sinusoidal endothelial cells are insufficient to activate T cells.</a> Journal of Immunology. 173 (1), 230-235 (2004).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+preparation+method+for+isolation+of+single-cell+types+from+mouse+liver+for+proteomic+studies.">Sample preparation method for isolation of single-cell types from mouse liver for proteomic studies.</a> Proteomics. 11 (17), 3556-3564 (2011).</li><li>Do, H., Healey, J. F., Waller, E. K., Lollar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+factor+VIII+by+murine+liver+sinusoidal+endothelial+cells.">Expression of factor VIII by murine liver sinusoidal endothelial cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (28), 19587-19592 (1999).</li><li>Schrage, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+T+cell+transmigration+across+the+murine+liver+sinusoidal+endothelium+is+mediated+by+transcytosis+and+surface+presentation+of+chemokines.">Enhanced T cell transmigration across the murine liver sinusoidal endothelium is mediated by transcytosis and surface presentation of chemokines.</a> Hepatology. 48 (4), 1262-1272 (2008).</li><li>Chou, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysophosphatidic+acid+alters+the+expression+profiles+of+angiogenic+factors,+cytokines,+and+chemokines+in+mouse+liver+sinusoidal+endothelial+cells.">Lysophosphatidic acid alters the expression profiles of angiogenic factors, cytokines, and chemokines in mouse liver sinusoidal endothelial cells.</a> PLoS One. 10 (3), 0122060 (2015).</li><li>Deleve, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dacarbazine+toxicity+in+murine+liver+cells:+a+model+of+hepatic+endothelial+injury+and+glutathione+defense.">Dacarbazine toxicity in murine liver cells: a model of hepatic endothelial injury and glutathione defense.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 268 (3), 1261-1270 (1994).</li><li>Smedsr&#248;d, B., Pertoft, H., Eggertsen, G., Sundstr&#246;m, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+morphological+characterization+of+cultures+of+Kupffer+cells+and+liver+endothelial+cells+prepared+by+means+of+density+separation+in+Percoll,+and+selective+substrate+adherence.">Functional and morphological characterization of cultures of Kupffer cells and liver endothelial cells prepared by means of density separation in Percoll, and selective substrate adherence.</a> Cell and Tissue Research. 241 (3), 639-649 (1985).</li><li>Despoix, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+CD146/MCAM+is+a+marker+of+natural+killer+cell+maturation.">Mouse CD146/MCAM is a marker of natural killer cell maturation.</a> European Journal of Immunology. 38 (10), 2855-2864 (2008).</li><li>Strauss, O., Phillips, A., Ruggiero, K., Bartlett, A., Dunbar, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+identifies+distinct+subsets+of+endothelial+cells+in+the+human+liver.">Immunofluorescence identifies distinct subsets of endothelial cells in the human liver.</a> Scientific Reports. 7, 44356 (2017).</li><li>Halpern, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paired-cell+sequencing+enables+spatial+gene+expression+mapping+of+liver+endothelial+cells.">Paired-cell sequencing enables spatial gene expression mapping of liver endothelial cells.</a> Nature Biotechnology. 36 (10), 962-970 (2018).</li></ol>

في المخطوطة الحالية ، نصف بروتوكولا لعزل LSEC عن كبد الفأر يتكون من تروية الكولاجيناز المكونة من خطوتين وفرز الخلايا المنشط مغناطيسيا اللاحق (MACS). يتكون هذا البروتوكول من الخطوات الثلاث التالية: (1) التروية من خلال الكهروضوئية مع مخزن مؤقت خال من الكالسيوم يليه مخزن مؤقت يحتوي على الكولاجينا...

تبطن الخلايا البطانية الجيبية الكبدية (LSECs) جدران الجيوب الأنفية الكبدية وهي الخلايا غير المتنية الأكثر وفرة في الكبد1. تتميز LSECs عن الخلايا البطانية الشعرية الأخرى في أماكن أخرى من الجسم بوجود fenestrae وعدم وجود غشاء قبو كلاسيكي أو غشاء 2,3. وبالتالي ، تمتلك LSECs خصائص مظهرية وهيكلية مميزة تعزز نفاذيتها وقدرتها على الخلايا الداخلية للقضاء على مجموعة متنوعة من الجزيئات الكبيرة المتداولة ، بما في ذلك الدهون والبروتينات الدهنية. تلعب LSECs دورا محوريا في التداخل بين الخلايا المتنية وغير المتنية ، مثل الخلايا النجمية والخلايا المناعية. LSECs هي المفتاح في الحفاظ على توازن الكبد عن طريق الحفاظ على الخلايا النجمية وخلايا كوبفر في حالة هادئة4. تقوم LSECs بتعديل تكوين مجموعات الخلايا المناعية الكبدية عن طريق التوسط في الالتصاق والهجرة عبر البطانية لكريات الدم البيضاء المتداولة 5,6. أثناء إصابة الكبد الحادة والمزمنة7 ، بما في ذلك إصابة نقص التروية (IRI) 8 ، والتهاب الكبد الدهني غير الكحولي (NASH)9 ، وسرطان الخلايا الكبدية (HCC) ، تخضع LSECs لتغيرات في النمط الظاهري تعرف باسم الشعيرات الدموية التي تتميز بنزع الشعر وتشكيل الغشاء السفلي10. ترتبط هذه التغيرات المظهرية في LSECs بخلل LSECs واكتساب خصائص prothrombotic و proinflammatory و profibrogenic.
تم تطوير عدة طرق لعزل LSECs من كبد الفأر11. تعتمد بعض التقنيات على فصل الخلايا غير المتنية والخلايا المتنية متبوعة بالطرد المركزي بتدرج الكثافة لتنقية LSECs من الكسور غير المتني. الحد من هذه الطريقة هو وجود البلاعم الملوثة في الخطوات النهائية لعزل LSECs ، والتي يمكن أن تؤثر على نقاء LSECs المعزولة12. يعتمد هذا البروتوكول على تروية الكولاجيناز لكبد الفأر و CD146 + الخرز المغناطيسي الاختيار الإيجابي للخلايا غير المتنية لتنقية LSECs. تظهر LSECs المعزولة باستخدام هذه الطريقة نقاء عاليا ومورفولوجيا محفوظة وقابلية للحياة. هذه LSECs هي الأمثل للدراسات الوظيفية ، بما في ذلك اختبار النفاذية والالتصاق ، وكذلك الدراسات النهائية للمسارات ذات الاهتمام. علاوة على ذلك ، مع الاهتمام المتزايد بتوليد مجموعات البيانات الضخمة في كل من الأبحاث السريرية وعلوم الاكتشاف ، يمكن تجميع أو استخدام هذه LSECs عالية الجودة المعزولة من كل من الكبد الدهني الصحي والمريضة مع التهاب الكبد الدهني غير الكحولي (NASH) أو غيرها من الحالات بشكل فردي ، مما يسمح بتوليد بيانات متعددة الأوميكس والمقارنة بين الصحة والمرض13,14 . بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام LSECs المعزولة لتطوير نماذج ثنائية الأبعاد وكذلك ثلاثية الأبعاد في المختبر مثل المواد العضوية لفك شفرة مسار الإشارات المنشط في LSECs واتصالها بين الخلايا مع خلايا الكبد الأخرى تحت محفزات ضارة مختلفة واستجابة لمختلف التدخلات العلاجية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2.0-inch 20 G Intra Venous (IV) catheter</td>
			<td>Terumo, SOmerset, NJ, USA</td>
			<td>SR-OX2051CA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#8211;3-inch perfuion tray with a hole in the center</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>customized; made in house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>405/520 viability dye</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-110-205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-inch regular curved dressing forceps</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>FS16-100-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-0 Perma-Hand silk suture</td>
			<td>Ethicon, Raritan, NJ, USA</td>
			<td>A182H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-stabilin-2 (Mouse) mAb-Alexa Fluor&#195; 488</td>
			<td>MBL International, Woburn, MA, USA</td>
			<td>D317-A48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA stock</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD146 (LSEC)-PE, anti-mouse</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-118-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD146 (LSEC) MicroBeads, mouse</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-092-007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD45-Viogreen, anti-mouse</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-110-803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen type I</td>
			<td>Corning, Corning, NY, USA</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase II</td>
			<td>Gibco, Waltham, MA, USA</td>
			<td>17101-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial cells growth medium</td>
			<td>ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>211-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FcR blocking reagent, mouse</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-092-575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo software, version 10.6</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardened Fine scissors</td>
			<td>F.S.T, Foster city, CA, USA</td>
			<td>14091-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated (37 &#176;C) and humidified recirculating perfusion apparatus equipped with Oxygen injection at a rate of 10psi.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>customized; made in house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hitachi S 4700 scanning electron microscope</td>
			<td>Hitachi Inc, Pleasanton, CA, USA</td>
			<td>SEM096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS columns</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS pre-separation filters (70 &#956;m)</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-095-823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS rinsing buffer</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-091-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Smart Strainer (70 &#956;m)</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-098-462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACSQunt flow cytometer</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell Cell Culture Insert</td>
			<td>Millipore Sigma, Burlington, MA, USA</td>
			<td>PITP01250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nexcelom cell counter</td>
			<td>Nexcelom bioscience, Lawrence, MA, USA</td>
			<td>Cellometer Auto T4 Plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare, Chicago, IL, USA</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>F.S.T, Foster city, CA, USA</td>
			<td>14001-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Very small curved dressing forceps</td>
			<td>F.S.T, Foster city, CA, USA</td>
			<td>11063-07</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of mouse primary liver sinusoidal endothelial cells

الخلايا البطانية الجيبية الكبدية (LSECs) هي خلايا بطانية متخصصة تقع في الواجهة بين الدورة الدموية وحمة الكبد. LSECs لها مورفولوجيا متميزة تتميز بوجود fenestrae وغياب الغشاء السفلي. تلعب LSECs أدوارا أساسية في العديد من الاضطرابات المرضية في الكبد ، بما في ذلك خلل التنظيم الأيضي ، والالتهابات ، والتليف ، وتكوين الأوعية الدموية ، والتسرطن. ومع ذلك ، لم يتم نشر سوى القليل حول عزل وتوصيف LSECs. هنا ، يناقش هذا البروتوكول عزل LSEC عن كل من الفئران الصحية وغير الكحولية لمرض الكبد الدهني (NAFLD). يعتمد البروتوكول على تروية الكولاجيناز لكبد الفأر والخرز المغناطيسي والاختيار الإيجابي للخلايا غير المتنية لتنقية LSECs. تميز هذه الدراسة LSECs باستخدام علامات محددة عن طريق قياس التدفق الخلوي وتحدد السمات الظاهرية المميزة عن طريق المسح المجهري الإلكتروني. يمكن استخدام LSECs المعزولة بعد هذا البروتوكول للدراسات الوظيفية ، بما في ذلك اختبارات الالتصاق والنفاذية ، بالإضافة إلى الدراسات النهائية لمسار معين من الاهتمام. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تجميع هذه LSECs أو استخدامها بشكل فردي ، مما يسمح بتوليد بيانات متعددة omics بما في ذلك RNA-seq السائبة أو خلية واحدة ، والبروتينات أو الفوسفو ، وفحص الكروماتين الذي يمكن الوصول إليه باستخدام التسلسل (ATAC-seq) ، من بين أمور أخرى. سيكون هذا البروتوكول مفيدا للباحثين الذين يدرسون اتصال LSECs مع خلايا الكبد الأخرى في الصحة والمرض ويسمح بفهم متعمق لدور LSECs في الآليات المسببة للأمراض لإصابات الكبد الحادة والمزمنة.

المخططات التجريبية والمعدات التي تم إعدادها: في هذا البروتوكول ، تم هضم كبد الفأر باستخدام دائرة تروية مغلقة ، ثم تم فصل الخلايا غير المتنية وخلايا الكبد عن طريق الطرد المركزي منخفض السرعة عند 50 × g لمدة 2 دقيقة. تم عزل LSECs الأولية باستخدام اختيار الخرز المغناطيسي CD146 من الكس?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells at JoVE.com

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

هنا نوجز ونوضح بروتوكولا لعزل الخلايا البطانية الجيبية الأولية لكبد الفأر (LSEC). يعتمد البروتوكول على تروية كولاجيناز الكبد ، وتنقية الخلايا غير المتنية عن طريق الطرد المركزي منخفض السرعة ، واختيار الخرزة المغناطيسية CD146. نحن أيضا النمط الظاهري ونوصيف هذه LSECs المعزولة باستخدام قياس التدفق الخلوي والمجهر الإلكتروني الماسح.

عزل وتوصيف الخلايا البطانية الجيبية الأولية للكبد الفأر

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...

هنا ، نوضح بروتوكولنا الخاص بعزل الخلايا الجيبية الأولية لكبد الفأر أو عزل LSECs. يتكون البروتوكول من تروية كولاجيناز الكبد والطرد المركزي الفائق السرعة منخفض السرعة لتنقية الخلايا غير المتنية واختيار الخرزة المغناطيسية CD146. طريقة عزل LSEC الخاصة بنا فعالة للغاية وقابلة للتطبيق على كبد الفأر الصحي والمريض.تعرض LSECs المعزولة نقاء عاليا وتحافظ على الهيكل والوظيفة. تعتبر LSECs المعزولة باستخدام هذا البروتوكول مثالية للدراسات الوظيفية والجزيئية وتوليد البيانات متعددة الأوميك. سيكون هذا البروتوكول مفيدا لدراسة الاتصال بين الخلايا في الكبد.ابدأ بطلاء أطباق الثقافة التي يبلغ طولها 10 سنتيمترات بثلاثة ملليلتر من محلول الكولاجين. ثم ، احتضن الأطباق في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. بعد ساعة ، قم بإزالة السائل الزائد من السطح المطلي.اغسل الأطباق باستخدام PBS ثلاث مرات واتركها لتجف في الهواء. قم بإعداد جهاز إعادة التدوير الساخن والرطب. شطف نظام التروية باستخدام 10٪ مبيض لمدة خمس دقائق.ثم اشطف النظام مرة أخرى بالماء المعقم لمدة 10 دقائق أخرى. صفي سائل الشطف قدر الإمكان قبل دمجه بمحلول الكولاجيناز. غرس محلول الكولاجيناز من خلال نظام التروية لتسخينه إلى 37 درجة مئوية.اضبط معدل المضخة على سرعة واحدة على قرص التحكم في السرعة. حافظ على السرعة كما هي طوال الإجراء بأكمله. وزن الماوس لهذا الإجراء.ثم قم بتأمينه على السطح الجراحي. رش بطن الفأر بنسبة 70٪ من الإيثانول. باستخدام المقص الجراحي ، قم بعمل شق يبلغ طوله حوالي خمسة سنتيمترات بدءا من الجزء السفلي من البطن حتى عملية الخنازير.بعد ذلك ، قم بإجراء قطعتين جانبيتين باستخدام مقص قزحية صغير على كل جانب من جوانب البطن لكشف أعضاء البطن بالكامل. ضع غمد القسطرة الوريدية تحت ظهر الحيوان لرفع البطن وتسويته. باستخدام ملقط ضمادة منحني منتظم ، اسحب الأمعاء والمعدة بلطف إلى يسار الحيوان.ثم ، ضع خياطة جراحية 5-0 تحت الوريد الأجوف السفلي ، أو IVC ، أسفل الكلى اليسرى المكشوفة مباشرة. اربط وصلة فضفاضة في الخياطة. بعد ذلك ، ضع خياطة جراحية أخرى 5-0 حول الوريد البابي الكبدي.ضع الخيط فوق نقطة تفرع الوريد الطحالي مباشرة في الوريد البابي الكبدي. مرة أخرى ، اربط عقبة فضفاضة في الخياطة. باستخدام خياطة الوريد البابي كشد ، أدخل القسطرة الوريدية ذات المقياس 20 في الوريد البابي الكبدي على بعد سنتيمتر واحد أدناه حيث تتفرع إلى الوريد البابي الكبدي الأيمن والأيسر.ثم، حرك القسطرة لأعلى الوريد، ولكن احتفظ بها أسفل منطقة التفرع. اسمح للدم بالانتقال إلى أسفل القسطرة حتى يبدأ في التنقيط. قم بتأمين القسطرة الوريدية باستخدام خياطة الوريد البابي.استخدم خطا IV لتوصيل زجاجة IV مع المخزن المؤقت A بالقسطرة. ثم اغسل الكبد بهذا المحلول مع تجنب دخول الهواء إلى النظام. اربط الخيط حول IVC أسفل الكلى.بعد ذلك ، قم بقطع IVC أسفل الخيط للسماح للحيوان بالنزيف. بمجرد التعطير ، اقطع المعدة والأمعاء والطحال والأحشاء الأخرى المرتبطة بالكبد. ثم ، قطع الحجاب الحاجز والأوعية الرئيسية من التجويف الصدري.إزالة الكبد من الحيوان ووضعه على صينية التروية. قم بإزالة الخط الوريدي بعناية وقم بتوصيل محلول الكولاجيناز في غرفة إعادة التدوير. اسمح للكبد بالنفاذ حتى تصبح الكبسولة نموذجية وتبدو طرية.يجب أن يستغرق هذا عادة من 10 إلى 15 دقيقة. بمجرد هضمه ، قم بإزالة الكبد من الغرفة وضعه على طبق بتري بطول 10 سم مع حوالي 20 ملليلتر من DMEM الخالي من المصل. اختر الكبد بلطف مع اثنين من نصائح الماصة وتخلص من الشجرة الصفراوية.بعد ذلك ، قم بتصفية تعليق الكبد من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر إلى أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلتر. جهاز الطرد المركزي لتعليق الخلية عند 50 مرة G لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. ثم ، جمع supernatant التي تحتوي على خلايا كبدية غير متني.جهاز الطرد المركزي الفائق عند 300 مرة G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. بعد ذلك ، قم بجمع حبيبات الخلية وإعادة تعليقها في ملليلتر واحد من العازلة المؤقتة. حدد رقم الخلية باستخدام عداد خلية تلقائي باتباع إرشادات الشركة المصنعة.بعد ذلك ، الطرد المركزي تعليق الخلية. قم بشفط السوبرناتانت بالكامل وإعادة تعليق الكريات مع 90 ميكرولتر من العازل العازل لكل 10 ملايين خلية. أضف 10 ميكرولترات من CD146 MicroBeads لكل 10 ملايين خلية إجمالية.اخلطيها جيدا واحتضنيها لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية. لغسل الخلايا ، أضف واحدا إلى ملليلترين من العزل العازل لكل 10 ملايين خلية. الطرد المركزي الحل في 300 مرات G لمدة 10 دقائق.بعد ذلك ، قم بشفط supernatant بالكامل وإعادة تعليق ما يصل إلى مليار خلية في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للعزل. بعد ذلك ، قم بإعداد عمود الفصل عن طريق شطفه بثلاثة ملليلترات من المخزن المؤقت للعزل. ضع تعليق الخلية على العمود المكدس بمرشحات الفصل المسبق التي تبلغ سعتها 70 ميكرومتر.اغسل العمود بثلاثة ملليلترات من العزل المؤقت ثلاث مرات. بعد ذلك ، قم بإزالة العمود من الفاصل وضعه على أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلتر. ماصة خمسة ملليلترات من العزل العازلة على العمود.لاستعادة الخلايا الموسومة بالخرز المغناطيسي ، ادفع المكبس بقوة إلى العمود لطرد الخلايا. وأخيرا، قم بالطرد المركزي للخلايا بسرعة 300 مرة G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. تم تقييم نقاء LSECs المعزولة وعلامات السطح باستخدام قياس التدفق الخلوي.يعتمد تحليل البيانات واستراتيجية البوابات ل LSECs المسورة والمفردات على بيانات التشتت الأمامي والتشتت الجانبي. تم تلطيخ LSECs المعزولة بصبغة قابلة للحياة ومزيج من الأجسام المضادة CD45 و CD146 و Stabilin-2. تم وضع بوابات LSECs القابلة للحياة على السكان السلبيين CD45 وتحليلها لتعبير CD146 و Stabilin-2.من هذه البيانات ، تم التأكيد على أن LSECs المعزولة لديها قابلية أكبر من 94٪ قابلة للحياة وأكبر من 90٪ نقاء. كما تم تأكيد النمط الظاهري الخاص ب LSEC للخلايا المعزولة باستخدام المجهر الضوئي والمجهر الإلكتروني الماسح. تم استزراع LSECs المعزولة في وسط النمو الكامل لمدة ست ساعات وفحصها بواسطة الفحص المجهري الخفيف.تشير الأسهم البيضاء في صورة SEM إلى LSEC fenestrae ، وهي سمة مورفولوجية مميزة ل LSECs. الخطوات الحاسمة لضمان التروية الكاملة لأنسجة الكبد هي تحديد موضع شريط القسطرة المناسب ، وتجنب إدخال الهواء في القسطرة ، والتوقيت الأمثل لهضم الكولاجيناز. إن LSEC عالي الجودة الذي تم الحصول عليه باستخدام بروتوكولنا سيسهل تحديد الآلية الجزيئية لوظيفة LSEC وسيحسن فهمنا لدورها في التواصل بين الخلايا في الكبد والصحة والمرض.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Valvular Endothelial Cells

عزل الخلايا البطانية صمامي

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Isolation &#38; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Isolation & Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

العزلة وتوصيف هويشت منخفضة CD45 السلبية ماوس خلايا الرئة الجذعية الوسيطة

Tissue resident mesenchymal stem cells (MSC) are important regulators of tissue repair or regeneration, fibrosis, inflammation, angiogenesis and tumor ...

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

عزل خلايا الأرومة الغاذية الابتدائية ماوس والأرومة الغاذية الفحص الغزو

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

عزلة الجنينية البطيني الخلايا البطانية

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

العزلة والثقافة من الماوس الأساسي خلايا البنكرياس عنيبية

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

عزل خلايا الفئران صمام غشائي

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

A Standardized Method for the Analysis of Liver Sinusoidal Endothelial Cells and Their Fenestrations by Scanning Electron Microscopy

طريقة موحدة لتحليل خلايا الكبد خاص بالمنحنى البطانية وFenestrations من خلال المجهر الإلكتروني

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

العزلة والثقافة الابتدائية من خلايا الفأر الأورطي غشائي

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells

بروتوكول لعزل خلايا الكبد الإنسان الابتدائية والموافق السكان الرئيسية للخلايا الكبد غير متني

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic ...

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

عزل خلايا الفأر التاجي غشائي

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...