Name: isolation and characterization of mouse primary liver sinusoidal endothelial cells
Uploaded: 2021-12-16T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases of the NIH (1RO1DK122948 to SHI) og NIH Silvio O. Conte Digestive Diseases Research Core Centers P30 grant mechanism (DK084567). Støtte ble også gitt til KF av Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) Overseas Research Fellowships. Vi vil også gjerne anerkjenne Dr. Gregory J. Gores og Steven Bronk for deres opprinnelige design og optimalisering av kollagenalseperfusjonsapparatet.

Dyreprotokoller ble utført som godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Mayo Clinic. Åtte uker gamle C57BL/6J hannmus ble kjøpt fra Jackson Laboratory. Mus ble plassert i et temperaturkontrollert 12:12-timers lys-mørk syklusanlegg med fri tilgang til kosthold.
1. Tilberedning av kollagenbelagt kulturrett eller tallerken
<ol><li>For å lage 50 ml 0,02 mol/l eddiksyre, tilsett 0,6 ml issyre til 49,4 ml H2O.</li>
	<li>Lag 50 μg/ml koll...

<ol>
	<li>Morin, O., Goulet, F., Normand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+sinusoidal+endothelial+cells:+isolation,+purification,+characterization+and+interaction+with+hepatocytes.">Liver sinusoidal endothelial cells: isolation, purification, characterization and interaction with hepatocytes.</a> Revisiones Sobre Biologia Celular: RBC. 15, 1-85 (1988).</li><li>Ibrahim, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sinusoidal+endotheliopathy+in+nonalcoholic+steatohepatitis:+therapeutic+implications.">Sinusoidal endotheliopathy in nonalcoholic steatohepatitis: therapeutic implications.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 321 (1), 67-74 (2021).</li><li>Poisson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+sinusoidal+endothelial+cells:+Physiology+and+role+in+liver+diseases.">Liver sinusoidal endothelial cells: Physiology and role in liver diseases.</a> Journal of Hepatology. 66 (1), 212-227 (2017).</li><li>Marrone, G., Shah, V. H., Gracia-Sancho, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sinusoidal+communication+in+liver+fibrosis+and+regeneration.">Sinusoidal communication in liver fibrosis and regeneration.</a> Journal of Hepatology. 65 (3), 608-617 (2016).</li><li>Shetty, S., Lalor, P. F., Adams, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+sinusoidal+endothelial+cells+-+gatekeepers+of+hepatic+immunity.">Liver sinusoidal endothelial cells - gatekeepers of hepatic immunity.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. 15 (9), 555-567 (2018).</li><li>Smedsr&#248;d, B., Pertoft, H., Gustafson, S., Laurent, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scavenger+functions+of+the+liver+endothelial+cell.">Scavenger functions of the liver endothelial cell.</a> Biochemical Journal. 266 (2), 313-327 (1990).</li><li>DeLeve, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+sinusoidal+endothelial+cells+in+hepatic+fibrosis.">Liver sinusoidal endothelial cells in hepatic fibrosis.</a> Hepatology. 61 (5), 1740-1746 (2015).</li><li>Dar, W. A., Sullivan, E., Bynon, J. S., Eltzschig, H., Ju, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischaemia+reperfusion+injury+in+liver+transplantation:+Cellular+and+molecular+mechanisms.">Ischaemia reperfusion injury in liver transplantation: Cellular and molecular mechanisms.</a> Liver International. 39 (5), 788-801 (2019).</li><li>Furuta, K., Guo, Q., Hirsova, P., Ibrahim, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Roles+of+Liver+Sinusoidal+Endothelial+Cells+in+Nonalcoholic+Steatohepatitis.">Emerging Roles of Liver Sinusoidal Endothelial Cells in Nonalcoholic Steatohepatitis.</a> Biology. 9 (11), 395 (2020).</li><li>Wu, L. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+functional+differences+between+human+liver+cancer+endothelial+cells+and+liver+sinusoidal+endothelial+cells.">Phenotypic and functional differences between human liver cancer endothelial cells and liver sinusoidal endothelial cells.</a> Journal of Vascular Research. 45 (1), 78-86 (2008).</li><li>Meyer, J., Gonelle-Gispert, C., Morel, P., B&#252;hler, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+isolation+and+purification+of+murine+liver+sinusoidal+endothelial+cells:+A+systematic+review.">Methods for isolation and purification of murine liver sinusoidal endothelial cells: A systematic review.</a> PLoS One. 11 (3), 0151945 (2016).</li><li>Meyer, J., Lacotte, S., Morel, P., Gonelle-Gispert, C., Buhler, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+for+mouse+liver+sinusoidal+endothelial+cell+isolation.">An optimized method for mouse liver sinusoidal endothelial cell isolation.</a> Experimental Cell Research. 349 (2), 291-301 (2016).</li><li>Furuta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-induced+endothelial+vascular+cell+adhesion+molecule+1+promotes+nonalcoholic+steatohepatitis+pathogenesis.">Lipid-induced endothelial vascular cell adhesion molecule 1 promotes nonalcoholic steatohepatitis pathogenesis.</a> Journal of Clinical Investigation. 131 (6), (2021).</li><li>Guo, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+&#946;(1)-enriched+extracellular+vesicles+mediate+monocyte+adhesion+and+promote+liver+inflammation+in+murine+NASH.">Integrin &#946;(1)-enriched extracellular vesicles mediate monocyte adhesion and promote liver inflammation in murine NASH.</a> Journal of Hepatology. 71 (1), 1193-1205 (2019).</li><li>Hirsova, P., Ibrahim, S. H., Bronk, S. F., Yagita, H., Gores, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vismodegib+suppresses+TRAIL-mediated+liver+injury+in+a+mouse+model+of+nonalcoholic+steatohepatitis.">Vismodegib suppresses TRAIL-mediated liver injury in a mouse model of nonalcoholic steatohepatitis.</a> PLoS One. 8 (7), 70599 (2013).</li><li>Schrage, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+CD146+is+widely+expressed+on+endothelial+cells+and+is+recognized+by+the+monoclonal+antibody+ME-9F1.">Murine CD146 is widely expressed on endothelial cells and is recognized by the monoclonal antibody ME-9F1.</a> Histochemistry and Cell Biology. 129 (4), 441-451 (2008).</li><li>Olsavszky, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+transcriptomic+network+of+multi-ligand+scavenger+receptor+Stabilin-1-+and+Stabilin-2-deficient+liver+sinusoidal+endothelial+cells.">Exploring the transcriptomic network of multi-ligand scavenger receptor Stabilin-1- and Stabilin-2-deficient liver sinusoidal endothelial cells.</a> Gene. 768, 145284 (2021).</li><li>DeLeve, L. D., Maretti-Mira, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+sinusoidal+endothelial+cell:+An+update.">Liver sinusoidal endothelial cell: An update.</a> Seminars in Liver Disease. 37 (4), 377-387 (2017).</li><li>DeLeve, L. D., Wang, X., Hu, L., McCuskey, M. K., McCuskey, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+liver+sinusoidal+endothelial+cell+phenotype+is+maintained+by+paracrine+and+autocrine+regulation.">Rat liver sinusoidal endothelial cell phenotype is maintained by paracrine and autocrine regulation.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 287 (4), 757-763 (2004).</li><li>Cabral, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+hepatocytes+and+sinusoidal+endothelial+cells+from+mouse+liver+perfusion.">Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).</li><li>Ishiguro, K., Yan, I. K., Patel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+tissue+extracellular+vesicles+from+the+liver.">Isolation of tissue extracellular vesicles from the liver.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e58649 (2019).</li><li>Topp, S. A., Upadhya, G. A., Strasberg, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cold+preservation+of+isolated+sinusoidal+endothelial+cells+in+MMP+9+knockout+mice:+effect+on+morphology+and+platelet+adhesion.">Cold preservation of isolated sinusoidal endothelial cells in MMP 9 knockout mice: effect on morphology and platelet adhesion.</a> Liver Transplantation. 10 (8), 1041-1048 (2004).</li><li>Katz, S. C., Pillarisetty, V. G., Bleier, J. I., Shah, A. B., DeMatteo, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+sinusoidal+endothelial+cells+are+insufficient+to+activate+T+cells.">Liver sinusoidal endothelial cells are insufficient to activate T cells.</a> Journal of Immunology. 173 (1), 230-235 (2004).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+preparation+method+for+isolation+of+single-cell+types+from+mouse+liver+for+proteomic+studies.">Sample preparation method for isolation of single-cell types from mouse liver for proteomic studies.</a> Proteomics. 11 (17), 3556-3564 (2011).</li><li>Do, H., Healey, J. F., Waller, E. K., Lollar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+factor+VIII+by+murine+liver+sinusoidal+endothelial+cells.">Expression of factor VIII by murine liver sinusoidal endothelial cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (28), 19587-19592 (1999).</li><li>Schrage, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+T+cell+transmigration+across+the+murine+liver+sinusoidal+endothelium+is+mediated+by+transcytosis+and+surface+presentation+of+chemokines.">Enhanced T cell transmigration across the murine liver sinusoidal endothelium is mediated by transcytosis and surface presentation of chemokines.</a> Hepatology. 48 (4), 1262-1272 (2008).</li><li>Chou, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysophosphatidic+acid+alters+the+expression+profiles+of+angiogenic+factors,+cytokines,+and+chemokines+in+mouse+liver+sinusoidal+endothelial+cells.">Lysophosphatidic acid alters the expression profiles of angiogenic factors, cytokines, and chemokines in mouse liver sinusoidal endothelial cells.</a> PLoS One. 10 (3), 0122060 (2015).</li><li>Deleve, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dacarbazine+toxicity+in+murine+liver+cells:+a+model+of+hepatic+endothelial+injury+and+glutathione+defense.">Dacarbazine toxicity in murine liver cells: a model of hepatic endothelial injury and glutathione defense.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 268 (3), 1261-1270 (1994).</li><li>Smedsr&#248;d, B., Pertoft, H., Eggertsen, G., Sundstr&#246;m, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+morphological+characterization+of+cultures+of+Kupffer+cells+and+liver+endothelial+cells+prepared+by+means+of+density+separation+in+Percoll,+and+selective+substrate+adherence.">Functional and morphological characterization of cultures of Kupffer cells and liver endothelial cells prepared by means of density separation in Percoll, and selective substrate adherence.</a> Cell and Tissue Research. 241 (3), 639-649 (1985).</li><li>Despoix, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+CD146/MCAM+is+a+marker+of+natural+killer+cell+maturation.">Mouse CD146/MCAM is a marker of natural killer cell maturation.</a> European Journal of Immunology. 38 (10), 2855-2864 (2008).</li><li>Strauss, O., Phillips, A., Ruggiero, K., Bartlett, A., Dunbar, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+identifies+distinct+subsets+of+endothelial+cells+in+the+human+liver.">Immunofluorescence identifies distinct subsets of endothelial cells in the human liver.</a> Scientific Reports. 7, 44356 (2017).</li><li>Halpern, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paired-cell+sequencing+enables+spatial+gene+expression+mapping+of+liver+endothelial+cells.">Paired-cell sequencing enables spatial gene expression mapping of liver endothelial cells.</a> Nature Biotechnology. 36 (10), 962-970 (2018).</li></ol>

I det nåværende manuskriptet beskriver vi en protokoll for LSEC-isolasjon fra muselever som består av totrinns kollagenalisseperfusjon og påfølgende magnetisk aktivert cellesortering (MACS). Denne protokollen består av følgende tre trinn: (1) Perfusjon gjennom PV med en kalsiumfri buffer etterfulgt av en kollagenholdig buffer for å oppnå levercelledispersjon; (2) Utelukkelse av hepatocytter med lavhastighets sentrifugering; og (3) MACS-baserte positive utvalg av LSECer fra ikke-fettceller (NPCer) ved hjelp av an...

Lever sinusformede endotelceller (LSECs) linje leveren sinusoid vegger og er de mest tallrike nonparenchymale cellene i leveren1. LSEC skiller seg fra andre kapillære endotelceller andre steder i kroppen ved tilstedeværelse av fenestrae og mangel på en klassisk kjellermembran eller en membran 2,3. Derfor har LSECene særegne fenotypiske og strukturelle egenskaper som forbedrer deres permeabilitet og endokytiske kapasitet for å eliminere en rekke sirkulerende makromolekyler, inkludert lipider og lipoproteiner. LSECer spiller en sentral rolle i krysstale mellom parenchymale og nonparenchymale celler, for eksempel stellate celler og immunceller. LSECer er nøkkelen til å opprettholde lever homeostase ved å holde stellate celler og Kupffer celler i en passiv status4. LSECer modulerer sammensetningen av leverimmuncellepopulasjoner ved å formidle vedheft og trans-endotelial migrasjon av sirkulerende leukocytter 5,6. Under akutt og kronisk leverskade7, inkludert iskemi-reperfusjonsskade (IRI)8, nonalcoholic steatohepatitis (NASH)9, og hepatocellulært karsinom (HCC), gjennomgår LSEC fenotypiske endringer kjent som kapillarisering preget av defenestrasjon og dannelse av kjellermembran10. Disse fenotypiske endringene i LSECs er forbundet med LSECs dysfunksjon og oppkjøpet av protrombotiske, proinflammatoriske og profibrogene egenskaper.
Flere metoder for isolering av LSEC fra muselever er utviklet11. Noen teknikker er avhengige av å skille ikke-parenchymale og parenchymale celler etterfulgt av tetthet gradient sentrifugering for å rense LSECene fra ikke-parenchymale brøker. Begrensningen av denne metoden er tilstedeværelsen av forurensende makrofager i de siste trinnene i LSECs isolasjon, noe som kan påvirke renheten til de isolerte LSECene12. Denne protokollen er basert på kollagenalisperfusjon av muselever og CD146+ magnetiske perler positivt utvalg av ikke-parenchymale celler for å rense LSECer. LSECer isolert ved hjelp av denne metoden viser høy renhet og bevart morfologi og levedyktighet. Disse LSECene er optimale for funksjonelle studier, inkludert permeabilitet og adhesjonsanalyse, samt nedstrømsstudier for interesseveier. Videre, med den økende interessen for å generere stordatasett i både klinisk forskning og oppdagelsesvitenskap, kan disse høykvalitets LSECene isolert fra både sunne og sykelever med ikke-alkoholholdig steatohepatitt (NASH) eller andre forhold samles eller brukes individuelt, slik at multi-omics datagenerering og sammenligning mellom helse og sykdom13,14 . I tillegg kan de isolerte LSECene brukes til å utvikle todimensjonale så vel som tredimensjonale in vitro-modeller som organoider for å dechiffrere den aktiverte signalveien i LSECs og deres intercellulære kommunikasjon med andre leverceller under forskjellige skadelige stimuli og som svar på ulike terapeutiske inngrep.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2.0-inch 20 G Intra Venous (IV) catheter</td>
			<td>Terumo, SOmerset, NJ, USA</td>
			<td>SR-OX2051CA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#8211;3-inch perfuion tray with a hole in the center</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>customized; made in house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>405/520 viability dye</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-110-205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-inch regular curved dressing forceps</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>FS16-100-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-0 Perma-Hand silk suture</td>
			<td>Ethicon, Raritan, NJ, USA</td>
			<td>A182H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-stabilin-2 (Mouse) mAb-Alexa Fluor&#195; 488</td>
			<td>MBL International, Woburn, MA, USA</td>
			<td>D317-A48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA stock</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD146 (LSEC)-PE, anti-mouse</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-118-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD146 (LSEC) MicroBeads, mouse</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-092-007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD45-Viogreen, anti-mouse</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-110-803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen type I</td>
			<td>Corning, Corning, NY, USA</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase II</td>
			<td>Gibco, Waltham, MA, USA</td>
			<td>17101-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial cells growth medium</td>
			<td>ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>211-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FcR blocking reagent, mouse</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-092-575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo software, version 10.6</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardened Fine scissors</td>
			<td>F.S.T, Foster city, CA, USA</td>
			<td>14091-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated (37 &#176;C) and humidified recirculating perfusion apparatus equipped with Oxygen injection at a rate of 10psi.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>customized; made in house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hitachi S 4700 scanning electron microscope</td>
			<td>Hitachi Inc, Pleasanton, CA, USA</td>
			<td>SEM096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS columns</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS pre-separation filters (70 &#956;m)</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-095-823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS rinsing buffer</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-091-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Smart Strainer (70 &#956;m)</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-098-462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACSQunt flow cytometer</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell Cell Culture Insert</td>
			<td>Millipore Sigma, Burlington, MA, USA</td>
			<td>PITP01250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nexcelom cell counter</td>
			<td>Nexcelom bioscience, Lawrence, MA, USA</td>
			<td>Cellometer Auto T4 Plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare, Chicago, IL, USA</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>F.S.T, Foster city, CA, USA</td>
			<td>14001-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Very small curved dressing forceps</td>
			<td>F.S.T, Foster city, CA, USA</td>
			<td>11063-07</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of mouse primary liver sinusoidal endothelial cells

Lever sinusformede endotelceller (LSECs) er spesialiserte endotelceller som ligger i grensesnittet mellom sirkulasjonen og leverparenchyma. LSECs har en distinkt morfologi preget av tilstedeværelsen av fenestrae og fravær av kjellermembran. LSECer spiller viktige roller i mange patologiske lidelser i leveren, inkludert metabolsk dysregulering, betennelse, fibrose, angiogenese og karsinogenese. Det er imidlertid lite publisert om isolasjon og karakterisering av LSECene. Her diskuterer denne protokollen isolering av LSEC fra både sunne og ikke-alkoholholdige fettleversykdom (NAFLD) mus. Protokollen er basert på kollagenalisperfusjon av muselever og magnetiske perler positivt utvalg av ikke-fettceller for å rense LSECer. Denne studien karakteriserer LSEC ved hjelp av spesifikke markører ved strømningscytometri og identifiserer de karakteristiske fenotypiske egenskapene ved å skanne elektronmikroskopi. LSECer isolert etter denne protokollen kan brukes til funksjonelle studier, inkludert vedheft og permeabilitetsanalyser, samt nedstrømsstudier for en bestemt interessevei. I tillegg kan disse LSECene samles eller brukes individuelt, slik at multi-omics datagenerering inkludert RNA-seq bulk eller enkeltcelle, proteomisk eller fosfor-proteomikk, og Analyse for Transposase-Accessible Chromatin ved hjelp av sekvensering (ATAC-seq), blant andre. Denne protokollen vil være nyttig for etterforskere som studerer LSECs kommunikasjon med andre leverceller i helse og sykdom og tillater en grundig forståelse av LSECs rolle i de patogene mekanismene for akutt og kronisk leverskade.

Eksperimentelle skjemaer og utstyr satt opp: I denne protokollen ble muselever fordøyd ved hjelp av en lukket perfusjonskrets, da ble ikke-fettceller og hepatocytter skilt av lavhastighets sentrifugering ved 50 x g i 2 minutter. Primære LSECer ble isolert ved hjelp av CD146 magnetiske perler utvalg fra den nonparenchymal brøkdel. De eksperimentelle skjemaene vises i figur 1A. Kanylen ble plassert gjennom PV mens den dårligere vena cava var bundet opp for å s...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells at JoVE.com

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

Her skisserer og demonstrerer vi en protokoll for primær muslever sinusformet endotelcelle (LSEC) isolasjon. Protokollen er basert på lever kollagenalisere perfusjon, nonparenchymal celle rensing ved lavhastighets sentrifugering, og CD146 magnetisk perle utvalg. Vi fenotype og karakteriserer også disse isolerte LSECene ved hjelp av strømningscytometri og skanning av elektronmikroskopi.

Isolasjon og karakterisering av musens primære lever sinusformede endotelceller

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...

Her demonstrerer vi vår protokoll for primær muslever sinusformet celleisolasjon eller LSECs isolasjon. Protokollen består av lever kollagenas perfusjon og lavhastighets ultracentrifugation for ikke-parenchymal celle rensing og CD146 magnetisk perle utvalg. Vår LSEC-isolasjonsmetode er svært effektiv og anvendelig for sunn og syk muselever.De isolerte LSECene viser høy renhet og bevarer strukturen og funksjonen. LSECer isolert ved hjelp av denne protokollen er optimale for funksjonelle og molekylære studier og multi-omics datagenerering. Denne protokollen vil være nyttig for å studere intercellulær kommunikasjon i leveren.Begynn med å belegge 10-centimeter kulturretter med tre milliliter kollagenoppløsning. Deretter inkuberer du oppvasken ved romtemperatur i en time. Etter en time, fjern overflødig væske fra den belagte overflaten.Vask oppvasken med PBS tre ganger og la dem lufttørke. Sett opp det oppvarmede og fuktede resirkuleringsapparatet. Skyll perfusjonssystemet med 10% blekemiddel i fem minutter.Skyll deretter systemet igjen med sterilt vann i ytterligere 10 minutter. Tøm skyllevæsken så mye som mulig før du parfymerer med kollagenoppløsning. Tilsett kollagenoppløsningen gjennom perfusjonssystemet for å prewarm det til 37 grader Celsius.Sett pumpehastigheten til hastighet 1 på hastighetskontrollhjulet. Hold hastigheten den samme gjennom hele prosedyren. Vei musen for prosedyren.Fest den deretter til den kirurgiske overflaten. Spray musens underliv med 70% etanol. Ved hjelp av kirurgisk saks, gjør et snitt på omtrent fem centimeter fra underdelen av magen opp til xiphoid-prosessen.Deretter lager du to laterale kutt ved hjelp av liten irissaks på hver side av magen for å eksponere bukorganene fullt ut. Plasser kappen på IV-kateteret under dyrets rygg for å løfte og jevne magen. Bruk en vanlig buet dressing tang, trekk tarmene og magen forsiktig til venstre for dyret.Plasser deretter en 5-0 kirurgisk sutur under den dårligere vena cava, eller IVC, like under den eksponerte venstre nyre. Bind en løs tilhengerfeste i suturen. Deretter plasserer du en annen 5-0 kirurgisk sutur rundt leverportalvenen.Plasser suturen like over den spleniske venegreningspunktet til leverportalvenen. Igjen, bind en løs hitch i suturen. Bruk portalvenens sutur som spenning, sett inn 20-gauge IV-kateteret i leverportalvenen en centimeter under der den forgrener seg til høyre og venstre leverportalåre.Skyv deretter kateteret opp venen, men hold det under forgreningsområdet. La blodet bevege seg nedover kateteret til det begynner å dryppe ut. Fest IV-kateteret med portalvenens sutur.Bruk en IV-linje til å feste en IV-flaske med buffer A til kateteret. Skyll deretter leveren med denne løsningen samtidig som du unngår luftinngang i systemet. Bind av suturen rundt IVC under nyrene.Deretter kutter du IVC under suturen slik at dyret kan blø ut. Når parfyme, kutt bort mage, tarm, milt og andre innvoller festet til leveren. Klipp deretter bort membranen og de store karene fra thoraxhulen.Fjern leveren fra dyret og legg den på perfusjonsbrettet. Fjern IV-linjen forsiktig og koble til kollagenoppløsningen i resirkuleringskammeret. La leveren parfymere til kapselen blir modellert og virker grøtaktig.Dette bør vanligvis ta 10 til 15 minutter. Når den er fordøyd, fjern leveren fra kammeret og legg den på en 10 centimeter Petri-tallerken med ca. 20 milliliter serumfri DMEM. Plukk forsiktig fra hverandre leveren med et par pipettespisser og kast det biliære treet.Deretter filtrerer du leverens suspensjon gjennom en 70-mikrometer cellesil inn i et 50 milliliter konisk rør. Sentrifuger cellefjæringen ved 50 ganger G i to minutter ved romtemperatur. Samle deretter supernatanten som inneholder ikke-parenchymale leverceller.Sentrifuger supernatanten ved 300 ganger G i fem minutter ved fire grader Celsius. Deretter samler du cellepellet og bruker den på nytt i en milliliter isolasjonsbuffer. Finn cellenummeret ved hjelp av en automatisk celleteller etter produsentens instruksjoner.Deretter sentrifugerer du cellesuspensjonen. Aspirer supernatanten helt og resuspender pellet med 90 mikroliter isolasjonsbuffer per 10 millioner celler. Tilsett 10 mikroliter CD146 MicroBeads per 10 millioner totale celler.Bland det godt og inkuber i 15 minutter ved fire grader Celsius. For å vaske cellene, legg til en til to milliliter isolasjonsbuffer per 10 millioner celler. Sentrifuger løsningen ved 300 ganger G i 10 minutter.Deretter aspirerer du supernatanten helt og resuspenderer opptil en milliard celler i 500 mikroliter isolasjonsbuffer. Deretter forbereder du separasjonskolonnen ved å skylle den med tre milliliter isolasjonsbuffer. Påfør celleopphenget på kolonnen stablet med 70-mikrometer preseparasjonsfiltre.Vask kolonnen med tre milliliter isolasjonsbuffer tre ganger. Deretter fjerner du kolonnen fra separatoren og legger den på et 15 milliliter sentrifugerør. Pipette fem milliliter isolasjonsbuffer på kolonnen.For å gjenopprette de magnetiske perlemerkede cellene, skyv stempelet fast inn i kolonnen for å skylle ut cellene. Til slutt sentrifugerer cellene ved 300 ganger G i fem minutter ved fire grader Celsius. Isolerte LSECs renhets- og overflatemarkører ble vurdert med strømningscytometri.Dataanalyse og gating strategi for inngjerdede LSECer og singlets er basert på fremover scatter og side scatter data. Isolerte LSECer ble farget med et levedyktig fargestoff og en kombinasjon av CD45, CD146 og Stabilin-2 antistoffer. Levedyktige LSECer ble inngjerdet på CD45 negativ populasjon og analysert for CD146 og Stabilin-2 uttrykk.Fra disse dataene ble det bekreftet at de isolerte LSECene hadde større enn 94% levedyktighet og større enn 90% renhet. Den LSEC-spesifikke fenotypen til de isolerte cellene ble ytterligere bekreftet ved hjelp av lysmikroskopi og skanning av elektronmikroskopi. Isolerte LSECer ble dyrket i det komplette vekstmediet i seks timer og undersøkt av lett mikroskopi.De hvite pilene i SEM-bildet indikerer LSEC fenestrae, som er et karakteristisk morfologisk trekk ved LSECer. De kritiske trinnene for å sikre fullstendig perfusjon av et levervev er riktig kateterbåndposisjonering, unngår innføring av luft i kateteret, og den optimale tidspunktet for kollagenalens fordøyelse. Høy kvalitet LSEC ervervet ved hjelp av vår protokoll vil lette identifisering av den molekylære mekanismen til LSEC-funksjonen og vil forbedre vår forståelse av deres rolle i intercellulær kommunikasjon i leveren, i helse og i sykdom.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Isolation &#38; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Isolation & Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Isolasjon &amp; Karakterisering av Hoechst Lav CD45 Negative Mus Lung stamceller

Tissue resident mesenchymal stem cells (MSC) are important regulators of tissue repair or regeneration, fibrosis, inflammation, angiogenesis and tumor ...

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Isolering av embryonale Ventrikulære endotelceller

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Isolasjon og kultur av mus Primær acinøse Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Isolering av Murint Valve endotelceller

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

A Standardized Method for the Analysis of Liver Sinusoidal Endothelial Cells and Their Fenestrations by Scanning Electron Microscopy

En standardisert metode for analyse av Liver Sinus endotelceller og deres Fenestrations ved scanning elektronmikroskopi

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolasjon og Primær Culture of Mouse endotelceller fra aorta

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells

Protokoll for isolering av Primære humane hepatocytter og tilsvarende store Bestander av ikke-parenkymatøs leverceller

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic ...

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

Isolering av Mouse Coronary endotelceller

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...