Name: isolation and characterization of mouse primary liver sinusoidal endothelial cells
Uploaded: 2021-12-16T15:00:00
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この研究は、NIHの国立糖尿病・消化器・腎臓病研究所(1RO1DK122948からSHI)とNIHシルヴィオ・O・コンテ消化器疾患研究コアセンターP30助成金機構(DK084567)の支援を受けた。また、日本学術振興会(JSPS)在外特別研究員によるKFへの支援も行いました。また、グレゴリー・J・ゴアズ博士とスティーブン・ブロンク博士がコラゲナーゼ灌流装置を独自に設計し、最適化したことにも感謝の意を表します。

動物のプロトコルは、メイヨークリニックの施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認されたとおりに実施されました。8週齢のC57BL/6J雄マウスをジャクソン研究所から購入した。マウスを、食事への自由なアクセスを有する温度制御された12:12-h明暗サイクル施設に飼育した。
コラーゲンコート培養皿またはプレートの調製
<ol><li>50 mL の 0.02 mol/L 酢?...

<ol>
	<li>Morin, O., Goulet, F., Normand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+sinusoidal+endothelial+cells:+isolation,+purification,+characterization+and+interaction+with+hepatocytes.">Liver sinusoidal endothelial cells: isolation, purification, characterization and interaction with hepatocytes.</a> Revisiones Sobre Biologia Celular: RBC. 15, 1-85 (1988).</li><li>Ibrahim, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sinusoidal+endotheliopathy+in+nonalcoholic+steatohepatitis:+therapeutic+implications.">Sinusoidal endotheliopathy in nonalcoholic steatohepatitis: therapeutic implications.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 321 (1), 67-74 (2021).</li><li>Poisson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+sinusoidal+endothelial+cells:+Physiology+and+role+in+liver+diseases.">Liver sinusoidal endothelial cells: Physiology and role in liver diseases.</a> Journal of Hepatology. 66 (1), 212-227 (2017).</li><li>Marrone, G., Shah, V. H., Gracia-Sancho, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sinusoidal+communication+in+liver+fibrosis+and+regeneration.">Sinusoidal communication in liver fibrosis and regeneration.</a> Journal of Hepatology. 65 (3), 608-617 (2016).</li><li>Shetty, S., Lalor, P. F., Adams, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+sinusoidal+endothelial+cells+-+gatekeepers+of+hepatic+immunity.">Liver sinusoidal endothelial cells - gatekeepers of hepatic immunity.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. 15 (9), 555-567 (2018).</li><li>Smedsr&#248;d, B., Pertoft, H., Gustafson, S., Laurent, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scavenger+functions+of+the+liver+endothelial+cell.">Scavenger functions of the liver endothelial cell.</a> Biochemical Journal. 266 (2), 313-327 (1990).</li><li>DeLeve, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+sinusoidal+endothelial+cells+in+hepatic+fibrosis.">Liver sinusoidal endothelial cells in hepatic fibrosis.</a> Hepatology. 61 (5), 1740-1746 (2015).</li><li>Dar, W. A., Sullivan, E., Bynon, J. S., Eltzschig, H., Ju, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischaemia+reperfusion+injury+in+liver+transplantation:+Cellular+and+molecular+mechanisms.">Ischaemia reperfusion injury in liver transplantation: Cellular and molecular mechanisms.</a> Liver International. 39 (5), 788-801 (2019).</li><li>Furuta, K., Guo, Q., Hirsova, P., Ibrahim, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Roles+of+Liver+Sinusoidal+Endothelial+Cells+in+Nonalcoholic+Steatohepatitis.">Emerging Roles of Liver Sinusoidal Endothelial Cells in Nonalcoholic Steatohepatitis.</a> Biology. 9 (11), 395 (2020).</li><li>Wu, L. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+functional+differences+between+human+liver+cancer+endothelial+cells+and+liver+sinusoidal+endothelial+cells.">Phenotypic and functional differences between human liver cancer endothelial cells and liver sinusoidal endothelial cells.</a> Journal of Vascular Research. 45 (1), 78-86 (2008).</li><li>Meyer, J., Gonelle-Gispert, C., Morel, P., B&#252;hler, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+isolation+and+purification+of+murine+liver+sinusoidal+endothelial+cells:+A+systematic+review.">Methods for isolation and purification of murine liver sinusoidal endothelial cells: A systematic review.</a> PLoS One. 11 (3), 0151945 (2016).</li><li>Meyer, J., Lacotte, S., Morel, P., Gonelle-Gispert, C., Buhler, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+for+mouse+liver+sinusoidal+endothelial+cell+isolation.">An optimized method for mouse liver sinusoidal endothelial cell isolation.</a> Experimental Cell Research. 349 (2), 291-301 (2016).</li><li>Furuta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-induced+endothelial+vascular+cell+adhesion+molecule+1+promotes+nonalcoholic+steatohepatitis+pathogenesis.">Lipid-induced endothelial vascular cell adhesion molecule 1 promotes nonalcoholic steatohepatitis pathogenesis.</a> Journal of Clinical Investigation. 131 (6), (2021).</li><li>Guo, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+&#946;(1)-enriched+extracellular+vesicles+mediate+monocyte+adhesion+and+promote+liver+inflammation+in+murine+NASH.">Integrin &#946;(1)-enriched extracellular vesicles mediate monocyte adhesion and promote liver inflammation in murine NASH.</a> Journal of Hepatology. 71 (1), 1193-1205 (2019).</li><li>Hirsova, P., Ibrahim, S. H., Bronk, S. F., Yagita, H., Gores, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vismodegib+suppresses+TRAIL-mediated+liver+injury+in+a+mouse+model+of+nonalcoholic+steatohepatitis.">Vismodegib suppresses TRAIL-mediated liver injury in a mouse model of nonalcoholic steatohepatitis.</a> PLoS One. 8 (7), 70599 (2013).</li><li>Schrage, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+CD146+is+widely+expressed+on+endothelial+cells+and+is+recognized+by+the+monoclonal+antibody+ME-9F1.">Murine CD146 is widely expressed on endothelial cells and is recognized by the monoclonal antibody ME-9F1.</a> Histochemistry and Cell Biology. 129 (4), 441-451 (2008).</li><li>Olsavszky, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+transcriptomic+network+of+multi-ligand+scavenger+receptor+Stabilin-1-+and+Stabilin-2-deficient+liver+sinusoidal+endothelial+cells.">Exploring the transcriptomic network of multi-ligand scavenger receptor Stabilin-1- and Stabilin-2-deficient liver sinusoidal endothelial cells.</a> Gene. 768, 145284 (2021).</li><li>DeLeve, L. D., Maretti-Mira, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+sinusoidal+endothelial+cell:+An+update.">Liver sinusoidal endothelial cell: An update.</a> Seminars in Liver Disease. 37 (4), 377-387 (2017).</li><li>DeLeve, L. D., Wang, X., Hu, L., McCuskey, M. K., McCuskey, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+liver+sinusoidal+endothelial+cell+phenotype+is+maintained+by+paracrine+and+autocrine+regulation.">Rat liver sinusoidal endothelial cell phenotype is maintained by paracrine and autocrine regulation.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 287 (4), 757-763 (2004).</li><li>Cabral, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+hepatocytes+and+sinusoidal+endothelial+cells+from+mouse+liver+perfusion.">Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).</li><li>Ishiguro, K., Yan, I. K., Patel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+tissue+extracellular+vesicles+from+the+liver.">Isolation of tissue extracellular vesicles from the liver.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e58649 (2019).</li><li>Topp, S. A., Upadhya, G. A., Strasberg, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cold+preservation+of+isolated+sinusoidal+endothelial+cells+in+MMP+9+knockout+mice:+effect+on+morphology+and+platelet+adhesion.">Cold preservation of isolated sinusoidal endothelial cells in MMP 9 knockout mice: effect on morphology and platelet adhesion.</a> Liver Transplantation. 10 (8), 1041-1048 (2004).</li><li>Katz, S. C., Pillarisetty, V. G., Bleier, J. I., Shah, A. B., DeMatteo, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+sinusoidal+endothelial+cells+are+insufficient+to+activate+T+cells.">Liver sinusoidal endothelial cells are insufficient to activate T cells.</a> Journal of Immunology. 173 (1), 230-235 (2004).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+preparation+method+for+isolation+of+single-cell+types+from+mouse+liver+for+proteomic+studies.">Sample preparation method for isolation of single-cell types from mouse liver for proteomic studies.</a> Proteomics. 11 (17), 3556-3564 (2011).</li><li>Do, H., Healey, J. F., Waller, E. K., Lollar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+factor+VIII+by+murine+liver+sinusoidal+endothelial+cells.">Expression of factor VIII by murine liver sinusoidal endothelial cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (28), 19587-19592 (1999).</li><li>Schrage, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+T+cell+transmigration+across+the+murine+liver+sinusoidal+endothelium+is+mediated+by+transcytosis+and+surface+presentation+of+chemokines.">Enhanced T cell transmigration across the murine liver sinusoidal endothelium is mediated by transcytosis and surface presentation of chemokines.</a> Hepatology. 48 (4), 1262-1272 (2008).</li><li>Chou, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysophosphatidic+acid+alters+the+expression+profiles+of+angiogenic+factors,+cytokines,+and+chemokines+in+mouse+liver+sinusoidal+endothelial+cells.">Lysophosphatidic acid alters the expression profiles of angiogenic factors, cytokines, and chemokines in mouse liver sinusoidal endothelial cells.</a> PLoS One. 10 (3), 0122060 (2015).</li><li>Deleve, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dacarbazine+toxicity+in+murine+liver+cells:+a+model+of+hepatic+endothelial+injury+and+glutathione+defense.">Dacarbazine toxicity in murine liver cells: a model of hepatic endothelial injury and glutathione defense.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 268 (3), 1261-1270 (1994).</li><li>Smedsr&#248;d, B., Pertoft, H., Eggertsen, G., Sundstr&#246;m, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+morphological+characterization+of+cultures+of+Kupffer+cells+and+liver+endothelial+cells+prepared+by+means+of+density+separation+in+Percoll,+and+selective+substrate+adherence.">Functional and morphological characterization of cultures of Kupffer cells and liver endothelial cells prepared by means of density separation in Percoll, and selective substrate adherence.</a> Cell and Tissue Research. 241 (3), 639-649 (1985).</li><li>Despoix, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+CD146/MCAM+is+a+marker+of+natural+killer+cell+maturation.">Mouse CD146/MCAM is a marker of natural killer cell maturation.</a> European Journal of Immunology. 38 (10), 2855-2864 (2008).</li><li>Strauss, O., Phillips, A., Ruggiero, K., Bartlett, A., Dunbar, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+identifies+distinct+subsets+of+endothelial+cells+in+the+human+liver.">Immunofluorescence identifies distinct subsets of endothelial cells in the human liver.</a> Scientific Reports. 7, 44356 (2017).</li><li>Halpern, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paired-cell+sequencing+enables+spatial+gene+expression+mapping+of+liver+endothelial+cells.">Paired-cell sequencing enables spatial gene expression mapping of liver endothelial cells.</a> Nature Biotechnology. 36 (10), 962-970 (2018).</li></ol>

現在の原稿では、2段階のコラゲナーゼ灌流とそれに続く磁気活性化細胞選別(MACS)からなるマウス肝臓からのLSEC単離のためのプロトコルを記述している。このプロトコルは、以下の3つのステップからなる:(1)PVをカルシウムを含まない緩衝液で灌流し、続いてコラゲナーゼ含有緩衝液を用いて肝細胞分散を達成する。(2)低速遠心分離による肝細胞の排除;(3)抗CD146磁気ビーズを用いた非実質細胞(...

肝正弦波内皮細胞(LSEC)は、肝正弦波壁に並び、肝臓1の中で最も豊富な非実質細胞である。LSECは、フェネストラの存在および古典的な基底膜または隔膜の欠如によって、体内の他の場所にある他の毛細血管内皮細胞と区別される2,3。したがって、LSECは、脂質およびリポタンパク質を含む様々な循環巨大分子を排除する透過性およびエンドサイトーシス能力を高める独特の表現型および構造特性を有する。LSECは、星状細胞や免疫細胞などの実質細胞と非実質細胞のクロストークにおいて極めて重要な役割を果たしています。LSECは、星状細胞およびクッパー細胞を静止状態に保つことによって肝臓恒常性を維持する上で重要である4。LSECsは、循環白血球の接着および経内皮遊走を媒介することによって肝免疫細胞集団の組成を調節する5,6。虚血再灌流傷害(IRI)8、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)9、および肝細胞癌(HCC)を含む急性および慢性肝障害7の間、LSECは毛細血管化として知られる表現型変化を受け、防御および基底膜10の形成を特徴とする。LSECにおけるこれらの表現型変化は、LSECの機能不全および血栓形成促進性、炎症促進性、および線維形成促進性の獲得と関連している。
マウス肝臓からLSECを単離するためのいくつかの方法が開発されている11。いくつかの技術は、非実質細胞および実質細胞を分離し、続いて密度勾配遠心分離を行い、LSECを非実質画分から精製することに依存する。この方法の限界は、LSECs単離の最終ステップにおける汚染性マクロファージの存在であり、これは単離されたLSECs12の純度に影響を与え得る。このプロトコールは、LSECを精製するためのマウス肝臓およびCD146+磁気ビーズ陽性の非実質細胞のコラゲナーゼ灌流に基づいている。この方法を用いて単離されたLSECは、高純度で保存された形態および生存率を示す。これらのLSECは、透過性および接着アッセイを含む機能研究、ならびに関心のある経路の下流研究に最適です。さらに、臨床研究と発見科学の両方で大きなデータセットを生成することへの関心の高まりに伴い、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)または他の状態の健康な肝臓と病気の両方の肝臓から分離されたこれらの高品質のLSECを個別にプールまたは使用することができ、マルチオミクスデータ生成と健康と病気の比較が可能になります13,14.さらに、単離されたLSECは、LSECにおける活性化されたシグナル伝達経路および異なる有害刺激下で、および様々な治療介入に応答して他の肝細胞との細胞間通信を解読するために、オルガノイドのような2次元および3次元のインビトロモデルを開発するために使用することができる。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2.0-inch 20 G Intra Venous (IV) catheter</td>
			<td>Terumo, SOmerset, NJ, USA</td>
			<td>SR-OX2051CA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#8211;3-inch perfuion tray with a hole in the center</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>customized; made in house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>405/520 viability dye</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-110-205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-inch regular curved dressing forceps</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>FS16-100-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-0 Perma-Hand silk suture</td>
			<td>Ethicon, Raritan, NJ, USA</td>
			<td>A182H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-stabilin-2 (Mouse) mAb-Alexa Fluor&#195; 488</td>
			<td>MBL International, Woburn, MA, USA</td>
			<td>D317-A48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA stock</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD146 (LSEC)-PE, anti-mouse</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-118-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD146 (LSEC) MicroBeads, mouse</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-092-007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD45-Viogreen, anti-mouse</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-110-803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen type I</td>
			<td>Corning, Corning, NY, USA</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase II</td>
			<td>Gibco, Waltham, MA, USA</td>
			<td>17101-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial cells growth medium</td>
			<td>ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>211-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FcR blocking reagent, mouse</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-092-575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo software, version 10.6</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardened Fine scissors</td>
			<td>F.S.T, Foster city, CA, USA</td>
			<td>14091-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated (37 &#176;C) and humidified recirculating perfusion apparatus equipped with Oxygen injection at a rate of 10psi.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>customized; made in house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hitachi S 4700 scanning electron microscope</td>
			<td>Hitachi Inc, Pleasanton, CA, USA</td>
			<td>SEM096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS columns</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS pre-separation filters (70 &#956;m)</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-095-823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS rinsing buffer</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-091-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Smart Strainer (70 &#956;m)</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-098-462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACSQunt flow cytometer</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell Cell Culture Insert</td>
			<td>Millipore Sigma, Burlington, MA, USA</td>
			<td>PITP01250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nexcelom cell counter</td>
			<td>Nexcelom bioscience, Lawrence, MA, USA</td>
			<td>Cellometer Auto T4 Plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare, Chicago, IL, USA</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>F.S.T, Foster city, CA, USA</td>
			<td>14001-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Very small curved dressing forceps</td>
			<td>F.S.T, Foster city, CA, USA</td>
			<td>11063-07</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of mouse primary liver sinusoidal endothelial cells

肝正弦波内皮細胞(LSEC)は、循環と肝実質との界面に位置する特殊な内皮細胞である。LSECは、フェネストラの存在および基底膜の欠如を特徴とする明確な形態を有する。LSECは、代謝調節不全、炎症、線維症、血管新生、および発癌を含む肝臓における多くの病理学的障害において不可欠な役割を果たす。しかし、LSECの単離と特性評価についてはほとんど発表されていない。ここで、このプロトコルは、健常および非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)マウスの両方からのLSECの単離について論じる。プロトコールは、LSECを精製するためのマウス肝臓および非実質細胞の磁気ビーズ陽性選択のコラゲナーゼ灌流に基づいている。本研究では、フローサイトメトリーによる特異的マーカーを用いてLSECを特徴付け、走査型電子顕微鏡により特徴的な表現型の特徴を同定する。このプロトコールに従って単離されたLSECは、接着および透過性アッセイを含む機能的研究、ならびに関心のある特定の経路についての下流研究に使用することができる。さらに、これらのLSECは個別にプールまたは使用することができ、RNA-seqバルクまたは単一細胞、プロテオミクスまたはホスホプロテオミクス、およびシーケンシング(ATAC-seq)を使用したトランスポザーゼアクセシブルクロマチンのアッセイなどのマルチオミクスデータ生成を可能にします。このプロトコルは、健康および疾患におけるLSECと他の肝細胞とのコミュニケーションを研究する研究者にとって有用であり、急性および慢性肝障害の病原性メカニズムにおけるLSECの役割の詳細な理解を可能にする。

実験回路図と装置のセットアップ: このプロトコールでは、マウス肝臓を閉鎖灌流回路を用いて消化し、次いで、非実質細胞および肝細胞を、50 x g で2分間の低速遠心分離によって分離した。一次LSECは、非実質画分からのCD146磁気ビーズ選択を用いて単離した。実験模式を 図1Aに示す。カニューレをPVを通して配置し、下大静脈を縛り付けて、肝臓?...

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Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

ここでは、初代マウス肝臓正弦波内皮細胞(LSEC)単離のためのプロトコールを概説し、実証する。このプロトコールは、肝臓コラゲナーゼ灌流、低速遠心分離による非実質細胞精製、およびCD146磁気ビーズ選択に基づいている。また、フローサイトメトリーと走査型電子顕微鏡を用いて、これらの単離されたLSECの表現型と特性評価も行っています。

マウス初代肝臓正弦波内皮細胞の単離と特性評価

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...

ここでは、初代マウス肝正弦波細胞単離またはLSECs単離のプロトコールを実証する。このプロトコルは、非実質細胞精製およびCD146磁気ビーズ選択のための肝臓コラゲナーゼ灌流および低速超遠心分離からなる。当社のLSEC単離法は非常に効率的で、健康なマウスや病気のマウス肝臓に適用できます。絶縁されたLSECは高純度を示し、構造と機能を維持します。このプロトコルを使用して単離されたLSECは、機能的および分子的研究およびマルチオミクスデータ生成に最適です。このプロトコルは、肝臓における細胞間通信を研究するのに役立ちます。10センチメートルの培養皿に3ミリリットルのコラーゲン溶液をコーティングすることから始めます。その後、ディッシュを室温で1時間インキュベートする。1時間後、コーティングされた表面から余分な流体を除去する。PBSで食器を3回洗い、風乾させます。加熱加湿再循環灌流装置を設置する。10%の漂白剤を使用して灌流システムを5分間すすぎます。その後、滅菌水でさらに10分間システムを再すすいでください。コラゲナーゼ溶液で灌流する前に、できるだけすすぎ液を排出してください。コラゲナーゼ溶液を灌流システムを通して注入し、摂氏37度に予温する。速度制御ダイヤルでポンプ速度を速度 1 に設定します。手順全体を通して同じ速度を維持します。手順のためにマウスの重量を量ります。その後、手術面に固定します。マウス腹部に70%エタノールを噴霧する。外科用はさみを使用して、腹部の下部から剣状突起まで約5センチメートルの切開を行う。その後、腹部の両側に小さな虹彩はさみを使用して2つの横方向の切り傷を作り、腹部の器官を完全に露出させます。IVカテーテルのシースを動物の背中の下に置き、腹部を持ち上げて水平にします。通常の湾曲したドレッシング鉗子を使用して、腸と胃を動物の左側に静かに引き離します。次に、露出した左腎臓のすぐ下の下大静脈(IVC)の下に5-0の外科用縫合糸を置きます。縫合糸に緩いヒッチを結びます。次に、肝門脈の周りに別の5-0外科的縫合糸を置く。縫合糸を肝門脈の脾静脈分岐点のすぐ上に置きます。もう一度、縫合糸に緩いヒッチを結びます。門脈縫合糸を張力として用い、20ゲージIVカテーテルを1cm下の肝門脈に挿入し、左右の肝門脈に分岐させる。次に、カテーテルを静脈上にスライドさせますが、分岐領域の下に保ちます。血液が滴り落ち始めるまでカテーテルを下るのを許します。IVカテーテルを門脈縫合糸で固定する。IVラインを使用して、バッファAの入ったIVボトルをカテーテルに取り付けます。次に、システムへの空気の侵入を避けながら、この溶液で肝臓を洗い流します。腎臓の下のIVCの周りに縫合糸を結びます。その後、動物が出血できるように縫合糸の下のIVCをカットします。灌流したら、胃、腸、脾臓、肝臓に付着した他の内臓を切り取ります。次に、横隔膜および主要血管を胸腔から切り取ります。動物から肝臓を取り出し、それを灌流トレイの上に置きます。IVラインを慎重に取り外し、再循環チャンバ内のコラゲナーゼ溶液をフックアップする。カプセルがモデル化され、濁って見えるまで肝臓に灌流させます。通常、これには 10 ~ 15 分かかります。消化したら、肝臓をチャンバーから取り出し、約20ミリリットルの無血清DMEMを入れた10センチメートルのペトリ皿の上に置きます。いくつかのピペットチップで肝臓を優しく拾い上げ、胆道の木を捨てます。その後、肝臓懸濁液を70マイクロメートルのセルストレーナーを通して50ミリリットルの円錐形チューブに濾過する。細胞懸濁液を室温で2分間50倍Gで遠心分離する。次いで、非実質肝細胞を含む上清を回収する。上清を300倍Gで4°Cで5分間遠心分離する。その後、細胞ペレットを収集し、1ミリリットルの単離緩衝液に再懸濁する。製造元の指示に従って、自動セルカウンターを使用してセル番号を確認します。次に、細胞懸濁液を遠心分離する。上清を完全に吸引し、1000万細胞あたり90マイクロリットルの単離緩衝液でペレットを再懸濁する。総細胞1,000万個あたり10マイクロリットルのCD146マイクロビーズを加える。それをよく混ぜて、摂氏4度で15分間インキュベートします。細胞を洗浄するには、1,000万個の細胞あたり1〜2ミリリットルの単離緩衝液を加える。溶液を300倍Gで10分間遠心分離する。その後、上清を完全に吸引し、500マイクロリットルの単離緩衝液に最大10億個の細胞を再懸濁する。次に、3ミリリットルの分離バッファーでリンスして分離カラムを作製する。細胞懸濁液を、70マイクロメートルの予備分離フィルターを積み重ねたカラムに塗布します。カラムを 3 ミリリットルの分離バッファーで 3 回洗浄します。その後、分離器からカラムを取り出し、15ミリリットルの遠沈管の上に置きます。5ミリリットルの単離バッファーをカラム上にピペットする。磁気ビーズ標識細胞を回収するには、プランジャーをカラムにしっかりと押し込んで細胞を洗い流します。最後に、細胞を300回Gで4°Cで5分間遠心分離する。単離されたLSECの純度および表面マーカーをフローサイトメトリーで評価した。ゲートLSECおよびシングルレットのデータ分析およびゲーティング戦略は、前方散乱および側方散乱データに基づいています。単離されたLSECを、生存率色素およびCD45、CD146およびスタビリン−2抗体の組み合わせで染色した。生存可能なLSECをCD45陰性集団上でゲーティングし、CD146およびスタビリン−2発現について分析した。このデータから、単離されたLSECは94%を超える生存率および90%を超える純度を有することが確認された。単離された細胞のLSEC特異的表現型を、光学顕微鏡および走査型電子顕微鏡を用いてさらに確認した。単離されたLSECsを完全増殖培地中で6時間培養し、光学顕微鏡によって調べた。SEM画像の白い矢印は、LSECの特徴的な形態学的特徴であるLSECフェネストラを示している。肝臓組織の完全な灌流を確実にするための重要なステップは、適切なカテーテルテープの位置決め、カテーテルへの空気の導入の回避、およびコラゲナーゼ消化の最適なタイミングです。当社のプロトコールを用いて取得した高品質のLSECは、LSEC機能の分子機構の同定を容易にし、肝臓、健康および疾患における細胞間通信におけるそれらの役割の理解を改善する。

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Valvular Endothelial Cells

弁内皮細胞の単離

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Isolation &#38; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Isolation & Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

ヘキストの分離および特性評価低 CD45負マウス肺間葉系幹細胞

Tissue resident mesenchymal stem cells (MSC) are important regulators of tissue repair or regeneration, fibrosis, inflammation, angiogenesis and tumor ...

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

マウスの主栄養膜細胞と絨毛浸潤アッセイの分離

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

胚心室内皮細胞の単離

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

マウスプライマリ膵臓腺房細胞の単離と培養

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

ネズミ弁内皮細胞の単離

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

A Standardized Method for the Analysis of Liver Sinusoidal Endothelial Cells and Their Fenestrations by Scanning Electron Microscopy

走査型電子顕微鏡による肝類洞内皮細胞およびそれらの開窓の分析のための標準化された方法

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

マウス大動脈内皮細胞の単離および初代培養

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells

初代ヒト肝細胞と非実質肝細胞の対応する主な集団の単離のためのプロトコル

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic ...

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

マウスの冠動脈内皮細胞の単離

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...