Name: isolation and characterization of mouse primary liver sinusoidal endothelial cells
Uploaded: 2021-12-16T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לסוכרת ומחלות עיכול וכליות של ה- NIH (1RO1DK122948 ל- SHI) ומנגנון המענקים של NIH Silvio O. Conte לחקר מחלות עיכול P30 (DK084567). תמיכה ניתנה גם ל- KF על ידי האגודה היפנית לקידום המדע (JSPS) מלגות מחקר בחו"ל. אנו רוצים גם להודות לד"ר גרגורי ג'יי ג'יי גורס וסטיבן ברונק על התכנון והאופטימיזציה המקוריים שלהם של מנגנון פיזור הקולגנאז.

פרוטוקולים של בעלי חיים נערכו כפי שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של מאיו קליניק. עכברים זכרים C57BL/6J בני שמונה שבועות נרכשו ממעבדת ג'קסון. העכברים שוכנו במתקן מחזור בהיר-כהה מבוקר טמפרטורה של 12:12 שעות עם גישה חופשית לתזונה.
1. הכנת צלחת או צלחת תרב...

<ol>
	<li>Morin, O., Goulet, F., Normand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+sinusoidal+endothelial+cells:+isolation,+purification,+characterization+and+interaction+with+hepatocytes.">Liver sinusoidal endothelial cells: isolation, purification, characterization and interaction with hepatocytes.</a> Revisiones Sobre Biologia Celular: RBC. 15, 1-85 (1988).</li><li>Ibrahim, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sinusoidal+endotheliopathy+in+nonalcoholic+steatohepatitis:+therapeutic+implications.">Sinusoidal endotheliopathy in nonalcoholic steatohepatitis: therapeutic implications.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 321 (1), 67-74 (2021).</li><li>Poisson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+sinusoidal+endothelial+cells:+Physiology+and+role+in+liver+diseases.">Liver sinusoidal endothelial cells: Physiology and role in liver diseases.</a> Journal of Hepatology. 66 (1), 212-227 (2017).</li><li>Marrone, G., Shah, V. H., Gracia-Sancho, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sinusoidal+communication+in+liver+fibrosis+and+regeneration.">Sinusoidal communication in liver fibrosis and regeneration.</a> Journal of Hepatology. 65 (3), 608-617 (2016).</li><li>Shetty, S., Lalor, P. F., Adams, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+sinusoidal+endothelial+cells+-+gatekeepers+of+hepatic+immunity.">Liver sinusoidal endothelial cells - gatekeepers of hepatic immunity.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. 15 (9), 555-567 (2018).</li><li>Smedsr&#248;d, B., Pertoft, H., Gustafson, S., Laurent, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scavenger+functions+of+the+liver+endothelial+cell.">Scavenger functions of the liver endothelial cell.</a> Biochemical Journal. 266 (2), 313-327 (1990).</li><li>DeLeve, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+sinusoidal+endothelial+cells+in+hepatic+fibrosis.">Liver sinusoidal endothelial cells in hepatic fibrosis.</a> Hepatology. 61 (5), 1740-1746 (2015).</li><li>Dar, W. A., Sullivan, E., Bynon, J. S., Eltzschig, H., Ju, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischaemia+reperfusion+injury+in+liver+transplantation:+Cellular+and+molecular+mechanisms.">Ischaemia reperfusion injury in liver transplantation: Cellular and molecular mechanisms.</a> Liver International. 39 (5), 788-801 (2019).</li><li>Furuta, K., Guo, Q., Hirsova, P., Ibrahim, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Roles+of+Liver+Sinusoidal+Endothelial+Cells+in+Nonalcoholic+Steatohepatitis.">Emerging Roles of Liver Sinusoidal Endothelial Cells in Nonalcoholic Steatohepatitis.</a> Biology. 9 (11), 395 (2020).</li><li>Wu, L. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+functional+differences+between+human+liver+cancer+endothelial+cells+and+liver+sinusoidal+endothelial+cells.">Phenotypic and functional differences between human liver cancer endothelial cells and liver sinusoidal endothelial cells.</a> Journal of Vascular Research. 45 (1), 78-86 (2008).</li><li>Meyer, J., Gonelle-Gispert, C., Morel, P., B&#252;hler, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+isolation+and+purification+of+murine+liver+sinusoidal+endothelial+cells:+A+systematic+review.">Methods for isolation and purification of murine liver sinusoidal endothelial cells: A systematic review.</a> PLoS One. 11 (3), 0151945 (2016).</li><li>Meyer, J., Lacotte, S., Morel, P., Gonelle-Gispert, C., Buhler, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+for+mouse+liver+sinusoidal+endothelial+cell+isolation.">An optimized method for mouse liver sinusoidal endothelial cell isolation.</a> Experimental Cell Research. 349 (2), 291-301 (2016).</li><li>Furuta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-induced+endothelial+vascular+cell+adhesion+molecule+1+promotes+nonalcoholic+steatohepatitis+pathogenesis.">Lipid-induced endothelial vascular cell adhesion molecule 1 promotes nonalcoholic steatohepatitis pathogenesis.</a> Journal of Clinical Investigation. 131 (6), (2021).</li><li>Guo, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+&#946;(1)-enriched+extracellular+vesicles+mediate+monocyte+adhesion+and+promote+liver+inflammation+in+murine+NASH.">Integrin &#946;(1)-enriched extracellular vesicles mediate monocyte adhesion and promote liver inflammation in murine NASH.</a> Journal of Hepatology. 71 (1), 1193-1205 (2019).</li><li>Hirsova, P., Ibrahim, S. H., Bronk, S. F., Yagita, H., Gores, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vismodegib+suppresses+TRAIL-mediated+liver+injury+in+a+mouse+model+of+nonalcoholic+steatohepatitis.">Vismodegib suppresses TRAIL-mediated liver injury in a mouse model of nonalcoholic steatohepatitis.</a> PLoS One. 8 (7), 70599 (2013).</li><li>Schrage, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+CD146+is+widely+expressed+on+endothelial+cells+and+is+recognized+by+the+monoclonal+antibody+ME-9F1.">Murine CD146 is widely expressed on endothelial cells and is recognized by the monoclonal antibody ME-9F1.</a> Histochemistry and Cell Biology. 129 (4), 441-451 (2008).</li><li>Olsavszky, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+transcriptomic+network+of+multi-ligand+scavenger+receptor+Stabilin-1-+and+Stabilin-2-deficient+liver+sinusoidal+endothelial+cells.">Exploring the transcriptomic network of multi-ligand scavenger receptor Stabilin-1- and Stabilin-2-deficient liver sinusoidal endothelial cells.</a> Gene. 768, 145284 (2021).</li><li>DeLeve, L. D., Maretti-Mira, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+sinusoidal+endothelial+cell:+An+update.">Liver sinusoidal endothelial cell: An update.</a> Seminars in Liver Disease. 37 (4), 377-387 (2017).</li><li>DeLeve, L. D., Wang, X., Hu, L., McCuskey, M. K., McCuskey, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+liver+sinusoidal+endothelial+cell+phenotype+is+maintained+by+paracrine+and+autocrine+regulation.">Rat liver sinusoidal endothelial cell phenotype is maintained by paracrine and autocrine regulation.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 287 (4), 757-763 (2004).</li><li>Cabral, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+hepatocytes+and+sinusoidal+endothelial+cells+from+mouse+liver+perfusion.">Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).</li><li>Ishiguro, K., Yan, I. K., Patel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+tissue+extracellular+vesicles+from+the+liver.">Isolation of tissue extracellular vesicles from the liver.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e58649 (2019).</li><li>Topp, S. A., Upadhya, G. A., Strasberg, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cold+preservation+of+isolated+sinusoidal+endothelial+cells+in+MMP+9+knockout+mice:+effect+on+morphology+and+platelet+adhesion.">Cold preservation of isolated sinusoidal endothelial cells in MMP 9 knockout mice: effect on morphology and platelet adhesion.</a> Liver Transplantation. 10 (8), 1041-1048 (2004).</li><li>Katz, S. C., Pillarisetty, V. G., Bleier, J. I., Shah, A. B., DeMatteo, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+sinusoidal+endothelial+cells+are+insufficient+to+activate+T+cells.">Liver sinusoidal endothelial cells are insufficient to activate T cells.</a> Journal of Immunology. 173 (1), 230-235 (2004).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+preparation+method+for+isolation+of+single-cell+types+from+mouse+liver+for+proteomic+studies.">Sample preparation method for isolation of single-cell types from mouse liver for proteomic studies.</a> Proteomics. 11 (17), 3556-3564 (2011).</li><li>Do, H., Healey, J. F., Waller, E. K., Lollar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+factor+VIII+by+murine+liver+sinusoidal+endothelial+cells.">Expression of factor VIII by murine liver sinusoidal endothelial cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (28), 19587-19592 (1999).</li><li>Schrage, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+T+cell+transmigration+across+the+murine+liver+sinusoidal+endothelium+is+mediated+by+transcytosis+and+surface+presentation+of+chemokines.">Enhanced T cell transmigration across the murine liver sinusoidal endothelium is mediated by transcytosis and surface presentation of chemokines.</a> Hepatology. 48 (4), 1262-1272 (2008).</li><li>Chou, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysophosphatidic+acid+alters+the+expression+profiles+of+angiogenic+factors,+cytokines,+and+chemokines+in+mouse+liver+sinusoidal+endothelial+cells.">Lysophosphatidic acid alters the expression profiles of angiogenic factors, cytokines, and chemokines in mouse liver sinusoidal endothelial cells.</a> PLoS One. 10 (3), 0122060 (2015).</li><li>Deleve, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dacarbazine+toxicity+in+murine+liver+cells:+a+model+of+hepatic+endothelial+injury+and+glutathione+defense.">Dacarbazine toxicity in murine liver cells: a model of hepatic endothelial injury and glutathione defense.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 268 (3), 1261-1270 (1994).</li><li>Smedsr&#248;d, B., Pertoft, H., Eggertsen, G., Sundstr&#246;m, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+morphological+characterization+of+cultures+of+Kupffer+cells+and+liver+endothelial+cells+prepared+by+means+of+density+separation+in+Percoll,+and+selective+substrate+adherence.">Functional and morphological characterization of cultures of Kupffer cells and liver endothelial cells prepared by means of density separation in Percoll, and selective substrate adherence.</a> Cell and Tissue Research. 241 (3), 639-649 (1985).</li><li>Despoix, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+CD146/MCAM+is+a+marker+of+natural+killer+cell+maturation.">Mouse CD146/MCAM is a marker of natural killer cell maturation.</a> European Journal of Immunology. 38 (10), 2855-2864 (2008).</li><li>Strauss, O., Phillips, A., Ruggiero, K., Bartlett, A., Dunbar, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+identifies+distinct+subsets+of+endothelial+cells+in+the+human+liver.">Immunofluorescence identifies distinct subsets of endothelial cells in the human liver.</a> Scientific Reports. 7, 44356 (2017).</li><li>Halpern, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paired-cell+sequencing+enables+spatial+gene+expression+mapping+of+liver+endothelial+cells.">Paired-cell sequencing enables spatial gene expression mapping of liver endothelial cells.</a> Nature Biotechnology. 36 (10), 962-970 (2018).</li></ol>

בכתב היד הנוכחי אנו מתארים פרוטוקול לבידוד LSEC מכבד עכברים המורכב מפרפוזיית קולגןאז דו-שלבית ומיון תאים המופעלים על ידי מגנטית (MACS) לאחר מכן. פרוטוקול זה מורכב משלושת השלבים הבאים: (1) פרפוזיה דרך ה-PV עם מאגר נטול סידן ואחריו מאגר המכיל קולגן כדי להשיג פיזור תאי כבד; (2) הרחקה של הפטוציטים עם צנ...

תאי אנדותל סינוסואידליים בכבד (LSECs) מרפדים את דפנות הסינוסואידים הכבדים והם התאים הלא-פרנכימליים הנפוצים ביותר בכבד1. LSECs נבדלים מתאי אנדותל נימיים אחרים במקומות אחרים בגוף על ידי נוכחות של fenestrae והיעדר קרום מרתף קלאסי או דיאפרגמה 2,3. לפיכך, LSECs הם בעלי מאפיינים פנוטיפיים ומבניים ייחודיים המשפרים את חדירותם ואת יכולתם האנדוציטית לחסל מגוון של מקרומולקולות במחזור הדם, כולל שומנים וליפופרוטאינים. LSECs ממלאים תפקיד מרכזי בהצלבה בין תאים פרנכימליים ולא-פרנצ'ימליים, כגון תאי סטלה ותאי מערכת החיסון. LSECs הם המפתח לשמירה על הומאוסטזיס בכבד על ידי שמירה על תאי הסטלטים ותאי קופפר במצבשקט 4. LSECs מווסתים את הרכב אוכלוסיות תאי החיסון בכבד על ידי תיווך הידבקות והגירה טרנס-אנדותל של לויקוציטים במחזור 5,6. במהלך פגיעה חריפה וכרונית בכבד7, כולל פגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה (IRI)8, סטאטוהפטיטיס לא אלכוהולית (NASH)9, וקרצינומה הפטוצלולרית (HCC), LSECs עוברים שינויים פנוטיפיים הידועים בשם קפילאריזציה המאופיינים בהתגוננות והיווצרות של קרום מרתף10. שינויים פנוטיפיים אלה ב-LSECs קשורים לתפקוד לקוי של LSECs ולרכישת תכונות פרותרומבוטיות, פרו-דלקתיות ופרופילוגניות.
מספר שיטות לבידוד של LSECs מכבד העכבר פותחו11. טכניקות מסוימות תלויות בהפרדת תאים לא-פרנכימליים ופרנכימליים ולאחר מכן צנטריפוגת גרדיאנט צפיפות כדי לטהר את ה-LSECs משברים לא-פרנצ'ימליים. המגבלה של שיטה זו היא נוכחות של מקרופאגים מזהמים בשלבים האחרונים של בידוד LSECs, אשר יכול להשפיע על טוהר של LSECsמבודדים 12. פרוטוקול זה מבוסס על זלוף קולגןאז של כבד העכבר ועל בחירה חיובית של חרוזים מגנטיים CD146+ של תאים לא-פרנצ'ימליים לטיהור LSECs. LSECs שבודדו בשיטה זו מראים טוהר גבוה ומורפולוגיה ומשומרת וכדאיות. LSECs אלה הם אופטימליים למחקרים פונקציונליים, כולל בדיקת חדירות והידבקות, כמו גם מחקרים במורד הזרם עבור מסלולי עניין. יתר על כן, עם העניין הגובר ביצירת מערכי ביג דאטה הן במחקר קליני והן במדע הגילוי, ניתן לאגד או להשתמש בנפרד ב-LSECs באיכות גבוהה אלה המבודדים מכבדים בריאים וחולים עם סטאטוהפטיטיס לא-אלכוהולית (NASH) או מצבים אחרים, מה שמאפשר יצירת נתונים מרובי-אומיקה והשוואה בין בריאות למחלות 13,14 . בנוסף, ניתן להשתמש ב-LSECs המבודדים כדי לפתח מודלים דו-ממדיים כמו גם תלת-ממדיים במבחנה כמו אורגנואידים כדי לפענח את מסלול האיתות המופעל ב-LSECs ואת התקשורת הבין-תאית שלהם עם תאי כבד אחרים תחת גירויים רעילים שונים ובתגובה להתערבויות טיפוליות שונות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2.0-inch 20 G Intra Venous (IV) catheter</td>
			<td>Terumo, SOmerset, NJ, USA</td>
			<td>SR-OX2051CA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#8211;3-inch perfuion tray with a hole in the center</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>customized; made in house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>405/520 viability dye</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-110-205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-inch regular curved dressing forceps</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>FS16-100-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-0 Perma-Hand silk suture</td>
			<td>Ethicon, Raritan, NJ, USA</td>
			<td>A182H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-stabilin-2 (Mouse) mAb-Alexa Fluor&#195; 488</td>
			<td>MBL International, Woburn, MA, USA</td>
			<td>D317-A48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA stock</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD146 (LSEC)-PE, anti-mouse</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-118-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD146 (LSEC) MicroBeads, mouse</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-092-007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD45-Viogreen, anti-mouse</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-110-803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen type I</td>
			<td>Corning, Corning, NY, USA</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase II</td>
			<td>Gibco, Waltham, MA, USA</td>
			<td>17101-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial cells growth medium</td>
			<td>ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>211-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FcR blocking reagent, mouse</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-092-575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo software, version 10.6</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardened Fine scissors</td>
			<td>F.S.T, Foster city, CA, USA</td>
			<td>14091-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated (37 &#176;C) and humidified recirculating perfusion apparatus equipped with Oxygen injection at a rate of 10psi.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>customized; made in house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hitachi S 4700 scanning electron microscope</td>
			<td>Hitachi Inc, Pleasanton, CA, USA</td>
			<td>SEM096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS columns</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS pre-separation filters (70 &#956;m)</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-095-823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS rinsing buffer</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-091-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Smart Strainer (70 &#956;m)</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-098-462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACSQunt flow cytometer</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell Cell Culture Insert</td>
			<td>Millipore Sigma, Burlington, MA, USA</td>
			<td>PITP01250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nexcelom cell counter</td>
			<td>Nexcelom bioscience, Lawrence, MA, USA</td>
			<td>Cellometer Auto T4 Plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare, Chicago, IL, USA</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>F.S.T, Foster city, CA, USA</td>
			<td>14001-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Very small curved dressing forceps</td>
			<td>F.S.T, Foster city, CA, USA</td>
			<td>11063-07</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of mouse primary liver sinusoidal endothelial cells

תאי אנדותל סינוסואידליים בכבד (LSECs) הם תאי אנדותל מיוחדים הממוקמים בממשק שבין מחזור הדם לבין הפרנכימה של הכבד. ל-LSECs יש מורפולוגיה מובחנת המאופיינת בנוכחות של fenestrae ובהיעדר קרום מרתף. LSECs ממלאים תפקידים חיוניים בהפרעות פתולוגיות רבות בכבד, כולל חוסר ויסות מטבולי, דלקת, פיברוזיס, אנגיוגנזה וקרצינוגנזה. עם זאת, מעט מאוד פורסם על הבידוד והאפיון של LSECs. כאן, פרוטוקול זה דן בבידוד של LSEC מעכברים בריאים ולא אלכוהוליים של מחלת כבד שומני (NAFLD). הפרוטוקול מבוסס על זלוף קולגן של כבד העכבר ועל בחירה חיובית של חרוזים מגנטיים של תאים לא-פרנצ'ימליים לטיהור LSECs. מחקר זה מאפיין LSECs באמצעות סמנים ספציפיים על ידי ציטומטריה של זרימה ומזהה את התכונות הפנוטיפיות האופייניות על ידי סריקת מיקרוסקופיית אלקטרונים. LSECs שבודדו בעקבות פרוטוקול זה יכולים לשמש למחקרים פונקציונליים, כולל מבחני הידבקות וחדירות, כמו גם מחקרים במורד הזרם עבור מסלול עניין מסוים. בנוסף, ניתן לאגד או להשתמש ב-LSECs אלה בנפרד, מה שמאפשר יצירת נתונים מרובי-אומיקות, כולל תפזורת RNA-seq או תא בודד, פרוטאומי או פוספו-פרוטאומיקה, ובדיקה עבור כרומטין נגיש לטרנספוזאז באמצעות ריצוף (ATAC-seq), בין היתר. פרוטוקול זה יהיה שימושי עבור חוקרים החוקרים את התקשורת של LSECs עם תאי כבד אחרים בבריאות ובמחלות ויאפשר הבנה מעמיקה של תפקידם של LSECs במנגנונים הפתוגניים של פגיעה חריפה וכרונית בכבד.

שרטוטים ניסיוניים והתקנת ציוד: בפרוטוקול זה, כבד העכברים עוכל באמצעות מעגל פרפוזיה סגור, ואז תאים לא-פרנצ'ימליים והפטוציטים הופרדו על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה ב-50 x g במשך 2 דקות. LSECs ראשוניים בודדו באמצעות בחירת חרוזים מגנטיים CD146 מהשבר הלא-פרנצ'ימלי. הסכימות הניסיוניות מ?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells at JoVE.com

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

כאן אנו מתארים ומדגימים פרוטוקול לבידוד תאי אנדותל סינוסואידליים ראשוניים בכבד עכבר (LSEC). הפרוטוקול מבוסס על זלוף קולגן בכבד, טיהור תאים לא-פרנצ'ימליים על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה ובחירת חרוזים מגנטיים CD146. אנו גם מנצלים את הפנוטיפ ומאפיינים את ה-LSECs המבודדים הללו באמצעות ציטומטריית זרימה ומיקרוסקופ אלקטרונים סורק.

בידוד ואפיון של תאי אנדותל סינוסואידליים ראשוניים בכבד של עכבר

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...

כאן, אנו מדגימים את הפרוטוקול שלנו של בידוד תאים סינוסואידליים ראשוניים בכבד עכבר או בידוד LSECs. הפרוטוקול מורכב מזיוף קולגן בכבד ואולטרה-צנטריפוגציה במהירות נמוכה לטיהור תאים שאינם פרנכימליים ובחירת חרוזים מגנטיים CD146. שיטת הבידוד LSEC שלנו יעילה ביותר וישימה לכבד עכברים בריא וחולה.ה-LSECs המבודדים מציגים טוהר גבוה ומשמרים את המבנה והתפקוד. LSECs המבודדים באמצעות פרוטוקול זה הם אופטימליים למחקרים פונקציונליים ומולקולריים ולהפקת נתונים מרובי אומיקה. פרוטוקול זה יעזור לחקר התקשורת הבין-תאית בכבד.התחילו בציפוי מנות תרבית באורך 10 ס"מ בשלושה מיליליטרים של תמיסת קולגן. לאחר מכן, דגירה את הכלים בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת. לאחר שעה, הסר את הנוזל העודף מהמשטח המצופה.שטפו את הכלים עם PBS שלוש פעמים ואפשרו להם להתייבש באוויר. הגדירו את מנגנון ההעתקה המחומם והלח. יש לשטוף את מערכת הזלוף באמצעות 10% אקונומיקה למשך חמש דקות.לאחר מכן, יש לשטוף את המערכת שוב במים סטריליים למשך 10 דקות נוספות. מסננים את נוזל השטיפה ככל האפשר לפני ההחדרה לתמיסת קולגן. מחדירים את תמיסת הקולגאזאז דרך מערכת הזלוף כדי לחמם אותה מראש ל-37 מעלות צלזיוס.הגדר את קצב המשאבה למהירות אחת בחוגת בקרת המהירות. שמור על המהירות זהה לאורך כל ההליך. שקול את העכבר לצורך ההליך.לאחר מכן הצמידו אותו למשטח הניתוחי. מרססים את בטן העכבר ב-70% אתנול. באמצעות מספריים כירורגיים, לבצע חתך של כחמישה סנטימטרים החל מהחלק התחתון של הבטן ועד לתהליך xiphoid.לאחר מכן, לעשות שני חתכים לרוחב באמצעות מספריים קשתית קטנה בכל צד של הבטן כדי לחשוף את איברי הבטן באופן מלא. מניחים את הנדן של קטטר האינפוזיה מתחת לגב החיה כדי להרים וליישר את הבטן. באמצעות מלקחיים קבועים של חבישה מעוקלת, משכו בעדינות את המעיים ואת הבטן משמאל לבעל החיים.לאחר מכן, הניחו תפר כירורגי 5-0 מתחת לווריד הנבוב התחתון, או IVC, ממש מתחת לכליה השמאלית החשופה. קשרו תקלה רופפת בתפר. לאחר מכן, הניחו עוד תפר כירורגי 5-0 סביב וריד פורטל הכבד.מניחים את התפר ממש מעל נקודת ההסתעפות של וריד הטחול של וריד פורטל הכבד. שוב, קשרו תקלה רופפת בתפר. תוך שימוש בתפר הווריד הפורטלי כמתח, הכניסו את הצנתר IV בעל 20 המדים לווריד פורטל הכבד סנטימטר אחד מתחתיו, שם הוא מסתעף לווריד פורטל הכבד הימני והשמאלי.לאחר מכן, החליקו את הצנתר במעלה הווריד, אך שמרו אותו מתחת לאזור ההסתעפות. אפשרו לדם לנוע במורד הצנתר עד שהוא מתחיל לטפטף החוצה. אבטח את קטטר IV עם תפר הווריד הפורטלי.השתמש בקו IV כדי לחבר בקבוק IV עם חיץ A לצנתר. לאחר מכן, לשטוף את הכבד עם פתרון זה תוך הימנעות כניסת אוויר לתוך המערכת. קשרו את התפר סביב ה-IVC שמתחת לכליה.לאחר מכן, חותכים את ה- IVC מתחת לתפר כדי לאפשר לבעל החיים לדמם החוצה. לאחר ההחדרה, חתכו את הקיבה, המעיים, הטחול ושאר הפתחים המחוברים לכבד. לאחר מכן, חתכו את הסרעפת ואת כלי הדם העיקריים מחלל בית החזה.מוציאים את הכבד מבעל החיים ומניחים אותו על מגש הזלוף. יש להסיר בזהירות את קו ה- IV ולחבר את תמיסת הקולגןאז בתא המשחזר. אפשרו לכבד לחלחל עד שהקפסולה תהפוך למודל ותיראה מטושטשת.זה אמור להימשך בדרך כלל 10 עד 15 דקות. לאחר העיכול, מוציאים את הכבד מהתא ומניחים אותו על צלחת פטרי באורך 10 ס"מ עם כ-20 מיליליטר של DMEM ללא סרום. לקטוף בעדינות את הכבד עם כמה קצוות פיפטה ולהשליך את עץ המרה.לאחר מכן, לסנן את תרחיף הכבד דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי של 50 מיליליטר. צנטריפוגה של השעיית התא ב-50 פעמים G למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לאסוף את supernatant המכיל תאים כבד שאינם parenchymal.צנטריפוגה את הסופרנטנט ב 300 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, לאסוף את גלולת התא ולהחיות אותו במיליליטר אחד של חיץ בידוד. קבע את מספר התא באמצעות מונה תאים אוטומטי בהתאם להוראות היצרן.לאחר מכן, צנטריפוגה את מתלה התא. לשאוף את הסופרנטנט לחלוטין ולהחזיר את הכדור עם 90 מיקרוליטרים של מאגר בידוד לכל 10 מיליון תאים. הוסף 10 מיקרוליטרים של CD146 MicroBeads לכל 10 מיליון תאים בסך הכל.מערבבים אותו היטב ודוגרים במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. כדי לשטוף את התאים, הוסיפו אחד עד שני מיליליטרים של מאגר בידוד לכל 10 מיליון תאים. צנטריפוגה הפתרון ב 300 פעמים G במשך 10 דקות.לאחר מכן, שאפו את הסופרנאטנט לחלוטין והחזירו עד מיליארד תאים ב-500 מיקרוליטרים של מאגר בידוד. לאחר מכן, הכינו את עמוד ההפרדה על ידי שטיפתו בשלושה מיליליטרים של מאגר בידוד. החל את מתלה התא על העמודה הערומה עם מסנני קדם-הפרדה של 70 מיקרומטר.לשטוף את העמוד עם שלושה מיליליטרים של חיץ בידוד שלוש פעמים. לאחר מכן, הסר את העמוד מהמפריד והנח אותו על צינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר. פיפט חמישה מיליליטרים של חיץ בידוד על העמוד.כדי לשחזר את התאים המסומנים בחרוזים מגנטיים, דחפו בחוזקה את הבוכנה לתוך העמודה כדי לשטוף את התאים. לבסוף, צנטריפוגה של התאים ב 300 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. טוהר LSECs מבודדים וסמני פני השטח הוערכו באמצעות ציטומטריית זרימה.ניתוח נתונים ואסטרטגיית גידור עבור LSECs וסינגלטים מגודרים מבוססים על נתוני פיזור קדימה ופיזור צד. LSECs מבודדים הוכתמו בצבע כדאיות ושילוב של נוגדנים CD45, CD146 ו-Stabilin-2. LSECs בני קיימא היו מגודרים על אוכלוסייה שלילית CD45 ונותחו עבור ביטוי CD146 ו- Stabilin-2.מנתונים אלה, אושר כי LSECs מבודדים היה יותר מ 94% כדאיות ו יותר מ 90% טוהר. הפנוטיפ הספציפי ל-LSEC של התאים המבודדים אושר עוד יותר באמצעות מיקרוסקופיית אור ומיקרוסקופ אלקטרונים סורק. LSECs מבודדים עברו תרבית במדיום הצמיחה המלא במשך שש שעות ונבחנו על ידי מיקרוסקופיית אור.החצים הלבנים בתמונת SEM מציינים את LSEC fenestrae, שהוא מאפיין מורפולוגי אופייני של LSECs. הצעדים הקריטיים להבטחת זלוף מלא של רקמת הכבד הם מיקום נכון של סרט קטטר, הימנעות מהכנסת אוויר לצנתר, והתזמון האופטימלי של עיכול הקולגנאז. LSEC באיכות גבוהה שנרכשה באמצעות הפרוטוקול שלנו תקל על זיהוי המנגנון המולקולרי של תפקוד LSEC ותשפר את הבנתנו את תפקידם בתקשורת בין-תאית בכבד, בבריאות ובמחלות.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Valvular Endothelial Cells

בידוד של תאים אנדותל valvular

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Isolation &#38; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Isolation & Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

בידוד &amp; אפיון Hoechst נמוך CD45 שלילי עכבר mesenchymal ריאות בתאי גזע

Tissue resident mesenchymal stem cells (MSC) are important regulators of tissue repair or regeneration, fibrosis, inflammation, angiogenesis and tumor ...

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

בידוד של תאים ראשוניים עכבר Trophoblast וAssay הפלישה Trophoblast

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

בידוד של תאי האנדותל חדרית עובריים

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

בידוד והתרבות של תאי לבלב הראשיים acinar עכבר

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

בידוד של תאי Murine Valve האנדותל

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

A Standardized Method for the Analysis of Liver Sinusoidal Endothelial Cells and Their Fenestrations by Scanning Electron Microscopy

סטנדרטי שיטה לניתוח של תאי הכבד סינוסי האנדותל וFenestrations על ידי סריקה מיקרוסקופית אלקטרונים

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

בידוד והתרבות ראשית של לתאי אנדותל עכבר אב העורקים

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells

פרוטוקול הבידוד של hepatocytes האדם הראשי הקביל סרן אוכלוסיות של תאים בכבד ללא parenchymal

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic ...

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

בידוד של תאי האנדותל העכבר כלילי

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...