Name: isolation and characterization of mouse primary liver sinusoidal endothelial cells
Uploaded: 2021-12-16T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door het National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases van de NIH (1RO1DK122948 tot SHI) en het NIH Silvio O. Conte Digestive Diseases Research Core Centers P30-subsidiemechanisme (DK084567). Ondersteuning werd ook aan KF verleend door de Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) Overseas Research Fellowships. We willen ook Dr. Gregory J. Gores en Steven Bronk bedanken voor hun oorspronkelijke ontwerp en optimalisatie van het collagenase-perfusieapparaat.

Dierprotocollen werden uitgevoerd zoals goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van Mayo Clinic. Acht weken oude C57BL / 6J mannelijke muizen werden gekocht bij Jackson Laboratory. Muizen werden gehuisvest in een temperatuurgecontroleerde 12:12-uur licht-donkercyclusfaciliteit met gratis toegang tot dieet.
1. Bereiding van met collageen beklede kweekschaal of -plaat
<ol><li>Om 50 ml 0,02 mol / l azijnzuur te maken, voegt u 0,6 ml ijsazijn toe...

<ol>
	<li>Morin, O., Goulet, F., Normand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+sinusoidal+endothelial+cells:+isolation,+purification,+characterization+and+interaction+with+hepatocytes.">Liver sinusoidal endothelial cells: isolation, purification, characterization and interaction with hepatocytes.</a> Revisiones Sobre Biologia Celular: RBC. 15, 1-85 (1988).</li><li>Ibrahim, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sinusoidal+endotheliopathy+in+nonalcoholic+steatohepatitis:+therapeutic+implications.">Sinusoidal endotheliopathy in nonalcoholic steatohepatitis: therapeutic implications.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 321 (1), 67-74 (2021).</li><li>Poisson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+sinusoidal+endothelial+cells:+Physiology+and+role+in+liver+diseases.">Liver sinusoidal endothelial cells: Physiology and role in liver diseases.</a> Journal of Hepatology. 66 (1), 212-227 (2017).</li><li>Marrone, G., Shah, V. H., Gracia-Sancho, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sinusoidal+communication+in+liver+fibrosis+and+regeneration.">Sinusoidal communication in liver fibrosis and regeneration.</a> Journal of Hepatology. 65 (3), 608-617 (2016).</li><li>Shetty, S., Lalor, P. F., Adams, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+sinusoidal+endothelial+cells+-+gatekeepers+of+hepatic+immunity.">Liver sinusoidal endothelial cells - gatekeepers of hepatic immunity.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. 15 (9), 555-567 (2018).</li><li>Smedsr&#248;d, B., Pertoft, H., Gustafson, S., Laurent, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scavenger+functions+of+the+liver+endothelial+cell.">Scavenger functions of the liver endothelial cell.</a> Biochemical Journal. 266 (2), 313-327 (1990).</li><li>DeLeve, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+sinusoidal+endothelial+cells+in+hepatic+fibrosis.">Liver sinusoidal endothelial cells in hepatic fibrosis.</a> Hepatology. 61 (5), 1740-1746 (2015).</li><li>Dar, W. A., Sullivan, E., Bynon, J. S., Eltzschig, H., Ju, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischaemia+reperfusion+injury+in+liver+transplantation:+Cellular+and+molecular+mechanisms.">Ischaemia reperfusion injury in liver transplantation: Cellular and molecular mechanisms.</a> Liver International. 39 (5), 788-801 (2019).</li><li>Furuta, K., Guo, Q., Hirsova, P., Ibrahim, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Roles+of+Liver+Sinusoidal+Endothelial+Cells+in+Nonalcoholic+Steatohepatitis.">Emerging Roles of Liver Sinusoidal Endothelial Cells in Nonalcoholic Steatohepatitis.</a> Biology. 9 (11), 395 (2020).</li><li>Wu, L. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+functional+differences+between+human+liver+cancer+endothelial+cells+and+liver+sinusoidal+endothelial+cells.">Phenotypic and functional differences between human liver cancer endothelial cells and liver sinusoidal endothelial cells.</a> Journal of Vascular Research. 45 (1), 78-86 (2008).</li><li>Meyer, J., Gonelle-Gispert, C., Morel, P., B&#252;hler, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+isolation+and+purification+of+murine+liver+sinusoidal+endothelial+cells:+A+systematic+review.">Methods for isolation and purification of murine liver sinusoidal endothelial cells: A systematic review.</a> PLoS One. 11 (3), 0151945 (2016).</li><li>Meyer, J., Lacotte, S., Morel, P., Gonelle-Gispert, C., Buhler, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+for+mouse+liver+sinusoidal+endothelial+cell+isolation.">An optimized method for mouse liver sinusoidal endothelial cell isolation.</a> Experimental Cell Research. 349 (2), 291-301 (2016).</li><li>Furuta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-induced+endothelial+vascular+cell+adhesion+molecule+1+promotes+nonalcoholic+steatohepatitis+pathogenesis.">Lipid-induced endothelial vascular cell adhesion molecule 1 promotes nonalcoholic steatohepatitis pathogenesis.</a> Journal of Clinical Investigation. 131 (6), (2021).</li><li>Guo, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+&#946;(1)-enriched+extracellular+vesicles+mediate+monocyte+adhesion+and+promote+liver+inflammation+in+murine+NASH.">Integrin &#946;(1)-enriched extracellular vesicles mediate monocyte adhesion and promote liver inflammation in murine NASH.</a> Journal of Hepatology. 71 (1), 1193-1205 (2019).</li><li>Hirsova, P., Ibrahim, S. H., Bronk, S. F., Yagita, H., Gores, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vismodegib+suppresses+TRAIL-mediated+liver+injury+in+a+mouse+model+of+nonalcoholic+steatohepatitis.">Vismodegib suppresses TRAIL-mediated liver injury in a mouse model of nonalcoholic steatohepatitis.</a> PLoS One. 8 (7), 70599 (2013).</li><li>Schrage, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+CD146+is+widely+expressed+on+endothelial+cells+and+is+recognized+by+the+monoclonal+antibody+ME-9F1.">Murine CD146 is widely expressed on endothelial cells and is recognized by the monoclonal antibody ME-9F1.</a> Histochemistry and Cell Biology. 129 (4), 441-451 (2008).</li><li>Olsavszky, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+transcriptomic+network+of+multi-ligand+scavenger+receptor+Stabilin-1-+and+Stabilin-2-deficient+liver+sinusoidal+endothelial+cells.">Exploring the transcriptomic network of multi-ligand scavenger receptor Stabilin-1- and Stabilin-2-deficient liver sinusoidal endothelial cells.</a> Gene. 768, 145284 (2021).</li><li>DeLeve, L. D., Maretti-Mira, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+sinusoidal+endothelial+cell:+An+update.">Liver sinusoidal endothelial cell: An update.</a> Seminars in Liver Disease. 37 (4), 377-387 (2017).</li><li>DeLeve, L. D., Wang, X., Hu, L., McCuskey, M. K., McCuskey, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+liver+sinusoidal+endothelial+cell+phenotype+is+maintained+by+paracrine+and+autocrine+regulation.">Rat liver sinusoidal endothelial cell phenotype is maintained by paracrine and autocrine regulation.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 287 (4), 757-763 (2004).</li><li>Cabral, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+hepatocytes+and+sinusoidal+endothelial+cells+from+mouse+liver+perfusion.">Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).</li><li>Ishiguro, K., Yan, I. K., Patel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+tissue+extracellular+vesicles+from+the+liver.">Isolation of tissue extracellular vesicles from the liver.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e58649 (2019).</li><li>Topp, S. A., Upadhya, G. A., Strasberg, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cold+preservation+of+isolated+sinusoidal+endothelial+cells+in+MMP+9+knockout+mice:+effect+on+morphology+and+platelet+adhesion.">Cold preservation of isolated sinusoidal endothelial cells in MMP 9 knockout mice: effect on morphology and platelet adhesion.</a> Liver Transplantation. 10 (8), 1041-1048 (2004).</li><li>Katz, S. C., Pillarisetty, V. G., Bleier, J. I., Shah, A. B., DeMatteo, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+sinusoidal+endothelial+cells+are+insufficient+to+activate+T+cells.">Liver sinusoidal endothelial cells are insufficient to activate T cells.</a> Journal of Immunology. 173 (1), 230-235 (2004).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+preparation+method+for+isolation+of+single-cell+types+from+mouse+liver+for+proteomic+studies.">Sample preparation method for isolation of single-cell types from mouse liver for proteomic studies.</a> Proteomics. 11 (17), 3556-3564 (2011).</li><li>Do, H., Healey, J. F., Waller, E. K., Lollar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+factor+VIII+by+murine+liver+sinusoidal+endothelial+cells.">Expression of factor VIII by murine liver sinusoidal endothelial cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (28), 19587-19592 (1999).</li><li>Schrage, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+T+cell+transmigration+across+the+murine+liver+sinusoidal+endothelium+is+mediated+by+transcytosis+and+surface+presentation+of+chemokines.">Enhanced T cell transmigration across the murine liver sinusoidal endothelium is mediated by transcytosis and surface presentation of chemokines.</a> Hepatology. 48 (4), 1262-1272 (2008).</li><li>Chou, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysophosphatidic+acid+alters+the+expression+profiles+of+angiogenic+factors,+cytokines,+and+chemokines+in+mouse+liver+sinusoidal+endothelial+cells.">Lysophosphatidic acid alters the expression profiles of angiogenic factors, cytokines, and chemokines in mouse liver sinusoidal endothelial cells.</a> PLoS One. 10 (3), 0122060 (2015).</li><li>Deleve, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dacarbazine+toxicity+in+murine+liver+cells:+a+model+of+hepatic+endothelial+injury+and+glutathione+defense.">Dacarbazine toxicity in murine liver cells: a model of hepatic endothelial injury and glutathione defense.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 268 (3), 1261-1270 (1994).</li><li>Smedsr&#248;d, B., Pertoft, H., Eggertsen, G., Sundstr&#246;m, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+morphological+characterization+of+cultures+of+Kupffer+cells+and+liver+endothelial+cells+prepared+by+means+of+density+separation+in+Percoll,+and+selective+substrate+adherence.">Functional and morphological characterization of cultures of Kupffer cells and liver endothelial cells prepared by means of density separation in Percoll, and selective substrate adherence.</a> Cell and Tissue Research. 241 (3), 639-649 (1985).</li><li>Despoix, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+CD146/MCAM+is+a+marker+of+natural+killer+cell+maturation.">Mouse CD146/MCAM is a marker of natural killer cell maturation.</a> European Journal of Immunology. 38 (10), 2855-2864 (2008).</li><li>Strauss, O., Phillips, A., Ruggiero, K., Bartlett, A., Dunbar, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+identifies+distinct+subsets+of+endothelial+cells+in+the+human+liver.">Immunofluorescence identifies distinct subsets of endothelial cells in the human liver.</a> Scientific Reports. 7, 44356 (2017).</li><li>Halpern, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paired-cell+sequencing+enables+spatial+gene+expression+mapping+of+liver+endothelial+cells.">Paired-cell sequencing enables spatial gene expression mapping of liver endothelial cells.</a> Nature Biotechnology. 36 (10), 962-970 (2018).</li></ol>

In het huidige manuscript beschrijven we een protocol voor LSEC-isolatie van muizenlever bestaande uit tweestaps collagenaseperfusie en daaropvolgende magnetisch geactiveerde celsortering (MACS). Dit protocol bestaat uit de volgende drie stappen: (1) Perfusie door de PV met een calciumvrije buffer gevolgd door een collagenase-bevattende buffer om leverceldispersie te bereiken; (2) Uitsluiting van hepatocyten met centrifugeren met lage snelheid; en (3) MACS-gebaseerde positieve selectie van LSEC's uit niet-parenchymale ce...

Lever sinusoïdale endotheelcellen (LSEC's) langs de hepatische sinusoïde wanden en zijn de meest voorkomende niet-parenchymale cellen in de lever1. LSEC's onderscheiden zich van andere capillaire endotheelcellen elders in het lichaam door de aanwezigheid van fenestrae en het ontbreken van een klassiek keldermembraan of een diafragma 2,3. Vandaar dat de LSEC's onderscheidende fenotypische en structurele kenmerken bezitten die hun permeabiliteit en endocytische capaciteit verbeteren om een verscheidenheid aan circulerende macromoleculen, waaronder lipiden en lipoproteïnen, te elimineren. LSEC's spelen een cruciale rol in de kruisverwijzing tussen parenchymale en niet-parenchymale cellen, zoals stellaatcellen en immuuncellen. LSEC's zijn de sleutel tot het handhaven van leverhomeostase door de stellaatcellen en Kupffer-cellen in een rustige statuste houden 4. LSEC's moduleren de samenstelling van hepatische immuuncellenpopulaties door adhesie en trans-endotheelmigratie van circulerende leukocyten te bemiddelen 5,6. Tijdens acute en chronische leverbeschadiging7, waaronder ischemie-reperfusieletsel (IRI)8, niet-alcoholische steatohepatitis (NASH)9 en hepatocellulair carcinoom (HCC), ondergaan LSEC's fenotypische veranderingen die bekend staan als capillarisatie gekenmerkt door defenestratie en vorming van keldermembraan10. Deze fenotypische veranderingen in LSEC's zijn geassocieerd met LSEC-disfunctie en de verwerving van protrombotische, pro-inflammatoire en profibrogene eigenschappen.
Er zijn verschillende methoden ontwikkeld voor de isolatie van LSEC's van muizenlever11. Sommige technieken zijn afhankelijk van het scheiden van niet-parenchymale en parenchymale cellen gevolgd door dichtheidsgradiëntcentrifugatie om de LSEC's te zuiveren van niet-parenchymale fracties. De beperking van deze methode is de aanwezigheid van contaminerende macrofagen in de laatste stappen van LSEC-isolatie, wat de zuiverheid van de geïsoleerde LSEC's zou kunnen beïnvloeden12. Dit protocol is gebaseerd op collagenaseperfusie van de muizenlever en CD146 + magnetische kralen positieve selectie van niet-parenchymale cellen om LSEC's te zuiveren. LSEC's die met deze methode zijn geïsoleerd, vertonen een hoge zuiverheid en behouden morfologie en levensvatbaarheid. Deze LSEC's zijn optimaal voor functionele studies, waaronder permeabiliteit en adhesietest, evenals downstream studies voor routes van belang. Bovendien, met de groeiende interesse in het genereren van grote datasets in zowel klinisch onderzoek als ontdekkingswetenschap, kunnen deze hoogwaardige LSEC's geïsoleerd uit zowel gezonde als zieke levers met niet-alcoholische steatohepatitis (NASH) of andere aandoeningen worden samengevoegd of afzonderlijk worden gebruikt, waardoor multi-omics gegevens kunnen worden gegenereerd en vergelijking tussen gezondheid en ziekte13,14 . Bovendien kunnen de geïsoleerde LSEC's worden gebruikt om zowel tweedimensionale als driedimensionale in vitro modellen zoals organoïden te ontwikkelen om de geactiveerde signaalroute in LSEC's en hun intercellulaire communicatie met andere levercellen te ontcijferen onder verschillende schadelijke stimuli en als reactie op verschillende therapeutische interventies.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2.0-inch 20 G Intra Venous (IV) catheter</td>
			<td>Terumo, SOmerset, NJ, USA</td>
			<td>SR-OX2051CA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#8211;3-inch perfuion tray with a hole in the center</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>customized; made in house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>405/520 viability dye</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-110-205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-inch regular curved dressing forceps</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>FS16-100-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-0 Perma-Hand silk suture</td>
			<td>Ethicon, Raritan, NJ, USA</td>
			<td>A182H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-stabilin-2 (Mouse) mAb-Alexa Fluor&#195; 488</td>
			<td>MBL International, Woburn, MA, USA</td>
			<td>D317-A48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA stock</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD146 (LSEC)-PE, anti-mouse</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-118-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD146 (LSEC) MicroBeads, mouse</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-092-007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD45-Viogreen, anti-mouse</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-110-803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen type I</td>
			<td>Corning, Corning, NY, USA</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase II</td>
			<td>Gibco, Waltham, MA, USA</td>
			<td>17101-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial cells growth medium</td>
			<td>ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>211-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FcR blocking reagent, mouse</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-092-575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo software, version 10.6</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardened Fine scissors</td>
			<td>F.S.T, Foster city, CA, USA</td>
			<td>14091-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated (37 &#176;C) and humidified recirculating perfusion apparatus equipped with Oxygen injection at a rate of 10psi.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>customized; made in house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hitachi S 4700 scanning electron microscope</td>
			<td>Hitachi Inc, Pleasanton, CA, USA</td>
			<td>SEM096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS columns</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS pre-separation filters (70 &#956;m)</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-095-823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS rinsing buffer</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-091-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Smart Strainer (70 &#956;m)</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-098-462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACSQunt flow cytometer</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell Cell Culture Insert</td>
			<td>Millipore Sigma, Burlington, MA, USA</td>
			<td>PITP01250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nexcelom cell counter</td>
			<td>Nexcelom bioscience, Lawrence, MA, USA</td>
			<td>Cellometer Auto T4 Plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare, Chicago, IL, USA</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>F.S.T, Foster city, CA, USA</td>
			<td>14001-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Very small curved dressing forceps</td>
			<td>F.S.T, Foster city, CA, USA</td>
			<td>11063-07</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of mouse primary liver sinusoidal endothelial cells

Lever sinusoïdale endotheelcellen (LSEC's) zijn gespecialiseerde endotheelcellen op het grensvlak tussen de circulatie en het leverparenchym. LSEC's hebben een duidelijke morfologie die wordt gekenmerkt door de aanwezigheid van fenestrae en de afwezigheid van keldermembraan. LSEC's spelen een essentiële rol bij veel pathologische aandoeningen in de lever, waaronder metabole ontregeling, ontsteking, fibrose, angiogenese en carcinogenese. Er is echter weinig gepubliceerd over de isolatie en karakterisering van de LSEC's. Hier bespreekt dit protocol de isolatie van LSEC van zowel gezonde als niet-alcoholische leververvetting (NAFLD) muizen. Het protocol is gebaseerd op collagenaseperfusie van de lever van de muis en magnetische kralen positieve selectie van niet-parenchymale cellen om LSEC's te zuiveren. Deze studie karakteriseert LSEC's met behulp van specifieke markers door flowcytometrie en identificeert de karakteristieke fenotypische kenmerken door scanning elektronenmicroscopie. LSEC's die volgens dit protocol zijn geïsoleerd, kunnen worden gebruikt voor functionele studies, waaronder adhesie- en permeabiliteitstests, evenals downstreamstudies voor een bepaald interessetraject. Bovendien kunnen deze LSEC's worden samengevoegd of afzonderlijk worden gebruikt, waardoor multi-omics gegevens kunnen worden gegenereerd, waaronder RNA-seq bulk of eencellig, proteomisch of fosfo-proteomics en assay voor Transposase-Toegankelijk Chromatine met behulp van sequencing (ATAC-seq), onder anderen. Dit protocol zal nuttig zijn voor onderzoekers die de communicatie van LSEC's met andere levercellen in gezondheid en ziekte bestuderen en een diepgaand begrip mogelijk maken van de rol van LSEC's in de pathogene mechanismen van acute en chronische leverbeschadiging.

Experimentele schema's en uitrustingsopstelling: In dit protocol werd de lever van de muis verteerd met behulp van een gesloten perfusiecircuit, waarna niet-parenchymale cellen en hepatocyten werden gescheiden door centrifugering met lage snelheid bij 50 x g gedurende 2 minuten. Primaire LSEC's werden geïsoleerd met behulp van CD146 magnetische kralenselectie uit de niet-parenchymale fractie. De experimentele schema's zijn weergegeven in figuur 1A. De canule wer...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells at JoVE.com

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

Hier schetsen en demonstreren we een protocol voor primaire muis lever sinusoïdale endotheelcel (LSEC) isolatie. Het protocol is gebaseerd op levercollageaseperfusie, niet-parenchymale celzuivering door centrifugeren met lage snelheid en CD146 magnetische kraalselectie. We fenotyperen en karakteriseren deze geïsoleerde LSEC's ook met behulp van flowcytometrie en scanning elektronenmicroscopie.

Isolatie en karakterisering van primaire leverbijholteelcellen van muizen

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...

Hier demonstreren we ons protocol van primaire muis lever sinusoïdale celisolatie of LSEC-isolatie. Het protocol bestaat uit lever collagenase perfusie en lage snelheid ultracentrifugatie voor niet-parenchymale celzuivering en CD146 magnetische kraalselectie. Onze LSEC-isolatiemethode is zeer efficiënt en toepasbaar op gezonde en zieke muizenlever.De geïsoleerde LSEC's vertonen een hoge zuiverheid en behouden de structuur en functie. LSEC's geïsoleerd met behulp van dit protocol zijn optimaal voor functionele en moleculaire studies en multi-omics datageneratie. Dit protocol zal nuttig zijn voor het bestuderen van intercellulaire communicatie in de lever.Begin met het coaten van 10-centimeter kweekschalen met drie milliliter collageenoplossing. Incubeer vervolgens de gerechten op kamertemperatuur gedurende een uur. Verwijder na een uur het overtollige vocht van het gecoate oppervlak.Was de afwas met PBS drie keer en laat ze aan de lucht drogen. Stel het verwarmde en bevochtigde recirculatieperfusieapparaat in. Spoel het perfusiesysteem gedurende vijf minuten met 10% bleekmiddel.Spoel het systeem vervolgens nog eens 10 minuten af met steriel water. Giet de spoelvloeistof zoveel mogelijk af voordat u doordrenkt met collagenase-oplossing. Infundeer de collagenase-oplossing door het perfusiesysteem om het voor te verwarmen tot 37 graden Celsius.Stel de pompsnelheid in op snelheid op de snelheidsregelaar. Houd de snelheid gedurende de hele procedure gelijk. Weeg de muis voor de procedure.Bevestig het vervolgens aan het chirurgische oppervlak. Spuit de buik van de muis in met 70% ethanol. Maak met behulp van een chirurgische schaar een incisie van ongeveer vijf centimeter vanaf het onderste deel van de buik tot aan het xiphoid-proces.Maak daarna twee zijwaartse sneden met behulp van een kleine irisschaar aan elke kant van de buik om de buikorganen volledig bloot te leggen. Plaats de schede van de infuuskatheter onder de rug van het dier om de buik op te tillen en waterpas te zetten. Trek met behulp van een gewone gebogen verbandtang voorzichtig de darmen en de maag links van het dier af.Plaats vervolgens een 5-0 chirurgische hechting onder de inferieure vena cava, of IVC, net onder de blootgestelde linker nier. Bind een losse trekhaak in de hechtdraad. Plaats vervolgens nog een 5-0 chirurgische hechting rond de ader van het leverportaal.Plaats de hechting net boven het vertakkingspunt van de hepatische poortader. Knoop nogmaals een losse trekhaak in de hechting. Gebruik de poortadernaad als spanning en plaats de 20-gauge IV-katheter in de hepatische poortader een centimeter lager waar deze zich vertakt naar de rechter- en linker hepatische poortader.Schuif vervolgens de katheter door de ader, maar houd deze onder het vertakkingsgebied. Laat het bloed door de katheter stromen totdat het begint uit te druipen. Zet de infuuskatheter vast met de poortader hechtdraad.Gebruik een infuuslijn om een infuusfles met buffer A aan de katheter te bevestigen. Spoel vervolgens de lever met deze oplossing terwijl u de toegang van lucht in het systeem vermijdt. Bind de hechting rond de IVC onder de nier af.Snijd daarna de IVC onder de hechting om het dier te laten bloeden. Eenmaal doordrenkt, snijdt u de maag, darmen, milt en andere ingewanden weg die aan de lever zijn bevestigd. Snijd vervolgens het diafragma en de belangrijkste bloedvaten weg uit de thoracale holte.Verwijder de lever van het dier en plaats deze op de perfusiebak. Verwijder voorzichtig de infuuslijn en sluit de collagenase-oplossing aan in de recirculatiekamer. Laat de lever perfuseren totdat de capsule gemodelleerd wordt en papperig lijkt.Dit duurt meestal 10 tot 15 minuten. Eenmaal verteerd, verwijder de lever uit de kamer en plaats deze op een petrischaaltje van 10 centimeter met ongeveer 20 milliliter serumvrije DMEM. Haal de lever voorzichtig uit elkaar met een paar pipetpunten en gooi de galboom weg.Filter daarna de leversuspensie door een celzeef van 70 micrometer in een conische buis van 50 milliliter. Centrifugeer de celsuspensie gedurende twee minuten bij kamertemperatuur op 50 maal G. Verzamel vervolgens het supernatant dat niet-parenchymale levercellen bevat.Centrifugeer het supernatant gedurende vijf minuten bij 300 maal G bij vier graden Celsius. Verzamel daarna de celkorrel en resuspend deze in een milliliter isolatiebuffer. Bepaal het celnummer met behulp van een automatische celteller volgens de instructies van de fabrikant.Centrifugeer vervolgens de celsuspensie. Zuig het supernatant volledig op en resuspend de pellet met 90 microliter isolatiebuffer per 10 miljoen cellen. Voeg 10 microliter CD146 MicroBeads toe per 10 miljoen totale cellen.Meng het goed en incubeer gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius. Om de cellen te wassen, voegt u één tot twee milliliter isolatiebuffer per 10 miljoen cellen toe. Centrifugeer de oplossing gedurende 10 minuten op 300 maal G.Adem daarna het supernatant volledig op en resuspend tot een miljard cellen in 500 microliter isolatiebuffer. Bereid vervolgens de scheidingskolom voor door deze te spoelen met drie milliliter isolatiebuffer. Breng de celsuspensie aan op de kolom die is gestapeld met 70 micrometer voorscheidingsfilters.Was de kolom drie keer met drie milliliter isolatiebuffer. Verwijder daarna de kolom uit de separator en plaats deze op een centrifugebuis van 15 milliliter. Pipetteer vijf milliliter isolatiebuffer op de kolom.Om de magnetische cellen met kralenlabels te herstellen, duwt u de zuiger stevig in de kolom om de cellen weg te spoelen. Centrifugeer ten slotte de cellen gedurende vijf minuten bij 300 maal G bij vier graden Celsius. Geïsoleerde LSEC-zuiverheid en oppervlaktemarkers werden beoordeeld met flowcytometrie.Data-analyse en gatingstrategie voor gated LSEC's en singlets zijn gebaseerd op forward scatter en side scatter data. Geïsoleerde LSEC's werden gekleurd met een levensvatbaarheidskleurstof en een combinatie van CD45-, CD146- en Stabilin-2-antilichamen. Levensvatbare LSEC's werden gated op CD45 negatieve populatie en geanalyseerd op CD146 en Stabilin-2 expressie.Op basis van deze gegevens werd bevestigd dat de geïsoleerde LSEC's meer dan 94% levensvatbaar en meer dan 90% zuiverheid hadden. Het LSEC-specifieke fenotype van de geïsoleerde cellen werd verder bevestigd met behulp van lichtmicroscopie en scanningelektronenmicroscopie. Geïsoleerde LSEC's werden gedurende zes uur in het volledige groeimedium gekweekt en met lichtmicroscopie onderzocht.De witte pijlen in de SEM-afbeelding geven LSEC-fenestrae aan, wat een kenmerkend morfologisch kenmerk is van LSEC's. De kritieke stappen om volledige perfusie van een leverweefsel te garanderen, zijn de juiste positionering van kathetertapes, het vermijden van de introductie van lucht in de katheter en de optimale timing van collagenasevertering. Hoogwaardige LSEC verkregen met behulp van ons protocol zal de identificatie van het moleculaire mechanisme van LSEC-functie vergemakkelijken en zal ons begrip van hun rol in intercellulaire communicatie in de lever, in gezondheid en bij ziekte verbeteren.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Isolatie van Valvulaire endotheelcellen

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Isolation &#38; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Isolation & Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Isolatie &amp; Karakterisering van Hoechst Lage CD45 Negatief Muis Lung Mesenchymale stamcellen

Tissue resident mesenchymal stem cells (MSC) are important regulators of tissue repair or regeneration, fibrosis, inflammation, angiogenesis and tumor ...

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

Isolatie van primaire Muis trofoblast cellen en Trofoblastinvasie Assay

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Isolatie van embryonale ventriculaire endotheelcellen

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Isolatie en Cultuur van de Muis Primaire Pancreatic Acinaire Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Isolatie van Murine Valve endotheelcellen

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

A Standardized Method for the Analysis of Liver Sinusoidal Endothelial Cells and Their Fenestrations by Scanning Electron Microscopy

Een gestandaardiseerde methode voor de analyse van lever sinusoïdale endotheelcellen en hun fenestraties van Scanning Electron Microscopy

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolatie en Primaire Cultuur van de muis endotheelcellen

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells

Protocol voor isolatie van primaire menselijke hepatocyten en Overeenkomstige Major Populaties van niet-parenchymale Liver Cells

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic ...

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

Isolatie van muis coronaire endotheelcellen

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...