Name: isolation and characterization of mouse primary liver sinusoidal endothelial cells
Uploaded: 2021-12-16T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases of the NIH (1RO1DK122948 til SHI) og NIH Silvio O. Conte Digestive Diseases Research Core Centers P30 tilskudsmekanisme (DK084567). Der blev også ydet støtte til KF af Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) Overseas Research Fellowships. Vi vil også gerne anerkende Dr. Gregory J. Gores og Steven Bronk for deres originale design og optimering af kollagenase perfusionsapparatet.

Dyreprotokoller blev udført som godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) fra Mayo Clinic. Otte uger gamle C57BL/6J hanmus blev købt fra Jackson Laboratory. Mus blev anbragt i et temperaturkontrolleret 12:12-timers lys-mørkt cyklusanlæg med fri adgang til kost.
1. Tilberedning af kollagenbelagt kulturskål eller tallerken
<ol><li>For at fremstille 50 ml 0,02 mol /l eddikesyre tilsættes 0,6 ml iseddike til 49,4 mlH20.</li>
	<li>Lav 50 μg...

<ol>
	<li>Morin, O., Goulet, F., Normand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+sinusoidal+endothelial+cells:+isolation,+purification,+characterization+and+interaction+with+hepatocytes.">Liver sinusoidal endothelial cells: isolation, purification, characterization and interaction with hepatocytes.</a> Revisiones Sobre Biologia Celular: RBC. 15, 1-85 (1988).</li><li>Ibrahim, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sinusoidal+endotheliopathy+in+nonalcoholic+steatohepatitis:+therapeutic+implications.">Sinusoidal endotheliopathy in nonalcoholic steatohepatitis: therapeutic implications.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 321 (1), 67-74 (2021).</li><li>Poisson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+sinusoidal+endothelial+cells:+Physiology+and+role+in+liver+diseases.">Liver sinusoidal endothelial cells: Physiology and role in liver diseases.</a> Journal of Hepatology. 66 (1), 212-227 (2017).</li><li>Marrone, G., Shah, V. H., Gracia-Sancho, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sinusoidal+communication+in+liver+fibrosis+and+regeneration.">Sinusoidal communication in liver fibrosis and regeneration.</a> Journal of Hepatology. 65 (3), 608-617 (2016).</li><li>Shetty, S., Lalor, P. F., Adams, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+sinusoidal+endothelial+cells+-+gatekeepers+of+hepatic+immunity.">Liver sinusoidal endothelial cells - gatekeepers of hepatic immunity.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. 15 (9), 555-567 (2018).</li><li>Smedsr&#248;d, B., Pertoft, H., Gustafson, S., Laurent, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scavenger+functions+of+the+liver+endothelial+cell.">Scavenger functions of the liver endothelial cell.</a> Biochemical Journal. 266 (2), 313-327 (1990).</li><li>DeLeve, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+sinusoidal+endothelial+cells+in+hepatic+fibrosis.">Liver sinusoidal endothelial cells in hepatic fibrosis.</a> Hepatology. 61 (5), 1740-1746 (2015).</li><li>Dar, W. A., Sullivan, E., Bynon, J. S., Eltzschig, H., Ju, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischaemia+reperfusion+injury+in+liver+transplantation:+Cellular+and+molecular+mechanisms.">Ischaemia reperfusion injury in liver transplantation: Cellular and molecular mechanisms.</a> Liver International. 39 (5), 788-801 (2019).</li><li>Furuta, K., Guo, Q., Hirsova, P., Ibrahim, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Roles+of+Liver+Sinusoidal+Endothelial+Cells+in+Nonalcoholic+Steatohepatitis.">Emerging Roles of Liver Sinusoidal Endothelial Cells in Nonalcoholic Steatohepatitis.</a> Biology. 9 (11), 395 (2020).</li><li>Wu, L. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+functional+differences+between+human+liver+cancer+endothelial+cells+and+liver+sinusoidal+endothelial+cells.">Phenotypic and functional differences between human liver cancer endothelial cells and liver sinusoidal endothelial cells.</a> Journal of Vascular Research. 45 (1), 78-86 (2008).</li><li>Meyer, J., Gonelle-Gispert, C., Morel, P., B&#252;hler, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+isolation+and+purification+of+murine+liver+sinusoidal+endothelial+cells:+A+systematic+review.">Methods for isolation and purification of murine liver sinusoidal endothelial cells: A systematic review.</a> PLoS One. 11 (3), 0151945 (2016).</li><li>Meyer, J., Lacotte, S., Morel, P., Gonelle-Gispert, C., Buhler, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+for+mouse+liver+sinusoidal+endothelial+cell+isolation.">An optimized method for mouse liver sinusoidal endothelial cell isolation.</a> Experimental Cell Research. 349 (2), 291-301 (2016).</li><li>Furuta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-induced+endothelial+vascular+cell+adhesion+molecule+1+promotes+nonalcoholic+steatohepatitis+pathogenesis.">Lipid-induced endothelial vascular cell adhesion molecule 1 promotes nonalcoholic steatohepatitis pathogenesis.</a> Journal of Clinical Investigation. 131 (6), (2021).</li><li>Guo, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+&#946;(1)-enriched+extracellular+vesicles+mediate+monocyte+adhesion+and+promote+liver+inflammation+in+murine+NASH.">Integrin &#946;(1)-enriched extracellular vesicles mediate monocyte adhesion and promote liver inflammation in murine NASH.</a> Journal of Hepatology. 71 (1), 1193-1205 (2019).</li><li>Hirsova, P., Ibrahim, S. H., Bronk, S. F., Yagita, H., Gores, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vismodegib+suppresses+TRAIL-mediated+liver+injury+in+a+mouse+model+of+nonalcoholic+steatohepatitis.">Vismodegib suppresses TRAIL-mediated liver injury in a mouse model of nonalcoholic steatohepatitis.</a> PLoS One. 8 (7), 70599 (2013).</li><li>Schrage, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+CD146+is+widely+expressed+on+endothelial+cells+and+is+recognized+by+the+monoclonal+antibody+ME-9F1.">Murine CD146 is widely expressed on endothelial cells and is recognized by the monoclonal antibody ME-9F1.</a> Histochemistry and Cell Biology. 129 (4), 441-451 (2008).</li><li>Olsavszky, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+transcriptomic+network+of+multi-ligand+scavenger+receptor+Stabilin-1-+and+Stabilin-2-deficient+liver+sinusoidal+endothelial+cells.">Exploring the transcriptomic network of multi-ligand scavenger receptor Stabilin-1- and Stabilin-2-deficient liver sinusoidal endothelial cells.</a> Gene. 768, 145284 (2021).</li><li>DeLeve, L. D., Maretti-Mira, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+sinusoidal+endothelial+cell:+An+update.">Liver sinusoidal endothelial cell: An update.</a> Seminars in Liver Disease. 37 (4), 377-387 (2017).</li><li>DeLeve, L. D., Wang, X., Hu, L., McCuskey, M. K., McCuskey, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+liver+sinusoidal+endothelial+cell+phenotype+is+maintained+by+paracrine+and+autocrine+regulation.">Rat liver sinusoidal endothelial cell phenotype is maintained by paracrine and autocrine regulation.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 287 (4), 757-763 (2004).</li><li>Cabral, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+hepatocytes+and+sinusoidal+endothelial+cells+from+mouse+liver+perfusion.">Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).</li><li>Ishiguro, K., Yan, I. K., Patel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+tissue+extracellular+vesicles+from+the+liver.">Isolation of tissue extracellular vesicles from the liver.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e58649 (2019).</li><li>Topp, S. A., Upadhya, G. A., Strasberg, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cold+preservation+of+isolated+sinusoidal+endothelial+cells+in+MMP+9+knockout+mice:+effect+on+morphology+and+platelet+adhesion.">Cold preservation of isolated sinusoidal endothelial cells in MMP 9 knockout mice: effect on morphology and platelet adhesion.</a> Liver Transplantation. 10 (8), 1041-1048 (2004).</li><li>Katz, S. C., Pillarisetty, V. G., Bleier, J. I., Shah, A. B., DeMatteo, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+sinusoidal+endothelial+cells+are+insufficient+to+activate+T+cells.">Liver sinusoidal endothelial cells are insufficient to activate T cells.</a> Journal of Immunology. 173 (1), 230-235 (2004).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+preparation+method+for+isolation+of+single-cell+types+from+mouse+liver+for+proteomic+studies.">Sample preparation method for isolation of single-cell types from mouse liver for proteomic studies.</a> Proteomics. 11 (17), 3556-3564 (2011).</li><li>Do, H., Healey, J. F., Waller, E. K., Lollar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+factor+VIII+by+murine+liver+sinusoidal+endothelial+cells.">Expression of factor VIII by murine liver sinusoidal endothelial cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (28), 19587-19592 (1999).</li><li>Schrage, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+T+cell+transmigration+across+the+murine+liver+sinusoidal+endothelium+is+mediated+by+transcytosis+and+surface+presentation+of+chemokines.">Enhanced T cell transmigration across the murine liver sinusoidal endothelium is mediated by transcytosis and surface presentation of chemokines.</a> Hepatology. 48 (4), 1262-1272 (2008).</li><li>Chou, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysophosphatidic+acid+alters+the+expression+profiles+of+angiogenic+factors,+cytokines,+and+chemokines+in+mouse+liver+sinusoidal+endothelial+cells.">Lysophosphatidic acid alters the expression profiles of angiogenic factors, cytokines, and chemokines in mouse liver sinusoidal endothelial cells.</a> PLoS One. 10 (3), 0122060 (2015).</li><li>Deleve, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dacarbazine+toxicity+in+murine+liver+cells:+a+model+of+hepatic+endothelial+injury+and+glutathione+defense.">Dacarbazine toxicity in murine liver cells: a model of hepatic endothelial injury and glutathione defense.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 268 (3), 1261-1270 (1994).</li><li>Smedsr&#248;d, B., Pertoft, H., Eggertsen, G., Sundstr&#246;m, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+morphological+characterization+of+cultures+of+Kupffer+cells+and+liver+endothelial+cells+prepared+by+means+of+density+separation+in+Percoll,+and+selective+substrate+adherence.">Functional and morphological characterization of cultures of Kupffer cells and liver endothelial cells prepared by means of density separation in Percoll, and selective substrate adherence.</a> Cell and Tissue Research. 241 (3), 639-649 (1985).</li><li>Despoix, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+CD146/MCAM+is+a+marker+of+natural+killer+cell+maturation.">Mouse CD146/MCAM is a marker of natural killer cell maturation.</a> European Journal of Immunology. 38 (10), 2855-2864 (2008).</li><li>Strauss, O., Phillips, A., Ruggiero, K., Bartlett, A., Dunbar, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+identifies+distinct+subsets+of+endothelial+cells+in+the+human+liver.">Immunofluorescence identifies distinct subsets of endothelial cells in the human liver.</a> Scientific Reports. 7, 44356 (2017).</li><li>Halpern, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paired-cell+sequencing+enables+spatial+gene+expression+mapping+of+liver+endothelial+cells.">Paired-cell sequencing enables spatial gene expression mapping of liver endothelial cells.</a> Nature Biotechnology. 36 (10), 962-970 (2018).</li></ol>

I det nuværende manuskript beskriver vi en protokol for LSEC-isolering fra muselever bestående af to-trins kollagenaseperfusion og efterfølgende magnetisk aktiveret cellesortering (MACS). Denne protokol består af følgende tre trin: (1) Perfusion gennem PV med en calciumfri buffer efterfulgt af en kollagenaseholdig buffer for at opnå levercelledispersion; 2) Udelukkelse af hepatocytter med centrifugering ved lav hastighed og (3) MACS-baseret positiv selektion af LDC'er fra ikke-parenkymale celler (NPC'er) ved hjælp...

Lever sinusformede endotelceller (LDC'er) linjer leverens sinusoidvægge og er de mest rigelige ikke-parenkymale celler i leveren1. LDC'er adskiller sig fra andre kapillære endotelceller andre steder i kroppen ved tilstedeværelsen af fenestrae og manglen på en klassisk kældermembran eller en membran 2,3. Derfor har LDC'erne karakteristiske fænotypiske og strukturelle egenskaber, der forbedrer deres permeabilitet og endocytiske kapacitet til at eliminere en række cirkulerende makromolekyler, herunder lipider og lipoproteiner. LSDC'er spiller en central rolle i krydstalen mellem parenkymale og ikke-parenkymale celler, såsom stellatceller og immunceller. LSDC'er er nøglen til at opretholde leverhomeostase ved at holde stellatcellerne og Kupffer-cellerne i en hvilende status4. LDC'er modulerer sammensætningen af leverimmuncellepopulationer ved at formidle vedhæftning og transendotelmigration af cirkulerende leukocytter 5,6. Under akut og kronisk leverskade7, herunder iskæmi-reperfusionsskade (IRI)8, ikke-alkoholisk steatohepatitis (NASH)9 og hepatocellulært carcinom (HCC), gennemgår LDC'er fænotypiske ændringer kendt som kapillarisering karakteriseret ved defenestration og dannelse af kældermembran10. Disse fænotypiske ændringer i LDC'er er forbundet med LSECs dysfunktion og erhvervelse af protrombotiske, proinflammatoriske og profibrogene egenskaber.
Flere metoder til isolering af LDC'er fra muselever er blevet udviklet11. Nogle teknikker afhænger af adskillelse af ikke-parenkymale og parenkymale celler efterfulgt af densitetsgradientcentrifugering for at rense LDC'erne fra ikke-parenkymale fraktioner. Begrænsningen af denne metode er tilstedeværelsen af forurenende makrofager i de sidste trin af LSEC's isolering, hvilket kan påvirke renheden af de isolerede LDC'er12. Denne protokol er baseret på kollagenaseperfusion af museleveren og CD146+ magnetiske perler positiv selektion af ikke-parenkymale celler til rensning af LDC'er. LDC'er isoleret ved hjælp af denne metode viser høj renhed og bevaret morfologi og levedygtighed. Disse LDC'er er optimale til funktionelle undersøgelser, herunder permeabilitet og vedhæftningsassay, samt downstream-undersøgelser for veje af interesse. Med den stigende interesse for at generere store datasæt inden for både klinisk forskning og opdagelsesvidenskab kan disse LDC'er af høj kvalitet, der er isoleret fra både sunde og syge lever med ikke-alkoholisk steatohepatitis (NASH) eller andre tilstande, desuden samles eller bruges individuelt, hvilket muliggør multi-omics datagenerering og sammenligning mellem sundhed og sygdom13,14 . Derudover kan de isolerede LDC'er anvendes til at udvikle todimensionelle såvel som tredimensionelle in vitro-modeller som organoider til at dechiffrere den aktiverede signalvej i LDC'er og deres intercellulære kommunikation med andre leverceller under forskellige skadelige stimuli og som reaktion på forskellige terapeutiske interventioner.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2.0-inch 20 G Intra Venous (IV) catheter</td>
			<td>Terumo, SOmerset, NJ, USA</td>
			<td>SR-OX2051CA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#8211;3-inch perfuion tray with a hole in the center</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>customized; made in house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>405/520 viability dye</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-110-205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-inch regular curved dressing forceps</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>FS16-100-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-0 Perma-Hand silk suture</td>
			<td>Ethicon, Raritan, NJ, USA</td>
			<td>A182H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-stabilin-2 (Mouse) mAb-Alexa Fluor&#195; 488</td>
			<td>MBL International, Woburn, MA, USA</td>
			<td>D317-A48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA stock</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD146 (LSEC)-PE, anti-mouse</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-118-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD146 (LSEC) MicroBeads, mouse</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-092-007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD45-Viogreen, anti-mouse</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-110-803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen type I</td>
			<td>Corning, Corning, NY, USA</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase II</td>
			<td>Gibco, Waltham, MA, USA</td>
			<td>17101-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial cells growth medium</td>
			<td>ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>211-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FcR blocking reagent, mouse</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-092-575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo software, version 10.6</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardened Fine scissors</td>
			<td>F.S.T, Foster city, CA, USA</td>
			<td>14091-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated (37 &#176;C) and humidified recirculating perfusion apparatus equipped with Oxygen injection at a rate of 10psi.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>customized; made in house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hitachi S 4700 scanning electron microscope</td>
			<td>Hitachi Inc, Pleasanton, CA, USA</td>
			<td>SEM096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS columns</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS pre-separation filters (70 &#956;m)</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-095-823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS rinsing buffer</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-091-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Smart Strainer (70 &#956;m)</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-098-462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACSQunt flow cytometer</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell Cell Culture Insert</td>
			<td>Millipore Sigma, Burlington, MA, USA</td>
			<td>PITP01250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nexcelom cell counter</td>
			<td>Nexcelom bioscience, Lawrence, MA, USA</td>
			<td>Cellometer Auto T4 Plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare, Chicago, IL, USA</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>F.S.T, Foster city, CA, USA</td>
			<td>14001-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Very small curved dressing forceps</td>
			<td>F.S.T, Foster city, CA, USA</td>
			<td>11063-07</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of mouse primary liver sinusoidal endothelial cells

Lever sinusformede endotelceller (LDC'er) er specialiserede endotelceller placeret ved grænsefladen mellem cirkulationen og leverparenchymen. LSDC'er har en særskilt morfologi karakteriseret ved tilstedeværelsen af fenestrae og fraværet af kældermembran. LDC'er spiller væsentlige roller i mange patologiske lidelser i leveren, herunder metabolisk dysregulering, inflammation, fibrose, angiogenese og carcinogenese. Der er dog ikke offentliggjort meget om isolationen og karakteriseringen af LDC'erne. Her diskuterer denne protokol isoleringen af LSEC fra både sunde og ikke-alkoholiske fedtleversygdomme (NAFLD) mus. Protokollen er baseret på kollagenaseperfusion af museleveren og magnetiske perler positiv selektion af ikke-parenkymale celler for at rense LDC'er. Denne undersøgelse karakteriserer LDC'er ved hjælp af specifikke markører ved flowcytometri og identificerer de karakteristiske fænotypiske træk ved scanning af elektronmikroskopi. LDC'er isoleret efter denne protokol kan bruges til funktionelle undersøgelser, herunder adhæsions- og permeabilitetsassays, samt downstream-undersøgelser for en bestemt vej af interesse. Derudover kan disse LDC'er samles eller anvendes individuelt, hvilket muliggør multi-omics-datagenerering, herunder RNA-seq bulk eller enkeltcelle, proteomisk eller phospho-proteomik og assay til transposase-tilgængelig kromatin ved hjælp af sekventering (ATAC-seq), blandt andre. Denne protokol vil være nyttig for efterforskere, der studerer LDC'ers kommunikation med andre leverceller inden for sundhed og sygdom og giver en dybdegående forståelse af LDC'ernes rolle i de patogene mekanismer for akut og kronisk leverskade.

Eksperimentelle skemaer og opsætning af udstyr: I denne protokol blev muselever fordøjet ved hjælp af et lukket perfusionskredsløb, hvorefter ikke-parenkymale celler og hepatocytter blev adskilt ved centrifugering ved lav hastighed ved 50 x g i 2 minutter. Primære LDC'er blev isoleret ved hjælp af CD146 magnetiske perler udvælgelse fra den ikke-parenkymale fraktion. De eksperimentelle skemaer er vist i figur 1A. Kanylen blev anbragt gennem PV, mens den rin...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells at JoVE.com

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

Her skitserer og demonstrerer vi en protokol for primær muselever sinusformet endotelcelle (LSEC) isolering. Protokollen er baseret på leverkollagennaseperfusion, ikke-parenkymal cellerensning ved centrifugering ved lavhastighedscentrifugering og CD146 magnetisk perlevalg. Vi fænotype og karakteriserer også disse isolerede LDC'er ved hjælp af flowcytometri og scanningselektronmikroskopi.

Isolering og karakterisering af musens primære lever sinusformede endotelceller

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...

Her demonstrerer vi vores protokol for primær muselever sinusformet celleisolering eller LSECs isolering. Protokollen består af leverkollagenaseperfusion og lavhastigheds ultracentrifugation til ikke-parenkymcellerensning og CD146 magnetisk perlevalg. Vores LSEC-isolationsmetode er yderst effektiv og anvendelig på sund og syg muselever.De isolerede LDC'er udviser høj renhed og bevarer strukturen og funktionen. LDC'er isoleret ved hjælp af denne protokol er optimale til funktionelle og molekylære undersøgelser og multi-omics datagenerering. Denne protokol vil være nyttig til at studere intercellulær kommunikation i leveren.Begynd med at belægge 10 centimeter kulturskåle med tre milliliter kollagenopløsning. Derefter inkuberes opvasken ved stuetemperatur i en time. Efter en time skal du fjerne overskydende væske fra den belagte overflade.Vask opvasken med PBS tre gange og lad dem lufttørre. Opsæt det opvarmede og befugtede recirkulerende perfusionsapparat. Skyl perfusionssystemet med 10% blegemiddel i fem minutter.Skyl derefter systemet igen med sterilt vand i yderligere 10 minutter. Tøm skyllevæsken så meget som muligt, før den perfuseres med kollagenaseopløsning. Tilsæt collagenaseopløsningen gennem perfusionssystemet for at forvarme den til 37 grader Celsius.Indstil pumpehastigheden til hastighed en på hastighedskontrolhjulet. Hold hastigheden den samme under hele proceduren. Vej musen til proceduren.Fastgør det derefter til den kirurgiske overflade. Sprøjt musens mave med 70% ethanol. Brug kirurgisk saks til at lave et snit på cirka fem centimeter startende fra den nederste del af maven op til xiphoid-processen.Derefter foretages to laterale snit ved hjælp af en lille irissaks på hver side af maven for at udsætte abdominale organer fuldt ud. Placer kappen af IV-kateteret under dyrets ryg for at løfte og udjævne maven. Brug en regelmæssig buet dressing tang, træk forsigtigt tarmene og maven ud til venstre for dyret.Placer derefter en 5-0 kirurgisk sutur under den ringere vena cava eller IVC lige under den udsatte venstre nyre. Bind et løst træk i suturen. Placer derefter en anden 5-0 kirurgisk sutur omkring leverportalvenen.Placer suturen lige over det miltveneforgreningspunkt i leverportalvenen. Bind igen et løst træk i suturen. Brug portalvenesuguren som spænding til at indsætte 20-gauge IV-kateteret i leverportalvenen en centimeter under, hvor den forgrener sig til højre og venstre leverportalvene.Skub derefter kateteret op ad venen, men hold det under forgreningsområdet. Lad blodet bevæge sig ned i kateteret, indtil det begynder at dryppe ud. Fastgør IV-kateteret med portalvenesusturen.Brug en IV-linje til at fastgøre en IV-flaske med buffer A til kateteret. Skyl derefter leveren med denne opløsning, mens du undgår luftindtrængning i systemet. Bind suturen omkring IVC under nyren.Derefter skæres IVC under suturen for at lade dyret bløde ud. Når perfusing, skære væk maven, tarmene, milten og andre indvolde, der er fastgjort til leveren. Skær derefter membranen og de store kar væk fra brysthulen.Fjern leveren fra dyret og læg den på perfusionsbakken. Fjern forsigtigt IV-linjen og tilslut kollagenaseopløsningen i recirkulationskammeret. Lad leveren perfuse, indtil kapslen bliver modelleret og fremstår grødet.Dette bør typisk tage 10 til 15 minutter. Når den er fordøjet, skal du fjerne leveren fra kammeret og placere den på en 10 centimeter petriskål med ca. 20 ml serumfri DMEM. Pluk forsigtigt leveren fra hinanden med et par pipettespidser og kassér galdetræet.Derefter filtreres leversuspensionen gennem en 70 mikrometer cellesil i et 50 ml konisk rør. Centrifugering af cellesuspensionen ved 50 gange G i to minutter ved stuetemperatur. Saml derefter supernatanten indeholdende ikke-parenkymale leverceller.Centrifugering af supernatanten ved 300 gange G i fem minutter ved fire grader Celsius. Derefter samles cellepillen og suspenderes igen i en milliliter isolationsbuffer. Bestem cellenummeret ved hjælp af en automatisk celletæller efter producentens anvisninger.Centrifuger derefter cellesuspensionen. Aspirer supernatanten helt og resuspend pellet med 90 mikroliter isolationsbuffer pr. 10 millioner celler. Tilføj 10 mikroliter CD146 MicroBeads pr. 10 millioner celler i alt.Bland det godt og inkuber i 15 minutter ved fire grader Celsius. For at vaske cellerne skal du tilføje en til to milliliter isolationsbuffer pr. 10 millioner celler. Centrifugeres opløsningen ved 300 gange G i 10 minutter.Derefter aspirerer supernatanten helt og genanvender op til en milliard celler i 500 mikroliter isolationsbuffer. Forbered derefter separationskolonnen ved at skylle den med tre milliliter isolationsbuffer. Påfør cellesuspensionen på søjlen stablet med 70 mikrometer præseparationsfiltre.Vask søjlen med tre milliliter isolationsbuffer tre gange. Derefter fjernes søjlen fra separatoren og placeres på et 15 ml centrifugerør. Pipette fem milliliter isolationsbuffer på søjlen.For at gendanne de magnetiske perlemærkede celler skal du skubbe stemplet fast i søjlen for at skylle cellerne ud. Endelig centrifugeres cellerne ved 300 gange G i fem minutter ved fire grader Celsius. Isolerede LDC'er renhed og overflademarkører blev vurderet med flowcytometri.Dataanalyse og gating-strategi for gated LSEC'er og singlets er baseret på forward scatter- og side scatter-data. Isolerede LDC'er blev farvet med et levedygtighedsfarvestof og en kombination af CD45-, CD146- og Stabilin-2-antistoffer. Levedygtige LDC'er blev gated på CD45 negativ population og analyseret for CD146 og Stabilin-2 ekspression.Ud fra disse data blev det bekræftet, at de isolerede LDC'er havde større end 94% levedygtighed og større end 90% renhed. Den LSEC-specifikke fænotype af de isolerede celler blev yderligere bekræftet ved hjælp af lysmikroskopi og scanningselektronmikroskopi. Isolerede LDC'er blev dyrket i det komplette vækstmedium i seks timer og undersøgt ved lysmikroskopi.De hvide pile i SEM-billedet angiver LSEC fenestrae, som er et karakteristisk morfologisk træk ved LSDC'er. De kritiske trin for at sikre fuldstændig perfusion af et levervæv er korrekt kateterbåndpositionering, undgå indføring af luft i kateteret og den optimale timing af kollagenasefordøjelsen. LSEC af høj kvalitet erhvervet ved hjælp af vores protokol vil lette identifikationen af den molekylære mekanisme for LSEC-funktion og vil forbedre vores forståelse af deres rolle i intercellulær kommunikation i leveren, i sundhed og i sygdom.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Isolation &#38; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Isolation & Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Isolering og Karakterisering af Hoechst Lav CD45 Negative Mus Lung mesenchymale stamceller

Tissue resident mesenchymal stem cells (MSC) are important regulators of tissue repair or regeneration, fibrosis, inflammation, angiogenesis and tumor ...

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Isolering af embryonale Ventrikulære endotelceller

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Isolering og dyrkning af Mouse Primære Pancreas acinarceller

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Isolering af murint Ventil endotelceller

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

A Standardized Method for the Analysis of Liver Sinusoidal Endothelial Cells and Their Fenestrations by Scanning Electron Microscopy

En standardiseret metode til analyse af Liver Sinusformet endotelceller og deres fenestrationer af Scanning Electron Microscopy

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolering og primær kultur af muse aortaendotelceller

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells

Protokol til Isolering af primære humane hepatocytter og Tilsvarende Major populationer af ikke-parenchymale leverceller

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic ...

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

Isolering af Mouse koronar endotelceller

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...