Name: isolation and characterization of mouse primary liver sinusoidal endothelial cells
Uploaded: 2021-12-16T15:00:00
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이 연구는 NIH의 당뇨병 및 소화기 및 신장 질환의 국립 연구소 (1RO1DK122948 내지 SHI)와 NIH Silvio O. Conte 소화기 질환 연구 핵심 센터 P30 부여 메커니즘 (DK084567)에 의해 지원되었습니다. 일본 과학진흥회(JSPS) 해외연구펠로우십에서도 KF에 지원을 제공받았다. 우리는 또한 Gregory J. Gores 박사와 Steven Bronk 박사가 콜라게나제 관류 장치의 원래 설계 및 최적화에 대해 인정하고 싶습니다.

동물 프로토콜은 Mayo Clinic의 IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받아 수행되었습니다. 여덟 주령의 C57BL/6J 수컷 마우스를 잭슨 연구소에서 구입하였다. 마우스는 온도 조절 12:12-h 밝은-어두움 사이클 시설에 수용되어 식이요법에 자유롭게 이용할 수 있었다.
1. 콜라겐 코팅 배양접시 또는 접시의 제조
<ol><li>0.02 mol/L 아세트산 50 mL를 만들려면H2O</s...

<ol>
	<li>Morin, O., Goulet, F., Normand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+sinusoidal+endothelial+cells:+isolation,+purification,+characterization+and+interaction+with+hepatocytes.">Liver sinusoidal endothelial cells: isolation, purification, characterization and interaction with hepatocytes.</a> Revisiones Sobre Biologia Celular: RBC. 15, 1-85 (1988).</li><li>Ibrahim, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sinusoidal+endotheliopathy+in+nonalcoholic+steatohepatitis:+therapeutic+implications.">Sinusoidal endotheliopathy in nonalcoholic steatohepatitis: therapeutic implications.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 321 (1), 67-74 (2021).</li><li>Poisson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+sinusoidal+endothelial+cells:+Physiology+and+role+in+liver+diseases.">Liver sinusoidal endothelial cells: Physiology and role in liver diseases.</a> Journal of Hepatology. 66 (1), 212-227 (2017).</li><li>Marrone, G., Shah, V. H., Gracia-Sancho, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sinusoidal+communication+in+liver+fibrosis+and+regeneration.">Sinusoidal communication in liver fibrosis and regeneration.</a> Journal of Hepatology. 65 (3), 608-617 (2016).</li><li>Shetty, S., Lalor, P. F., Adams, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+sinusoidal+endothelial+cells+-+gatekeepers+of+hepatic+immunity.">Liver sinusoidal endothelial cells - gatekeepers of hepatic immunity.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. 15 (9), 555-567 (2018).</li><li>Smedsr&#248;d, B., Pertoft, H., Gustafson, S., Laurent, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scavenger+functions+of+the+liver+endothelial+cell.">Scavenger functions of the liver endothelial cell.</a> Biochemical Journal. 266 (2), 313-327 (1990).</li><li>DeLeve, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+sinusoidal+endothelial+cells+in+hepatic+fibrosis.">Liver sinusoidal endothelial cells in hepatic fibrosis.</a> Hepatology. 61 (5), 1740-1746 (2015).</li><li>Dar, W. A., Sullivan, E., Bynon, J. S., Eltzschig, H., Ju, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischaemia+reperfusion+injury+in+liver+transplantation:+Cellular+and+molecular+mechanisms.">Ischaemia reperfusion injury in liver transplantation: Cellular and molecular mechanisms.</a> Liver International. 39 (5), 788-801 (2019).</li><li>Furuta, K., Guo, Q., Hirsova, P., Ibrahim, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Roles+of+Liver+Sinusoidal+Endothelial+Cells+in+Nonalcoholic+Steatohepatitis.">Emerging Roles of Liver Sinusoidal Endothelial Cells in Nonalcoholic Steatohepatitis.</a> Biology. 9 (11), 395 (2020).</li><li>Wu, L. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+functional+differences+between+human+liver+cancer+endothelial+cells+and+liver+sinusoidal+endothelial+cells.">Phenotypic and functional differences between human liver cancer endothelial cells and liver sinusoidal endothelial cells.</a> Journal of Vascular Research. 45 (1), 78-86 (2008).</li><li>Meyer, J., Gonelle-Gispert, C., Morel, P., B&#252;hler, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+isolation+and+purification+of+murine+liver+sinusoidal+endothelial+cells:+A+systematic+review.">Methods for isolation and purification of murine liver sinusoidal endothelial cells: A systematic review.</a> PLoS One. 11 (3), 0151945 (2016).</li><li>Meyer, J., Lacotte, S., Morel, P., Gonelle-Gispert, C., Buhler, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+for+mouse+liver+sinusoidal+endothelial+cell+isolation.">An optimized method for mouse liver sinusoidal endothelial cell isolation.</a> Experimental Cell Research. 349 (2), 291-301 (2016).</li><li>Furuta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-induced+endothelial+vascular+cell+adhesion+molecule+1+promotes+nonalcoholic+steatohepatitis+pathogenesis.">Lipid-induced endothelial vascular cell adhesion molecule 1 promotes nonalcoholic steatohepatitis pathogenesis.</a> Journal of Clinical Investigation. 131 (6), (2021).</li><li>Guo, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+&#946;(1)-enriched+extracellular+vesicles+mediate+monocyte+adhesion+and+promote+liver+inflammation+in+murine+NASH.">Integrin &#946;(1)-enriched extracellular vesicles mediate monocyte adhesion and promote liver inflammation in murine NASH.</a> Journal of Hepatology. 71 (1), 1193-1205 (2019).</li><li>Hirsova, P., Ibrahim, S. H., Bronk, S. F., Yagita, H., Gores, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vismodegib+suppresses+TRAIL-mediated+liver+injury+in+a+mouse+model+of+nonalcoholic+steatohepatitis.">Vismodegib suppresses TRAIL-mediated liver injury in a mouse model of nonalcoholic steatohepatitis.</a> PLoS One. 8 (7), 70599 (2013).</li><li>Schrage, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+CD146+is+widely+expressed+on+endothelial+cells+and+is+recognized+by+the+monoclonal+antibody+ME-9F1.">Murine CD146 is widely expressed on endothelial cells and is recognized by the monoclonal antibody ME-9F1.</a> Histochemistry and Cell Biology. 129 (4), 441-451 (2008).</li><li>Olsavszky, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+transcriptomic+network+of+multi-ligand+scavenger+receptor+Stabilin-1-+and+Stabilin-2-deficient+liver+sinusoidal+endothelial+cells.">Exploring the transcriptomic network of multi-ligand scavenger receptor Stabilin-1- and Stabilin-2-deficient liver sinusoidal endothelial cells.</a> Gene. 768, 145284 (2021).</li><li>DeLeve, L. D., Maretti-Mira, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+sinusoidal+endothelial+cell:+An+update.">Liver sinusoidal endothelial cell: An update.</a> Seminars in Liver Disease. 37 (4), 377-387 (2017).</li><li>DeLeve, L. D., Wang, X., Hu, L., McCuskey, M. K., McCuskey, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+liver+sinusoidal+endothelial+cell+phenotype+is+maintained+by+paracrine+and+autocrine+regulation.">Rat liver sinusoidal endothelial cell phenotype is maintained by paracrine and autocrine regulation.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 287 (4), 757-763 (2004).</li><li>Cabral, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+hepatocytes+and+sinusoidal+endothelial+cells+from+mouse+liver+perfusion.">Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).</li><li>Ishiguro, K., Yan, I. K., Patel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+tissue+extracellular+vesicles+from+the+liver.">Isolation of tissue extracellular vesicles from the liver.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e58649 (2019).</li><li>Topp, S. A., Upadhya, G. A., Strasberg, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cold+preservation+of+isolated+sinusoidal+endothelial+cells+in+MMP+9+knockout+mice:+effect+on+morphology+and+platelet+adhesion.">Cold preservation of isolated sinusoidal endothelial cells in MMP 9 knockout mice: effect on morphology and platelet adhesion.</a> Liver Transplantation. 10 (8), 1041-1048 (2004).</li><li>Katz, S. C., Pillarisetty, V. G., Bleier, J. I., Shah, A. B., DeMatteo, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+sinusoidal+endothelial+cells+are+insufficient+to+activate+T+cells.">Liver sinusoidal endothelial cells are insufficient to activate T cells.</a> Journal of Immunology. 173 (1), 230-235 (2004).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+preparation+method+for+isolation+of+single-cell+types+from+mouse+liver+for+proteomic+studies.">Sample preparation method for isolation of single-cell types from mouse liver for proteomic studies.</a> Proteomics. 11 (17), 3556-3564 (2011).</li><li>Do, H., Healey, J. F., Waller, E. K., Lollar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+factor+VIII+by+murine+liver+sinusoidal+endothelial+cells.">Expression of factor VIII by murine liver sinusoidal endothelial cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (28), 19587-19592 (1999).</li><li>Schrage, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+T+cell+transmigration+across+the+murine+liver+sinusoidal+endothelium+is+mediated+by+transcytosis+and+surface+presentation+of+chemokines.">Enhanced T cell transmigration across the murine liver sinusoidal endothelium is mediated by transcytosis and surface presentation of chemokines.</a> Hepatology. 48 (4), 1262-1272 (2008).</li><li>Chou, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysophosphatidic+acid+alters+the+expression+profiles+of+angiogenic+factors,+cytokines,+and+chemokines+in+mouse+liver+sinusoidal+endothelial+cells.">Lysophosphatidic acid alters the expression profiles of angiogenic factors, cytokines, and chemokines in mouse liver sinusoidal endothelial cells.</a> PLoS One. 10 (3), 0122060 (2015).</li><li>Deleve, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dacarbazine+toxicity+in+murine+liver+cells:+a+model+of+hepatic+endothelial+injury+and+glutathione+defense.">Dacarbazine toxicity in murine liver cells: a model of hepatic endothelial injury and glutathione defense.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 268 (3), 1261-1270 (1994).</li><li>Smedsr&#248;d, B., Pertoft, H., Eggertsen, G., Sundstr&#246;m, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+morphological+characterization+of+cultures+of+Kupffer+cells+and+liver+endothelial+cells+prepared+by+means+of+density+separation+in+Percoll,+and+selective+substrate+adherence.">Functional and morphological characterization of cultures of Kupffer cells and liver endothelial cells prepared by means of density separation in Percoll, and selective substrate adherence.</a> Cell and Tissue Research. 241 (3), 639-649 (1985).</li><li>Despoix, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+CD146/MCAM+is+a+marker+of+natural+killer+cell+maturation.">Mouse CD146/MCAM is a marker of natural killer cell maturation.</a> European Journal of Immunology. 38 (10), 2855-2864 (2008).</li><li>Strauss, O., Phillips, A., Ruggiero, K., Bartlett, A., Dunbar, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+identifies+distinct+subsets+of+endothelial+cells+in+the+human+liver.">Immunofluorescence identifies distinct subsets of endothelial cells in the human liver.</a> Scientific Reports. 7, 44356 (2017).</li><li>Halpern, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paired-cell+sequencing+enables+spatial+gene+expression+mapping+of+liver+endothelial+cells.">Paired-cell sequencing enables spatial gene expression mapping of liver endothelial cells.</a> Nature Biotechnology. 36 (10), 962-970 (2018).</li></ol>

현재 원고에서, 우리는 두 단계 콜라게나제 관류 및 후속 자기 활성화 세포 분류 (MACS)로 구성된 마우스 간으로부터의 LSEC 분리를위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 다음의 세 단계로 구성된다: (1) 칼슘이 없는 완충액으로 PV를 통한 관류, 이어서 간세포 분산을 달성하기 위한 콜라게나제 함유 완충액; (2) 저속 원심분리를 통한 간세포의 배제; 및 (3) 항-CD146 자기 비드를 사용하는 비실질 세...

간 정현파 내피 세포 (LSECs)는 간 정현파 벽을 따라 늘어서 있으며 간에서 가장 풍부한 비 실질 세포입니다1. LSECs는 fenestrae의 존재와 고전적인 기저막 또는 횡격막 2,3의 부족에 의해 신체의 다른 모세관 내피 세포와 구별됩니다. 따라서 LSEC는 지질 및 지단백질을 포함한 다양한 순환 거대 분자를 제거하기 위해 투과성과 내시성 능력을 향상시키는 독특한 표현형 및 구조적 특성을 가지고 있습니다. LSECs는 실질 세포와 비실질 세포, 예컨대 성상 세포 및 면역 세포 사이의 누화에서 중추적인 역할을 한다. LSECs는 성상 세포와 쿠퍼 세포를 정지 상태로 유지함으로써 간 항상성을 유지하는 데 중요합니다4. LSECs는 순환하는 백혈구 5,6의 부착 및 내피 이동을 매개함으로써 간 면역 세포 집단의 조성을 조절한다. 허혈-재관류 손상(IRI)8, 비알콜성 지방간염(NASH)9 및 간세포암(HCC)을 포함하는 급성 및 만성 간 손상(7) 동안, LSECs는 기저막(10)의 탈지 및 형성을 특징으로 하는 모세관화로 알려진 표현형 변화를 겪는다. LSECs의 이러한 표현형 변화는 LSECs 기능 장애 및 전구혈전성, 전염증성 및 프로섬유형성 특성의 획득과 관련이 있다.
마우스 간으로부터 LSECs를 분리하기 위한 몇몇 방법이 개발되었다11. 일부 기술은 비실질 및 실질 세포를 분리한 후 밀도 구배 원심분리를 통해 비실질 분획으로부터 LSEC를 정제하는 것에 의존한다. 이 방법의 한계는 LSEC 단리의 최종 단계에서 대식세포를 오염시키는 존재이며, 이는 단리된 LSEC(12)의 순도에 영향을 미칠 수 있다. 이 프로토콜은 마우스 간 콜라게나제 관류 및 CD146+ 자기 비드의 양성 선택에 기초하여 LSECs를 정제하기 위한 비실질 세포의 양성 선택이다. 이 방법을 사용하여 분리된 LSEC는 높은 순도와 보존된 형태학 및 생존력을 보여줍니다. 이러한 LSEC는 투과성 및 접착 분석뿐만 아니라 관심 경로에 대한 다운스트림 연구를 포함한 기능 연구에 최적입니다. 또한, 임상 연구 및 발견 과학 모두에서 큰 데이터 세트를 생성하는 것에 대한 관심이 증가함에 따라, 비알콜성 지방간염(NASH) 또는 기타 질환을 앓고 있는 건강한 간과 병든 간에서 분리된 이러한 고품질 LSEC를 개별적으로 풀링하거나 사용할 수 있어 다중 오믹스 데이터 생성 및 건강과 질병 간의 비교13,14 . 또한, 단리된 LSEC는 LSEC에서 활성화된 신호전달 경로를 해독하고 다양한 유해한 자극 하에서 그리고 다양한 치료적 개입에 반응하여 다른 간세포와의 세포간 통신을 해독하기 위해 오가노이드와 같은 이차원 및 입체내 시험관내 모델을 개발하는 데 사용될 수 있다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2.0-inch 20 G Intra Venous (IV) catheter</td>
			<td>Terumo, SOmerset, NJ, USA</td>
			<td>SR-OX2051CA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#8211;3-inch perfuion tray with a hole in the center</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>customized; made in house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>405/520 viability dye</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-110-205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-inch regular curved dressing forceps</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>FS16-100-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-0 Perma-Hand silk suture</td>
			<td>Ethicon, Raritan, NJ, USA</td>
			<td>A182H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-stabilin-2 (Mouse) mAb-Alexa Fluor&#195; 488</td>
			<td>MBL International, Woburn, MA, USA</td>
			<td>D317-A48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA stock</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD146 (LSEC)-PE, anti-mouse</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-118-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD146 (LSEC) MicroBeads, mouse</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-092-007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD45-Viogreen, anti-mouse</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-110-803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen type I</td>
			<td>Corning, Corning, NY, USA</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase II</td>
			<td>Gibco, Waltham, MA, USA</td>
			<td>17101-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial cells growth medium</td>
			<td>ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>211-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FcR blocking reagent, mouse</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-092-575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo software, version 10.6</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardened Fine scissors</td>
			<td>F.S.T, Foster city, CA, USA</td>
			<td>14091-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated (37 &#176;C) and humidified recirculating perfusion apparatus equipped with Oxygen injection at a rate of 10psi.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>customized; made in house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hitachi S 4700 scanning electron microscope</td>
			<td>Hitachi Inc, Pleasanton, CA, USA</td>
			<td>SEM096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS columns</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS pre-separation filters (70 &#956;m)</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-095-823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS rinsing buffer</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-091-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Smart Strainer (70 &#956;m)</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-098-462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACSQunt flow cytometer</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell Cell Culture Insert</td>
			<td>Millipore Sigma, Burlington, MA, USA</td>
			<td>PITP01250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nexcelom cell counter</td>
			<td>Nexcelom bioscience, Lawrence, MA, USA</td>
			<td>Cellometer Auto T4 Plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare, Chicago, IL, USA</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>F.S.T, Foster city, CA, USA</td>
			<td>14001-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Very small curved dressing forceps</td>
			<td>F.S.T, Foster city, CA, USA</td>
			<td>11063-07</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of mouse primary liver sinusoidal endothelial cells

간 정현파 내피 세포 (LSECs)는 순환과 간 실질 사이의 계면에 위치한 특수 내피 세포입니다. LSECs는 fenestrae의 존재와 기저막의 부재를 특징으로하는 뚜렷한 형태를 가지고 있습니다. LSEC는 대사 조절 장애, 염증, 섬유증, 혈관 신생 및 발암을 포함하여 간에서 많은 병리학 적 장애에서 필수적인 역할을합니다. 그러나 LSEC의 격리 및 특성화에 대해서는 거의 발표되지 않았습니다. 여기에서, 이 프로토콜은 건강한 및 비알콜성 지방간 질환(NAFLD) 마우스 둘 다로부터 LSEC의 분리에 대해 논의한다. 이 프로토콜은 마우스 간 및 자기 비드의 콜라게나제 관류에 기초하여 LSECs를 정제하기 위한 비실질 세포의 양성 선택이다. 이 연구는 유세포 분석기에 의해 특정 마커를 사용하여 LSEC를 특성화하고 주사 전자 현미경으로 특징적인 표현형 특징을 식별합니다. 이 프로토콜에 따라 분리된 LSEC는 접착 및 투과성 분석을 포함한 기능적 연구뿐만 아니라 관심 있는 특정 경로에 대한 다운스트림 연구에 사용될 수 있습니다. 또한, 이들 LSEC는 개별적으로 풀링되거나 사용될 수 있으며, RNA-seq 벌크 또는 단일 세포, 프로테오믹 또는 포스포-프로테오믹스, 시퀀싱(ATAC-seq)을 이용한 트랜스포제-접근 가능한 크로마틴에 대한 어세이 등을 포함하는 다중 오믹스 데이터 생성을 가능하게 한다. 이 프로토콜은 LSEC가 건강 및 질병에서 다른 간 세포와의 통신을 연구하는 조사관에게 유용하며 급성 및 만성 간 손상의 병원성 메커니즘에서 LSEC의 역할에 대한 심층적 인 이해를 가능하게합니다.

실험 회로도 및 장비 설정 : 이 프로토콜에서, 마우스 간을 폐쇄 관류 회로를 사용하여 소화시킨 다음, 비실질 세포 및 간세포를 2분 동안 50 x g 에서 저속 원심분리에 의해 분리하였다. 일차 LSECs는 비실질 분획으로부터 선별된 CD146 자기 비드를 사용하여 단리하였다. 실험 회로도를 도 1A에 나타내었다. 캐뉼러를 PV를 통해 배치하고, 열등한 베나 카바는 ?...

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Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

여기서 우리는 원발성 마우스 간 정현파 내피 세포 (LSEC) 분리를위한 프로토콜을 개략적으로 설명하고 시연합니다. 이 프로토콜은 간 콜라게나제 관류, 저속 원심분리에 의한 비실질 세포 정제 및 CD146 마그네틱 비드 선택을 기반으로 합니다. 우리는 또한 표현형과 유세포 분석기 및 주사 전자 현미경을 사용하여 이러한 분리 된 LSEC를 특성화합니다.

마우스 일차 간 정현파 내피 세포의 분리 및 특성화

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...

여기에서, 우리는 원발성 마우스 간 정현파 세포 분리 또는 LSEC 단리의 우리의 프로토콜을 시연한다. 이 프로토콜은 간 콜라게나제 관류 및 비실질 세포 정제를 위한 저속 초원심분리 및 CD146 마그네틱 비드 선택으로 구성됩니다. 우리의 LSEC 분리 방법은 매우 효율적이며 건강하고 병든 마우스 간에도 적용 할 수 있습니다.절연된 LSEC는 고순도를 표시하고 구조와 기능을 보존합니다. 이 프로토콜을 사용하여 분리된 LSEC는 기능 및 분자 연구 및 다중 오믹스 데이터 생성에 최적입니다. 이 프로토콜은 간에서 세포 간 통신을 연구하는 데 도움이 될 것입니다.10 센티미터 배양 접시에 세 밀리리터의 콜라겐 용액을 코팅하여 시작하십시오. 그런 다음 접시를 실온에서 한 시간 동안 인큐베이션하십시오. 한 시간 후, 코팅된 표면으로부터 과량의 유체를 제거한다.PBS로 접시를 세 번 씻고 공기 건조하게하십시오. 가열 및 가습 재순환 관류 장치를 설치하십시오. 5 분 동안 10 % 표백제를 사용하여 관류 시스템을 헹구십시오.그런 다음 시스템을 다시 멸균수로 10 분 동안 헹구십시오. 콜라게나제 용액으로 관류하기 전에 헹굼액을 가능한 한 많이 배출하십시오. 관류 시스템을 통해 콜라게나제 용액을 주입하여 섭씨 37도까지 예열하십시오.속도 제어 다이얼에서 펌프 속도를 속도 하나로 설정하십시오. 전체 절차에서 속도를 동일하게 유지하십시오. 절차를 위해 마우스의 무게를 측정하십시오.그런 다음 수술 표면에 고정하십시오. 마우스 복부에 70 % 에탄올을 뿌리십시오. 외과 용 가위를 사용하여 복부의 아래 부분에서 xiphoid 과정까지 약 다섯 센티미터의 절개를하십시오.그 후, 복부의 양쪽에있는 작은 홍채 가위를 사용하여 복부 장기를 완전히 노출시키는 두 개의 측면 절단을하십시오. IV 카테터의 칼집을 동물의 등 아래에 두어 복부를 들어 올리고 평평하게하십시오. 규칙적인 곡선 드레싱 포셉을 사용하여 창자와 위를 동물의 왼쪽으로 부드럽게 당깁니다.그런 다음 노출 된 왼쪽 신장 바로 아래의 열등한 정맥 카바 또는 IVC 아래에 5-0 개의 외과 봉합사를 놓습니다. 봉합사에 느슨한 히치를 묶으십시오. 다음으로, 간 포털 정맥 주위에 또 다른 5-0 개의 외과 봉합사를 놓습니다.봉합사를 간 문맥 정맥의 비장 정맥 분기 지점 바로 위에 놓습니다. 다시 말하지만, 봉합사에 느슨한 히치를 묶으십시오. 포털 정맥 봉합사를 장력으로 사용하여 20 게이지 IV 카테터를 간 포털 정맥에 삽입하여 좌우 간 포털 정맥으로 분기하는 한 센티미터 아래에 삽입하십시오.그런 다음 카테터를 정맥 위로 밀어 올리지 만 분기 영역 아래에 보관하십시오. 혈액이 물방울이 떨어지기 시작할 때까지 카테터 아래로 이동하게하십시오. IV 카테터를 포털 정맥 봉합사로 고정하십시오.IV 라인을 사용하여 버퍼 A가있는 IV 병을 카테터에 부착하십시오. 그런 다음 시스템에 공기가 들어 가지 않도록하면서이 용액으로 간을 씻어 내십시오. 신장 아래의 IVC 주위의 봉합사를 묶으십시오.그 후, IVC를 봉합사 아래로 잘라 동물이 피를 흘릴 수 있도록하십시오. 일단 관류하면 위장, 창자, 비장 및 간장에 붙어있는 다른 entrails를 잘라냅니다. 그런 다음 횡격막과 흉강에서 주요 혈관을 잘라냅니다.동물에서 간을 제거하고 관류 트레이에 놓습니다. 조심스럽게 IV 라인을 제거하고 재순환 챔버에서 콜라게나제 용액을 연결하십시오. 캡슐이 모델링되고 끈적 끈적하게 보일 때까지 간이 관류하도록하십시오.이 작업은 일반적으로 10~15분 정도 걸립니다. 소화되면 챔버에서 간을 제거하고 약 20 밀리리터의 무혈청 DMEM이있는 10 센티미터 페트리 접시에 놓습니다. 두 개의 피펫 팁으로 간을 부드럽게 떼어 내고 담즙 나무를 버리십시오.그 후, 간 현탁액을 70 마이크로미터 세포 스트레이너를 통해 50 밀리리터 원뿔형 튜브로 여과하십시오. 세포 현탁액을 실온에서 두 분 동안 50배 G에서 원심분리한다. 이어서, 비실질 간 세포를 함유하는 상청액을 수집한다.상층액을 섭씨 네 도에서 5분 동안 300배 G에서 원심분리한다. 그 후, 세포 펠릿을 수집하고 한 밀리리터의 분리 완충액에 재현탁시킨다. 제조업체의 지침에 따라 자동 셀 카운터를 사용하여 셀 번호를 확인합니다.다음으로, 세포 현탁액을 원심분리한다. 상청액을 완전히 흡인하고 펠렛을 10 백만 세포 당 90 마이크로리터의 분리 완충액으로 재현탁시킨다. 총 세포 1천만 개당 10마이크로리터의 CD146 마이크로비드를 첨가한다.잘 섞어서 섭씨 네 도에서 15 분 동안 배양하십시오. 세포를 세척하려면 10 백만 세포 당 1 ~ 두 밀리리터의 분리 버퍼를 추가하십시오. 용액을 300배 G에서 10분 동안 원심분리한다.그 후, 상청액을 완전히 흡인하고 500 마이크로 리터의 분리 완충액에 최대 10 억 개의 세포를 재현탁하십시오. 다음으로, 분리 컬럼을 세 밀리리터의 분리 완충액으로 헹구어 준비한다. 세포 현탁액을 70마이크로미터 예비 분리 필터로 적층된 컬럼 상에 적용한다.세 밀리리터의 분리 버퍼로 컬럼을 세 번 세척하십시오. 그 후, 컬럼을 분리기에서 제거하고 15 밀리리터 원심분리 튜브 위에 놓습니다. 컬럼에 다섯 밀리리터의 격리 버퍼를 피펫합니다.자성 비드 표지된 세포를 회수하려면, 플런저를 컬럼 내로 단단히 밀어 세포를 플러시한다. 마지막으로, 세포를 섭씨 네 도에서 5분 동안 300배 G에서 원심분리한다. 단리된 LSECs 순도 및 표면 마커를 유세포 분석기로 평가하였다.게이팅된 LSEC 및 싱글 트에 대한 데이터 분석 및 게이팅 전략은 순방향 분산 및 측면 분산 데이터를 기반으로 합니다. 단리된 LSECs를 생존성 염료 및 CD45, CD146 및 스타빌린-2 항체의 조합으로 염색하였다. 생존 가능한 LSECs를 CD45 음성 집단에 게이팅하고, CD146 및 스타빌린-2 발현에 대해 분석하였다.이 데이터로부터, 분리된 LSECs가 94% 이상의 생존력과 90% 이상의 순도를 가짐을 확인하였다. 분리된 세포의 LSEC 특이적 표현형을 광 현미경 및 주사 전자 현미경을 사용하여 추가로 확인하였다. 분리된 LSECs를 여섯 시간 동안 완전 성장 배지에서 배양하고 광 현미경으로 조사하였다.SEM 이미지의 흰색 화살표는 LSEC fenestrae를 나타내며, 이는 LSEC의 특징적인 형태학적 특징입니다. 간 조직의 완전한 관류를 보장하는 중요한 단계는 카테터에 공기가 유입되는 것을 피하고 콜라게나제 소화의 최적 타이밍을 피하면서 적절한 카테터 테이프 위치입니다. 우리의 프로토콜을 사용하여 획득 한 고품질 LSEC는 LSEC 기능의 분자 메커니즘의 식별을 용이하게하고 간, 건강 및 질병에서 세포 간 통신에서의 역할에 대한 우리의 이해를 향상시킬 것입니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Valvular Endothelial Cells

판막병 내피 세포의 분리

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

연구

생물학

Isolation &#38; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Isolation & Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Hoechst의 분리 및 특성 낮은 CD45 부정적인 마우스 폐 Mesenchymal 줄기 세포

Tissue resident mesenchymal stem cells (MSC) are important regulators of tissue repair or regeneration, fibrosis, inflammation, angiogenesis and tumor ...

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

기본 마우스 Trophoblast 셀 및 Trophoblast의 침략 분석의 절연

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

배아 심실 내피 세포의 분리

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

마우스 기본 췌장 포상 세포의 분리 및 문화

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

쥐과 밸브 내피 세포의 분리

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

A Standardized Method for the Analysis of Liver Sinusoidal Endothelial Cells and Their Fenestrations by Scanning Electron Microscopy

주사 전자 현미경으로 간 사인 내피 세포의 분석 및 그들의 Fenestrations위한 표준화 된 방법

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

분리 및 마우스 대동맥 내피 세포의 차 문화

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells

차 인간 간세포의 분리 및 비 실질 간 세포의 주요 집단 대응을위한 프로토콜

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic ...

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

마우스 관상 내피 세포의 분리

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...