Name: isolation and characterization of mouse primary liver sinusoidal endothelial cells
Uploaded: 2021-12-16T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Diabetes e Doenças Digestivas e Renais do NIH (1RO1DK122948 a SHI) e pelo mecanismo de concessão do NIH Silvio O. Conte Digestive Diseases Core Centers P30 (DK084567). O apoio também foi prestado à KF pela Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) Overseas Research Fellowships. Também gostaríamos de reconhecer o Dr. Gregory J. Gores e Steven Bronk por seu projeto original e otimização do aparelho de perfusão de colagenase.

Os protocolos animais foram conduzidos conforme aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Clínica Mayo. Camundongos machos C57BL/6J de oito semanas foram comprados do Laboratório Jackson. Os ratos estavam alojados em uma instalação de ciclo claro-escuro de 12:12 h controlada pela temperatura com livre acesso à dieta.
1. Preparação de prato ou prato de cultura revestido de colágeno
<ol><li>Para fazer 50 mL de ácido acético mol/L de ...

<ol>
	<li>Morin, O., Goulet, F., Normand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+sinusoidal+endothelial+cells:+isolation,+purification,+characterization+and+interaction+with+hepatocytes.">Liver sinusoidal endothelial cells: isolation, purification, characterization and interaction with hepatocytes.</a> Revisiones Sobre Biologia Celular: RBC. 15, 1-85 (1988).</li><li>Ibrahim, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sinusoidal+endotheliopathy+in+nonalcoholic+steatohepatitis:+therapeutic+implications.">Sinusoidal endotheliopathy in nonalcoholic steatohepatitis: therapeutic implications.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 321 (1), 67-74 (2021).</li><li>Poisson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+sinusoidal+endothelial+cells:+Physiology+and+role+in+liver+diseases.">Liver sinusoidal endothelial cells: Physiology and role in liver diseases.</a> Journal of Hepatology. 66 (1), 212-227 (2017).</li><li>Marrone, G., Shah, V. H., Gracia-Sancho, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sinusoidal+communication+in+liver+fibrosis+and+regeneration.">Sinusoidal communication in liver fibrosis and regeneration.</a> Journal of Hepatology. 65 (3), 608-617 (2016).</li><li>Shetty, S., Lalor, P. F., Adams, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+sinusoidal+endothelial+cells+-+gatekeepers+of+hepatic+immunity.">Liver sinusoidal endothelial cells - gatekeepers of hepatic immunity.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. 15 (9), 555-567 (2018).</li><li>Smedsr&#248;d, B., Pertoft, H., Gustafson, S., Laurent, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scavenger+functions+of+the+liver+endothelial+cell.">Scavenger functions of the liver endothelial cell.</a> Biochemical Journal. 266 (2), 313-327 (1990).</li><li>DeLeve, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+sinusoidal+endothelial+cells+in+hepatic+fibrosis.">Liver sinusoidal endothelial cells in hepatic fibrosis.</a> Hepatology. 61 (5), 1740-1746 (2015).</li><li>Dar, W. A., Sullivan, E., Bynon, J. S., Eltzschig, H., Ju, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischaemia+reperfusion+injury+in+liver+transplantation:+Cellular+and+molecular+mechanisms.">Ischaemia reperfusion injury in liver transplantation: Cellular and molecular mechanisms.</a> Liver International. 39 (5), 788-801 (2019).</li><li>Furuta, K., Guo, Q., Hirsova, P., Ibrahim, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Roles+of+Liver+Sinusoidal+Endothelial+Cells+in+Nonalcoholic+Steatohepatitis.">Emerging Roles of Liver Sinusoidal Endothelial Cells in Nonalcoholic Steatohepatitis.</a> Biology. 9 (11), 395 (2020).</li><li>Wu, L. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+functional+differences+between+human+liver+cancer+endothelial+cells+and+liver+sinusoidal+endothelial+cells.">Phenotypic and functional differences between human liver cancer endothelial cells and liver sinusoidal endothelial cells.</a> Journal of Vascular Research. 45 (1), 78-86 (2008).</li><li>Meyer, J., Gonelle-Gispert, C., Morel, P., B&#252;hler, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+isolation+and+purification+of+murine+liver+sinusoidal+endothelial+cells:+A+systematic+review.">Methods for isolation and purification of murine liver sinusoidal endothelial cells: A systematic review.</a> PLoS One. 11 (3), 0151945 (2016).</li><li>Meyer, J., Lacotte, S., Morel, P., Gonelle-Gispert, C., Buhler, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+for+mouse+liver+sinusoidal+endothelial+cell+isolation.">An optimized method for mouse liver sinusoidal endothelial cell isolation.</a> Experimental Cell Research. 349 (2), 291-301 (2016).</li><li>Furuta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-induced+endothelial+vascular+cell+adhesion+molecule+1+promotes+nonalcoholic+steatohepatitis+pathogenesis.">Lipid-induced endothelial vascular cell adhesion molecule 1 promotes nonalcoholic steatohepatitis pathogenesis.</a> Journal of Clinical Investigation. 131 (6), (2021).</li><li>Guo, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+&#946;(1)-enriched+extracellular+vesicles+mediate+monocyte+adhesion+and+promote+liver+inflammation+in+murine+NASH.">Integrin &#946;(1)-enriched extracellular vesicles mediate monocyte adhesion and promote liver inflammation in murine NASH.</a> Journal of Hepatology. 71 (1), 1193-1205 (2019).</li><li>Hirsova, P., Ibrahim, S. H., Bronk, S. F., Yagita, H., Gores, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vismodegib+suppresses+TRAIL-mediated+liver+injury+in+a+mouse+model+of+nonalcoholic+steatohepatitis.">Vismodegib suppresses TRAIL-mediated liver injury in a mouse model of nonalcoholic steatohepatitis.</a> PLoS One. 8 (7), 70599 (2013).</li><li>Schrage, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+CD146+is+widely+expressed+on+endothelial+cells+and+is+recognized+by+the+monoclonal+antibody+ME-9F1.">Murine CD146 is widely expressed on endothelial cells and is recognized by the monoclonal antibody ME-9F1.</a> Histochemistry and Cell Biology. 129 (4), 441-451 (2008).</li><li>Olsavszky, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+transcriptomic+network+of+multi-ligand+scavenger+receptor+Stabilin-1-+and+Stabilin-2-deficient+liver+sinusoidal+endothelial+cells.">Exploring the transcriptomic network of multi-ligand scavenger receptor Stabilin-1- and Stabilin-2-deficient liver sinusoidal endothelial cells.</a> Gene. 768, 145284 (2021).</li><li>DeLeve, L. D., Maretti-Mira, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+sinusoidal+endothelial+cell:+An+update.">Liver sinusoidal endothelial cell: An update.</a> Seminars in Liver Disease. 37 (4), 377-387 (2017).</li><li>DeLeve, L. D., Wang, X., Hu, L., McCuskey, M. K., McCuskey, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+liver+sinusoidal+endothelial+cell+phenotype+is+maintained+by+paracrine+and+autocrine+regulation.">Rat liver sinusoidal endothelial cell phenotype is maintained by paracrine and autocrine regulation.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 287 (4), 757-763 (2004).</li><li>Cabral, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+hepatocytes+and+sinusoidal+endothelial+cells+from+mouse+liver+perfusion.">Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).</li><li>Ishiguro, K., Yan, I. K., Patel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+tissue+extracellular+vesicles+from+the+liver.">Isolation of tissue extracellular vesicles from the liver.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e58649 (2019).</li><li>Topp, S. A., Upadhya, G. A., Strasberg, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cold+preservation+of+isolated+sinusoidal+endothelial+cells+in+MMP+9+knockout+mice:+effect+on+morphology+and+platelet+adhesion.">Cold preservation of isolated sinusoidal endothelial cells in MMP 9 knockout mice: effect on morphology and platelet adhesion.</a> Liver Transplantation. 10 (8), 1041-1048 (2004).</li><li>Katz, S. C., Pillarisetty, V. G., Bleier, J. I., Shah, A. B., DeMatteo, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+sinusoidal+endothelial+cells+are+insufficient+to+activate+T+cells.">Liver sinusoidal endothelial cells are insufficient to activate T cells.</a> Journal of Immunology. 173 (1), 230-235 (2004).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+preparation+method+for+isolation+of+single-cell+types+from+mouse+liver+for+proteomic+studies.">Sample preparation method for isolation of single-cell types from mouse liver for proteomic studies.</a> Proteomics. 11 (17), 3556-3564 (2011).</li><li>Do, H., Healey, J. F., Waller, E. K., Lollar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+factor+VIII+by+murine+liver+sinusoidal+endothelial+cells.">Expression of factor VIII by murine liver sinusoidal endothelial cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (28), 19587-19592 (1999).</li><li>Schrage, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+T+cell+transmigration+across+the+murine+liver+sinusoidal+endothelium+is+mediated+by+transcytosis+and+surface+presentation+of+chemokines.">Enhanced T cell transmigration across the murine liver sinusoidal endothelium is mediated by transcytosis and surface presentation of chemokines.</a> Hepatology. 48 (4), 1262-1272 (2008).</li><li>Chou, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysophosphatidic+acid+alters+the+expression+profiles+of+angiogenic+factors,+cytokines,+and+chemokines+in+mouse+liver+sinusoidal+endothelial+cells.">Lysophosphatidic acid alters the expression profiles of angiogenic factors, cytokines, and chemokines in mouse liver sinusoidal endothelial cells.</a> PLoS One. 10 (3), 0122060 (2015).</li><li>Deleve, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dacarbazine+toxicity+in+murine+liver+cells:+a+model+of+hepatic+endothelial+injury+and+glutathione+defense.">Dacarbazine toxicity in murine liver cells: a model of hepatic endothelial injury and glutathione defense.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 268 (3), 1261-1270 (1994).</li><li>Smedsr&#248;d, B., Pertoft, H., Eggertsen, G., Sundstr&#246;m, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+morphological+characterization+of+cultures+of+Kupffer+cells+and+liver+endothelial+cells+prepared+by+means+of+density+separation+in+Percoll,+and+selective+substrate+adherence.">Functional and morphological characterization of cultures of Kupffer cells and liver endothelial cells prepared by means of density separation in Percoll, and selective substrate adherence.</a> Cell and Tissue Research. 241 (3), 639-649 (1985).</li><li>Despoix, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+CD146/MCAM+is+a+marker+of+natural+killer+cell+maturation.">Mouse CD146/MCAM is a marker of natural killer cell maturation.</a> European Journal of Immunology. 38 (10), 2855-2864 (2008).</li><li>Strauss, O., Phillips, A., Ruggiero, K., Bartlett, A., Dunbar, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+identifies+distinct+subsets+of+endothelial+cells+in+the+human+liver.">Immunofluorescence identifies distinct subsets of endothelial cells in the human liver.</a> Scientific Reports. 7, 44356 (2017).</li><li>Halpern, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paired-cell+sequencing+enables+spatial+gene+expression+mapping+of+liver+endothelial+cells.">Paired-cell sequencing enables spatial gene expression mapping of liver endothelial cells.</a> Nature Biotechnology. 36 (10), 962-970 (2018).</li></ol>

No manuscrito atual, descrevemos um protocolo para o isolamento do LSEC do fígado de rato consistindo de perfusão de colagem de duas etapas e posterior classificação celular ativada por magnético (MACS). Este protocolo consiste nas seguintes três etapas: (1) Perfusão através do PV com um buffer livre de cálcio seguido de um tampão contendo colagem para alcançar a dispersão das células hepáticas; (2) Exclusão de hepatócitos com centrifugação de baixa velocidade; e (3) seleção positiva baseada em MACS d...

As células endoteliais sinusoidais hepáticos (LSECs) alinham as paredes sinusoides hepáticas e são as células não parambiais mais abundantes no fígado1. Os LSECs distinguem-se de outras células endoteliais capilares em outros lugares do corpo pela presença de fenestrae e pela falta de uma membrana clássica do porão ou um diafragma 2,3. Assim, os LSECs possuem características fenotípicas e estruturais distintas que aumentam sua permeabilidade e capacidade endócítica para eliminar uma variedade de macromoléculas circulantes, incluindo lipídios e lipoproteínas. Os LSECs desempenham um papel fundamental no crosstalk entre células parenchymal e não parenquiais, como células estelares e células imunes. Os LSECs são fundamentais na manutenção da homeostase hepática mantendo as células estelares e as células Kupffer em um estado quiescente4. Os LSECs modulam a composição das populações de células imunes hepáticas mediando a adesão e a migração trans-endotelial de leucócitos circulantes 5,6. Durante a lesão hepática aguda e crônica7, incluindo lesão isquemia-reperfusão (IRI)8, esteatohepatite não alcoólica (NASH)9, e carcinoma hepatocelular (HCC), os LSECs sofrem alterações fenotípicas conhecidas como capilarização caracterizada pela defenestração e formação da membrana do porão10. Essas alterações fenotípicas nos LSECs estão associadas à disfunção dos LSECs e à aquisição de propriedades protombolíticas, proinflammatórias e profibrogênicas.
Vários métodos para o isolamento de LSECs do fígado de rato foram desenvolvidos11. Algumas técnicas dependem da separação de células não parambientais e parínicas seguidas pela centrifugação gradiente de densidade para purificar os LSECs de frações não parambiais. A limitação deste método é a presença de macrófagos contaminados nas etapas finais do isolamento das LSECs, o que poderia afetar a pureza dos LSECsisolados 12. Este protocolo é baseado na perfusão de colagenase do fígado do camundongo e contas magnéticas CD146+ seleção positiva de células não equiquiais para purificar LSECs. LSECs isolados usando este método mostram alta pureza e morfologia preservada e viabilidade. Estes LSECs são ótimos para estudos funcionais, incluindo permeabilidade e ensaio de adesão, bem como estudos a jusante para caminhos de interesse. Além disso, com o crescente interesse em gerar grandes conjuntos de dados tanto na pesquisa clínica quanto na ciência da descoberta, esses LSECs de alta qualidade isolados de fígados saudáveis e doentes com esteatohepatite não alcoólica (NASH) ou outras condições podem ser agrupados ou usados individualmente, permitindo a geração de dados multi-omics e comparação entre saúde e doença13,14 . Além disso, os LSECs isolados podem ser empregados para desenvolver modelos in vitro tridimensionais, bem como tridimensionais, como organoides para decifrar a via de sinalização ativada em LSECs e sua comunicação intercelular com outras células hepáticas sob diferentes estímulos nocivos e em resposta a várias intervenções terapêuticas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2.0-inch 20 G Intra Venous (IV) catheter</td>
			<td>Terumo, SOmerset, NJ, USA</td>
			<td>SR-OX2051CA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#8211;3-inch perfuion tray with a hole in the center</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>customized; made in house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>405/520 viability dye</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-110-205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-inch regular curved dressing forceps</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>FS16-100-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-0 Perma-Hand silk suture</td>
			<td>Ethicon, Raritan, NJ, USA</td>
			<td>A182H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-stabilin-2 (Mouse) mAb-Alexa Fluor&#195; 488</td>
			<td>MBL International, Woburn, MA, USA</td>
			<td>D317-A48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA stock</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD146 (LSEC)-PE, anti-mouse</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-118-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD146 (LSEC) MicroBeads, mouse</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-092-007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD45-Viogreen, anti-mouse</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-110-803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen type I</td>
			<td>Corning, Corning, NY, USA</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase II</td>
			<td>Gibco, Waltham, MA, USA</td>
			<td>17101-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial cells growth medium</td>
			<td>ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>211-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FcR blocking reagent, mouse</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-092-575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo software, version 10.6</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardened Fine scissors</td>
			<td>F.S.T, Foster city, CA, USA</td>
			<td>14091-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated (37 &#176;C) and humidified recirculating perfusion apparatus equipped with Oxygen injection at a rate of 10psi.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>customized; made in house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hitachi S 4700 scanning electron microscope</td>
			<td>Hitachi Inc, Pleasanton, CA, USA</td>
			<td>SEM096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS columns</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS pre-separation filters (70 &#956;m)</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-095-823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS rinsing buffer</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-091-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Smart Strainer (70 &#956;m)</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-098-462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACSQunt flow cytometer</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell Cell Culture Insert</td>
			<td>Millipore Sigma, Burlington, MA, USA</td>
			<td>PITP01250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nexcelom cell counter</td>
			<td>Nexcelom bioscience, Lawrence, MA, USA</td>
			<td>Cellometer Auto T4 Plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare, Chicago, IL, USA</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>F.S.T, Foster city, CA, USA</td>
			<td>14001-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Very small curved dressing forceps</td>
			<td>F.S.T, Foster city, CA, USA</td>
			<td>11063-07</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of mouse primary liver sinusoidal endothelial cells

As células endoteliais sinusoidais hepáticas (LSECs) são células endoteliais especializadas localizadas na interface entre a circulação e o parênquim hepático. Os LSECs têm uma morfologia distinta caracterizada pela presença de fenestrae e pela ausência de membrana do porão. Os LSECs desempenham papéis essenciais em muitas doenças patológicas no fígado, incluindo desregulação metabólica, inflamação, fibrose, angiogênese e carcinogênese. No entanto, pouco foi publicado sobre o isolamento e caracterização dos LSECs. Aqui, este protocolo discute o isolamento do LSEC de camundongos saudáveis e não alcoólicos da doença hepática gordurosa (NAFLD). O protocolo é baseado na perfusão de colagenase do fígado do rato e contas magnéticas seleção positiva de células nãoparambiais para purificar LSECs. Este estudo caracteriza os LSECs usando marcadores específicos por citometria de fluxo e identifica as características fenotípicas características através da microscopia eletrônica de varredura. Os LSECs isolados seguindo este protocolo podem ser usados para estudos funcionais, incluindo ensaios de adesão e permeabilidade, bem como estudos a jusante para um determinado caminho de interesse. Além disso, esses LSECs podem ser agrupados ou usados individualmente, permitindo a geração de dados multi-omics, incluindo RNA-seq em massa ou célula única, proteômica ou fosfo-proteômica, e Ensaio para Chromatina Acessível transposase usando sequenciamento (ATAC-seq), entre outros. Este protocolo será útil para os pesquisadores que estudam a comunicação dos LSECs com outras células hepáticas em saúde e doenças e permitirá uma compreensão aprofundada do papel dos LSECs nos mecanismos patogênicos de lesões hepáticas agudas e crônicas.

Esquemas experimentais e equipamentos configurados: Neste protocolo, o fígado de rato foi digerido usando um circuito de perfusão fechado, então células não parêquias e hepatócitos foram separados por centrifugação de baixa velocidade a 50 x g por 2 min. Os LSECs primários foram isolados usando a seleção de contas magnéticas CD146 da fração não equiquial. Os esquemas experimentais são mostrados na Figura 1A. A cânula foi colocada através do PV ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells at JoVE.com

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

Aqui descrevemos e demonstramos um protocolo para o isolamento da célula endotelial do fígado do camundongo primário (LSEC). O protocolo é baseado na perfusão da colagem hepática, purificação celular não parenquimal por centrifugação de baixa velocidade e seleção de contas magnéticas CD146. Também fenótipo e caracterizamos esses LSECs isolados usando citometria de fluxo e microscopia eletrônica de varredura.

Isolamento e Caracterização de Células Endoteliais Hemorlicais do Fígado Primário do Rato

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...

Aqui, demonstramos nosso protocolo de isolamento primário de células sinusoidais do fígado do rato ou isolamento de LSECs. O protocolo consiste em perfusão de colagem hepática e ultracentrifugação de baixa velocidade para purificação celular não parenchymal e seleção de contas magnéticas CD146. Nosso método de isolamento LSEC é altamente eficiente e aplicável ao fígado de camundongo saudável e doente.Os LSECs isolados apresentam alta pureza e preservam a estrutura e a função. Os LSECs isolados usando este protocolo são ótimos para estudos funcionais e moleculares e geração de dados multi-omics. Este protocolo será útil para estudar a comunicação intercelular no fígado.Comece por revestir pratos de cultura de 10 centímetros com três mililitros de solução de colágeno. Em seguida, incubar os pratos em temperatura ambiente por uma hora. Após uma hora, remova o excesso de fluido da superfície revestida.Lave os pratos com PBS três vezes e deixe-os secar. Configure o aparelho de perfusão aquecido e umidificado. Enxágüe o sistema de perfusão usando 10% de alvejante por cinco minutos.Em seguida, enxágue o sistema novamente com água estéril por mais 10 minutos. Escorra o líquido de lavagem o máximo possível antes de perfumar com a solução de colagemnase. Infundir a solução de colagem através do sistema de perfusão para pré-aniá-la a 37 graus Celsius.Defina a taxa de bomba para acelerar uma no mostrador de controle de velocidade. Mantenha a velocidade igual durante todo o procedimento. Pesar o rato para o procedimento.Em seguida, fixá-lo na superfície cirúrgica. Pulverize o abdômen do rato com 70% de etanol. Usando uma tesoura cirúrgica, faça uma incisão de aproximadamente cinco centímetros, desde a parte inferior do abdômen até o processo xifoide.Depois disso, faça dois cortes laterais usando uma pequena tesoura de íris em cada lado do abdômen para expor totalmente os órgãos abdominais. Coloque a baia do cateter IV sob as costas do animal para levantar e nivelar o abdômen. Usando um fórceps curvos regulares, puxe suavemente os intestinos e o estômago para a esquerda do animal.Em seguida, coloque uma sutura cirúrgica 5-0 sob a veia cava inferior, ou IVC, logo abaixo do rim esquerdo exposto. Amarre um engate solto na sutura. Em seguida, coloque outra sutura cirúrgica 5-0 ao redor da veia do portal hepático.Coloque a sutura logo acima do ponto de ramificação da veia esplênica da veia hepática. Mais uma vez, amarre um engate solto na sutura. Utilizando a sutura venosa do portal como tensão, insira o cateter IV de calibre 20 na veia do portal hepático um centímetro abaixo de onde se ramifica para a veia do portal hepático direito e esquerdo.Em seguida, deslize o cateter até a veia, mas mantenha-o abaixo da área de ramificação. Deixe o sangue viajar pelo cateter até que comece a escorrer. Fixar o cateter IV com a sutura venosa do portal.Use uma linha IV para fixar uma garrafa IV com tampão A ao cateter. Em seguida, lave o fígado com esta solução, evitando a entrada de ar no sistema. Amarre a sutura ao redor do IVC abaixo do rim.Depois disso, corte o IVC abaixo da sutura para permitir que o animal sangre. Uma vez perfumado, corte o estômago, intestinos, baço e outras entranhas presas ao fígado. Em seguida, corte o diafragma e os principais vasos da cavidade torácica.Retire o fígado do animal e coloque-o na bandeja de perfusão. Remova cuidadosamente a linha IV e conecte a solução de colagem na câmara de recirculação. Deixe o fígado perfundir até que a cápsula fique modelada e pareça mole.Isso normalmente deve levar de 10 a 15 minutos. Uma vez digerido, remova o fígado da câmara e coloque-o em uma placa de Petri de 10 centímetros com cerca de 20 mililitros de DMEM sem soro. Desmonte suavemente o fígado com algumas pontas de pipeta e descarte a árvore biliar.Depois disso, filtre a suspensão hepática através de um coador de células de 70 micrômetros em um tubo cônico de 50 mililitros. Centrifugar a suspensão da célula a 50 vezes G por dois minutos em temperatura ambiente. Em seguida, colete o supernatante contendo células hepáticas não parenchímicas.Centrifugar o supernante a 300 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Depois disso, colete a pelota celular e resuspense-a em um mililitro de tampão de isolamento. Determine o número da célula usando um contador automático de células seguindo as instruções do fabricante.Em seguida, centrifugar a suspensão celular. Aspire o supernascer inteiramente e resuspenja a pelota com 90 microliters de tampão de isolamento por 10 milhões de células. Adicione 10 microliters de MicroEsferas CD146 por 10 milhões de células totais.Misture bem e incubar por 15 minutos a quatro graus Celsius. Para lavar as células, adicione um a dois mililitros de tampão de isolamento por 10 milhões de células. Centrifugar a solução a 300 vezes G por 10 minutos.Depois disso, aspire o supernaente inteiramente e resuspenja até um bilhão de células em 500 microliters de tampão de isolamento. Em seguida, prepare a coluna de separação enxaguando-a com três mililitros de tampão de isolamento. Aplique a suspensão da célula na coluna empilhada com filtros de pré-separação de 70 micrômetros.Lave a coluna com três mililitros de tampão de isolamento três vezes. Depois disso, remova a coluna do separador e coloque-a em um tubo centrífuga de 15 mililitros. Pipeta cinco mililitros de tampão de isolamento na coluna.Para recuperar as células magnéticas rotuladas por contas, empurre firmemente o êmbolo para dentro da coluna para esvaziar as células. Finalmente, centrifugar as células a 300 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius. A pureza isolada dos LSECs e os marcadores superficiais foram avaliados com citometria de fluxo.A análise de dados e a estratégia de gating para LSECs e singlets fechados são baseados em dados de dispersão e dispersão lateral. LSECs isolados foram manchados com um corante de viabilidade e uma combinação de anticorpos CD45, CD146 e Stabilin-2. LSECs viáveis foram fechados na população negativa CD45 e analisados para a expressão CD146 e Stabilin-2.A partir desse dado, foi confirmado que as LSECs isoladas apresentaram maiores 94% de viabilidade e maiores que 90% de pureza. O fenótipo específico do LSEC das células isoladas foi confirmado ainda usando microscopia leve e microscopia eletrônica de varredura. Os LSECs isolados foram cultivados no meio de crescimento completo por seis horas e examinados por microscopia leve.As setas brancas na imagem SEM indicam fenestrae LSEC, que é uma característica morfológica dos LSECs. As etapas críticas para garantir a perfusão completa de um tecido hepático são o posicionamento adequado da fita do cateter, evitando a introdução de ar no cateter e o tempo ideal de digestão da colagemnase. LSEC de alta qualidade adquirida usando nosso protocolo facilitará a identificação do mecanismo molecular da função LSEC e melhorará nossa compreensão de seu papel na comunicação intercelular no fígado, na saúde e na doença.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Isolamento de Valvular Células Endoteliais

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Biologia

Isolation &#38; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Isolation & Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Isolamento &amp; Caracterização da Hoechst Baixa CD45 Negativo Mouse Células-Tronco Mesenquimais de pulmão

Tissue resident mesenchymal stem cells (MSC) are important regulators of tissue repair or regeneration, fibrosis, inflammation, angiogenesis and tumor ...

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

Isolamento de células primário do mouse trofoblasto e Ensaio invasão do trofoblasto

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Isolamento de Células Embrionárias ventriculares endoteliais

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Isolamento e Cultura do mouse primárias células pancreáticas acinares

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

O isolamento de células endoteliais de Murino Válvula

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

A Standardized Method for the Analysis of Liver Sinusoidal Endothelial Cells and Their Fenestrations by Scanning Electron Microscopy

Um método padronizado para a Análise do fígado sinusoidal células endoteliais e Seus fenestrações por Microscopia Eletrônica de Varredura

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolamento e cultura primária de células de camundongo aórtica endoteliais

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells

Protocolo para o isolamento de hepatócitos humanos primários e Correspondente principais populações de células do fígado não-parenquimatosas

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic ...

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

Isolamento de células de camundongo Coronária endoteliais

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...