Name: isolation and characterization of mouse primary liver sinusoidal endothelial cells
Uploaded: 2021-12-16T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells at JoVE.com

Эта работа была поддержана Национальным институтом диабета и заболеваний пищеварительной системы и почек NIH (1RO1DK122948 to SHI) и NIH Silvio O. Conte Digestive Diseases Research Core Centers P30 grant mechanism (DK084567). Поддержку КФ оказывали также зарубежные исследовательские стипендии Японского общества содействия развитию науки (JSPS). Мы также хотели бы поблагодарить доктора Грегори Горса и Стивена Бронка за их оригинальный дизайн и оптимизацию аппарата перфузии коллагеназы.

Протоколы для животных были проведены в соответствии с одобрением Институционального комитета по уходу за животными и их использованию (IACUC) клиники Майо. Восьминедельные самцы мышей C57BL/6J были приобретены в лаборатории Джексона. Мышей помещали в 12:12-часовой цикл со свободным доступом ?...

<ol>
	<li>Morin, O., Goulet, F., Normand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+sinusoidal+endothelial+cells:+isolation,+purification,+characterization+and+interaction+with+hepatocytes.">Liver sinusoidal endothelial cells: isolation, purification, characterization and interaction with hepatocytes.</a> Revisiones Sobre Biologia Celular: RBC. 15, 1-85 (1988).</li><li>Ibrahim, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sinusoidal+endotheliopathy+in+nonalcoholic+steatohepatitis:+therapeutic+implications.">Sinusoidal endotheliopathy in nonalcoholic steatohepatitis: therapeutic implications.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 321 (1), 67-74 (2021).</li><li>Poisson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+sinusoidal+endothelial+cells:+Physiology+and+role+in+liver+diseases.">Liver sinusoidal endothelial cells: Physiology and role in liver diseases.</a> Journal of Hepatology. 66 (1), 212-227 (2017).</li><li>Marrone, G., Shah, V. H., Gracia-Sancho, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sinusoidal+communication+in+liver+fibrosis+and+regeneration.">Sinusoidal communication in liver fibrosis and regeneration.</a> Journal of Hepatology. 65 (3), 608-617 (2016).</li><li>Shetty, S., Lalor, P. F., Adams, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+sinusoidal+endothelial+cells+-+gatekeepers+of+hepatic+immunity.">Liver sinusoidal endothelial cells - gatekeepers of hepatic immunity.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. 15 (9), 555-567 (2018).</li><li>Smedsr&#248;d, B., Pertoft, H., Gustafson, S., Laurent, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scavenger+functions+of+the+liver+endothelial+cell.">Scavenger functions of the liver endothelial cell.</a> Biochemical Journal. 266 (2), 313-327 (1990).</li><li>DeLeve, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+sinusoidal+endothelial+cells+in+hepatic+fibrosis.">Liver sinusoidal endothelial cells in hepatic fibrosis.</a> Hepatology. 61 (5), 1740-1746 (2015).</li><li>Dar, W. A., Sullivan, E., Bynon, J. S., Eltzschig, H., Ju, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischaemia+reperfusion+injury+in+liver+transplantation:+Cellular+and+molecular+mechanisms.">Ischaemia reperfusion injury in liver transplantation: Cellular and molecular mechanisms.</a> Liver International. 39 (5), 788-801 (2019).</li><li>Furuta, K., Guo, Q., Hirsova, P., Ibrahim, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Roles+of+Liver+Sinusoidal+Endothelial+Cells+in+Nonalcoholic+Steatohepatitis.">Emerging Roles of Liver Sinusoidal Endothelial Cells in Nonalcoholic Steatohepatitis.</a> Biology. 9 (11), 395 (2020).</li><li>Wu, L. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+functional+differences+between+human+liver+cancer+endothelial+cells+and+liver+sinusoidal+endothelial+cells.">Phenotypic and functional differences between human liver cancer endothelial cells and liver sinusoidal endothelial cells.</a> Journal of Vascular Research. 45 (1), 78-86 (2008).</li><li>Meyer, J., Gonelle-Gispert, C., Morel, P., B&#252;hler, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+isolation+and+purification+of+murine+liver+sinusoidal+endothelial+cells:+A+systematic+review.">Methods for isolation and purification of murine liver sinusoidal endothelial cells: A systematic review.</a> PLoS One. 11 (3), 0151945 (2016).</li><li>Meyer, J., Lacotte, S., Morel, P., Gonelle-Gispert, C., Buhler, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+for+mouse+liver+sinusoidal+endothelial+cell+isolation.">An optimized method for mouse liver sinusoidal endothelial cell isolation.</a> Experimental Cell Research. 349 (2), 291-301 (2016).</li><li>Furuta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-induced+endothelial+vascular+cell+adhesion+molecule+1+promotes+nonalcoholic+steatohepatitis+pathogenesis.">Lipid-induced endothelial vascular cell adhesion molecule 1 promotes nonalcoholic steatohepatitis pathogenesis.</a> Journal of Clinical Investigation. 131 (6), (2021).</li><li>Guo, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+&#946;(1)-enriched+extracellular+vesicles+mediate+monocyte+adhesion+and+promote+liver+inflammation+in+murine+NASH.">Integrin &#946;(1)-enriched extracellular vesicles mediate monocyte adhesion and promote liver inflammation in murine NASH.</a> Journal of Hepatology. 71 (1), 1193-1205 (2019).</li><li>Hirsova, P., Ibrahim, S. H., Bronk, S. F., Yagita, H., Gores, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vismodegib+suppresses+TRAIL-mediated+liver+injury+in+a+mouse+model+of+nonalcoholic+steatohepatitis.">Vismodegib suppresses TRAIL-mediated liver injury in a mouse model of nonalcoholic steatohepatitis.</a> PLoS One. 8 (7), 70599 (2013).</li><li>Schrage, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+CD146+is+widely+expressed+on+endothelial+cells+and+is+recognized+by+the+monoclonal+antibody+ME-9F1.">Murine CD146 is widely expressed on endothelial cells and is recognized by the monoclonal antibody ME-9F1.</a> Histochemistry and Cell Biology. 129 (4), 441-451 (2008).</li><li>Olsavszky, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+transcriptomic+network+of+multi-ligand+scavenger+receptor+Stabilin-1-+and+Stabilin-2-deficient+liver+sinusoidal+endothelial+cells.">Exploring the transcriptomic network of multi-ligand scavenger receptor Stabilin-1- and Stabilin-2-deficient liver sinusoidal endothelial cells.</a> Gene. 768, 145284 (2021).</li><li>DeLeve, L. D., Maretti-Mira, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+sinusoidal+endothelial+cell:+An+update.">Liver sinusoidal endothelial cell: An update.</a> Seminars in Liver Disease. 37 (4), 377-387 (2017).</li><li>DeLeve, L. D., Wang, X., Hu, L., McCuskey, M. K., McCuskey, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+liver+sinusoidal+endothelial+cell+phenotype+is+maintained+by+paracrine+and+autocrine+regulation.">Rat liver sinusoidal endothelial cell phenotype is maintained by paracrine and autocrine regulation.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 287 (4), 757-763 (2004).</li><li>Cabral, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+hepatocytes+and+sinusoidal+endothelial+cells+from+mouse+liver+perfusion.">Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).</li><li>Ishiguro, K., Yan, I. K., Patel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+tissue+extracellular+vesicles+from+the+liver.">Isolation of tissue extracellular vesicles from the liver.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e58649 (2019).</li><li>Topp, S. A., Upadhya, G. A., Strasberg, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cold+preservation+of+isolated+sinusoidal+endothelial+cells+in+MMP+9+knockout+mice:+effect+on+morphology+and+platelet+adhesion.">Cold preservation of isolated sinusoidal endothelial cells in MMP 9 knockout mice: effect on morphology and platelet adhesion.</a> Liver Transplantation. 10 (8), 1041-1048 (2004).</li><li>Katz, S. C., Pillarisetty, V. G., Bleier, J. I., Shah, A. B., DeMatteo, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+sinusoidal+endothelial+cells+are+insufficient+to+activate+T+cells.">Liver sinusoidal endothelial cells are insufficient to activate T cells.</a> Journal of Immunology. 173 (1), 230-235 (2004).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+preparation+method+for+isolation+of+single-cell+types+from+mouse+liver+for+proteomic+studies.">Sample preparation method for isolation of single-cell types from mouse liver for proteomic studies.</a> Proteomics. 11 (17), 3556-3564 (2011).</li><li>Do, H., Healey, J. F., Waller, E. K., Lollar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+factor+VIII+by+murine+liver+sinusoidal+endothelial+cells.">Expression of factor VIII by murine liver sinusoidal endothelial cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (28), 19587-19592 (1999).</li><li>Schrage, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+T+cell+transmigration+across+the+murine+liver+sinusoidal+endothelium+is+mediated+by+transcytosis+and+surface+presentation+of+chemokines.">Enhanced T cell transmigration across the murine liver sinusoidal endothelium is mediated by transcytosis and surface presentation of chemokines.</a> Hepatology. 48 (4), 1262-1272 (2008).</li><li>Chou, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysophosphatidic+acid+alters+the+expression+profiles+of+angiogenic+factors,+cytokines,+and+chemokines+in+mouse+liver+sinusoidal+endothelial+cells.">Lysophosphatidic acid alters the expression profiles of angiogenic factors, cytokines, and chemokines in mouse liver sinusoidal endothelial cells.</a> PLoS One. 10 (3), 0122060 (2015).</li><li>Deleve, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dacarbazine+toxicity+in+murine+liver+cells:+a+model+of+hepatic+endothelial+injury+and+glutathione+defense.">Dacarbazine toxicity in murine liver cells: a model of hepatic endothelial injury and glutathione defense.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 268 (3), 1261-1270 (1994).</li><li>Smedsr&#248;d, B., Pertoft, H., Eggertsen, G., Sundstr&#246;m, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+morphological+characterization+of+cultures+of+Kupffer+cells+and+liver+endothelial+cells+prepared+by+means+of+density+separation+in+Percoll,+and+selective+substrate+adherence.">Functional and morphological characterization of cultures of Kupffer cells and liver endothelial cells prepared by means of density separation in Percoll, and selective substrate adherence.</a> Cell and Tissue Research. 241 (3), 639-649 (1985).</li><li>Despoix, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+CD146/MCAM+is+a+marker+of+natural+killer+cell+maturation.">Mouse CD146/MCAM is a marker of natural killer cell maturation.</a> European Journal of Immunology. 38 (10), 2855-2864 (2008).</li><li>Strauss, O., Phillips, A., Ruggiero, K., Bartlett, A., Dunbar, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+identifies+distinct+subsets+of+endothelial+cells+in+the+human+liver.">Immunofluorescence identifies distinct subsets of endothelial cells in the human liver.</a> Scientific Reports. 7, 44356 (2017).</li><li>Halpern, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paired-cell+sequencing+enables+spatial+gene+expression+mapping+of+liver+endothelial+cells.">Paired-cell sequencing enables spatial gene expression mapping of liver endothelial cells.</a> Nature Biotechnology. 36 (10), 962-970 (2018).</li></ol>

В текущей рукописи мы описываем протокол изоляции LSEC из печени мыши, состоящий из двухступенчатой перфузии коллагеназы и последующей магнитно-активированной сортировки клеток (MACS). Этот протокол состоит из следующих трех этапов: (1) перфузия через PV с буфером без кальция с последующим б...

Синусоидальные эндотелиальные клетки печени (LSECs) выстилают стенки синусоиды печени и являются наиболее распространенными непаренхимальными клетками в печени1. ЛСЭС отличаются от других капиллярных эндотелиальных клеток в других частях тела наличием фенестр и отсутствием классической базальной мембраны или диафрагмы 2,3. Следовательно, ЛСЭС обладают отличительными фенотипическими и структурными характеристиками, которые повышают их проницаемость и эндоцитарную способность устранять различные циркулирующие макромолекулы, включая липиды и липопротеины. LSECs играют ключевую роль в перекрестных помехах между паренхиматозными и непаренхимальными клетками, такими как звездчатые клетки и иммунные клетки. ЛСЭС играют ключевую роль в поддержании гомеостаза печени, сохраняя звездчатые клетки и клетки Купфера в состоянии покоя4. ЛСЭС модулируют состав популяций печеночных иммунных клеток, опосредуя адгезию и трансэндотелиальную миграцию циркулирующих лейкоцитов 5,6. Во время острого и хронического повреждения печени7, включая ишемию-реперфузионное повреждение (IRI)8, неалкогольный стеатогепатит (НАСГ)9 и гепатоцеллюлярную карциному (ГЦК), ЛСЭС подвергаются фенотипическим изменениям, известным как капилляризация, характеризующаяся дефенестрацией и образованием базальной мембраны10. Эти фенотипические изменения в ЛСЭС связаны с дисфункцией ЛСЭС и приобретением протромботических, провоспалительных и профиброгенных свойств.
Было разработано несколько методов выделения ЛСЭС из печени мышей11. Некоторые методы зависят от разделения непаренхимальных и паренхиматозных клеток с последующим центрифугированием градиента плотности для очистки LSECs от непаренхимальных фракций. Ограничением этого метода является наличие загрязняющих макрофагов на заключительных этапах выделения ЛСЭС, что может повлиять на чистоту изолированных ЛСЭС12. Этот протокол основан на перфузии коллагеназы печени мыши и положительном отборе магнитных шариков CD146+ непаренхимальных клеток для очистки ЛСЭС. ЛСЭС, выделенные с помощью этого метода, демонстрируют высокую чистоту и сохраненную морфологию и жизнеспособность. Эти ЛСЭС являются оптимальными для функциональных исследований, включая анализ проницаемости и адгезии, а также для последующих исследований интересующих путей. Кроме того, с растущим интересом к созданию больших наборов данных как в клинических исследованиях, так и в науке об открытиях, эти высококачественные ЛСЭС, выделенные как из здоровой, так и из больной печени с неалкогольным стеатогепатитом (НАСГ) или другими состояниями, могут объединяться или использоваться индивидуально, что позволяет генерировать мультиомические данные и сравнивать здоровье и заболевание13,14 . Кроме того, изолированные ЛСЭС могут быть использованы для разработки двумерных, а также трехмерных моделей in vitro, таких как органоиды, для расшифровки активированного сигнального пути в ЛСЭС и их межклеточной связи с другими клетками печени при различных вредных стимулах и в ответ на различные терапевтические вмешательства.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2.0-inch 20 G Intra Venous (IV) catheter</td>
			<td>Terumo, SOmerset, NJ, USA</td>
			<td>SR-OX2051CA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#8211;3-inch perfuion tray with a hole in the center</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>customized; made in house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>405/520 viability dye</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-110-205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-inch regular curved dressing forceps</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>FS16-100-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-0 Perma-Hand silk suture</td>
			<td>Ethicon, Raritan, NJ, USA</td>
			<td>A182H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-stabilin-2 (Mouse) mAb-Alexa Fluor&#195; 488</td>
			<td>MBL International, Woburn, MA, USA</td>
			<td>D317-A48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA stock</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD146 (LSEC)-PE, anti-mouse</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-118-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD146 (LSEC) MicroBeads, mouse</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-092-007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD45-Viogreen, anti-mouse</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-110-803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen type I</td>
			<td>Corning, Corning, NY, USA</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase II</td>
			<td>Gibco, Waltham, MA, USA</td>
			<td>17101-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial cells growth medium</td>
			<td>ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>211-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FcR blocking reagent, mouse</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-092-575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo software, version 10.6</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardened Fine scissors</td>
			<td>F.S.T, Foster city, CA, USA</td>
			<td>14091-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated (37 &#176;C) and humidified recirculating perfusion apparatus equipped with Oxygen injection at a rate of 10psi.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>customized; made in house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hitachi S 4700 scanning electron microscope</td>
			<td>Hitachi Inc, Pleasanton, CA, USA</td>
			<td>SEM096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS columns</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS pre-separation filters (70 &#956;m)</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-095-823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS rinsing buffer</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-091-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Smart Strainer (70 &#956;m)</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-098-462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACSQunt flow cytometer</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell Cell Culture Insert</td>
			<td>Millipore Sigma, Burlington, MA, USA</td>
			<td>PITP01250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nexcelom cell counter</td>
			<td>Nexcelom bioscience, Lawrence, MA, USA</td>
			<td>Cellometer Auto T4 Plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare, Chicago, IL, USA</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>F.S.T, Foster city, CA, USA</td>
			<td>14001-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Very small curved dressing forceps</td>
			<td>F.S.T, Foster city, CA, USA</td>
			<td>11063-07</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of mouse primary liver sinusoidal endothelial cells

Синусоидальные эндотелиальные клетки печени (LSECs) представляют собой специализированные эндотелиальные клетки, расположенные на границе между кровообращением и паренхимой печени. ЛСЭС имеют отчетливую морфологию, характеризующуюся наличием фенестрат и отсутствием базальной мембраны. ЛСЭС играют важную роль во многих патологических расстройствах печени, включая метаболическую дисрегуляцию, воспаление, фиброз, ангиогенез и канцерогенез. Тем не менее, мало что было опубликовано об изоляции и характеристике LSEC. Здесь в этом протоколе обсуждается изоляция LSEC как от здоровых, так и от неалкогольных мышей с жировой болезнью печени (НАЖБП). Протокол основан на перфузии коллагеназы печени мыши и магнитном отборе непаренхимальных клеток для очистки ЛСЭС. Это исследование характеризует ЛСЭС с использованием специфических маркеров с помощью проточной цитометрии и идентифицирует характерные фенотипические особенности с помощью сканирующей электронной микроскопии. ЛСЭС, выделенные в соответствии с этим протоколом, могут использоваться для функциональных исследований, включая анализы адгезии и проницаемости, а также для последующих исследований для конкретного пути, представляющего интерес. Кроме того, эти ЛСЭС могут быть объединены или использованы по отдельности, что позволяет генерировать мультиомные данные, включая объемную или одноклеточную РНК-seq, протеомную или фосфопротеомику и анализ на транспозазно-доступный хроматин с использованием секвенирования (ATAC-seq), среди прочих. Этот протокол будет полезен для исследователей, изучающих связь LSECs с другими клетками печени в области здоровья и болезни, и позволит глубоко понять роль LSECs в патогенных механизмах острого и хронического повреждения печени.

Экспериментальные схемы и наладка оборудования: В этом протоколе печень мыши переваривали с помощью замкнутого перфузионного контура, затем непаренхимальные клетки и гепатоциты отделяли низкоскоростным центрифугированием при 50 х г в течение 2 мин. Первичные ЛСЭС были ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells at JoVE.com

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

Здесь мы описываем и демонстрируем протокол первичной изоляции синусоидальных эндотелиальных клеток печени мыши (LSEC). Протокол основан на перфузии коллагеназы печени, непаренхимальной очистке клеток низкоскоростной центрифугированием и выборе магнитных шариков CD146. Мы также фенотипируем и характеризуем эти изолированные ЛСЭК с помощью проточной цитометрии и сканирующей электронной микроскопии.

Выделение и характеристика первичных синусоидальных эндотелиальных клеток печени мыши

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...

Здесь мы демонстрируем наш протокол первичной изоляции синусоидальных клеток печени мыши или изоляции LSECs. Протокол состоит из перфузии коллагеназы печени и низкоскоростного ультрацентрифугирования для непаренхиматозной очистки клеток и отбора магнитных шариков CD146. Наш метод изоляции LSEC очень эффективен и применим к здоровой и больной печени мыши.Изолированные ЛСЭК обладают высокой чистотой и сохраняют структуру и функции. ЛСЭС, выделенные с использованием этого протокола, являются оптимальными для функциональных и молекулярных исследований и генерации мультиомных данных. Этот протокол будет полезен для изучения межклеточной связи в печени.Начните с покрытия 10-сантиметровой культуральной посуды тремя миллилитрами раствора коллагена. Затем высиживать посуду при комнатной температуре в течение одного часа. Через час удалите лишнюю жидкость с покрытой поверхности.Трижды вымойте посуду с PBS и дайте ей высохнуть на воздухе. Установите нагреваемый и увлажненный рециркуляционный перфузионный аппарат. Промойте перфузионную систему с использованием 10% отбеливателя в течение пяти минут.Затем снова промойте систему стерильной водой еще на 10 минут. Процедите промывочную жидкость как можно больше перед перфузией раствором коллагеназы. Настаивают раствор коллагеназы через перфузионную систему, чтобы предварительно прогреть его до 37 градусов цельсия.Установите скорость насоса на один на циферблате управления скоростью. Держите скорость одинаковой на протяжении всей процедуры. Взвесьте мышь для процедуры.Затем закрепите его на хирургической поверхности. Опрыскивайте брюшко мыши 70% этанолом. С помощью хирургических ножниц сделайте разрез примерно в пять сантиметров, начиная от нижней части живота до мечевидного отростка.После этого сделайте два боковых разреза, используя небольшие ножницы радужной оболочки с каждой стороны живота, чтобы полностью обнажить органы брюшной полости. Поместите оболочку IV катетера под спину животного, чтобы поднять и выровнять живот. Используя обычную изогнутую повязку щипцами, аккуратно оттяните кишечник и желудок влево от животного.Затем поместите хирургический шов 5-0 под нижнюю полую вену, или IVC, чуть ниже открытой левой почки. Завяжите свободную сцепку в шов. Далее накладывают еще 5-0 хирургических швов вокруг печеночной воротной вены.Поместите шов чуть выше точки ветвления селезеночной вены печеночной воротной вены. Опять же, завяжите свободную сцепку в шов. Используя швы воротной вены в качестве натяжения, вставьте катетер IV 20-го калибра в печеночную воротную вену на один сантиметр ниже, где он разветвляется на правую и левую печеночную воротную вену.Затем сдвиньте катетер вверх по вене, но держите его ниже области ветвления. Позвольте крови пройти вниз по катетеру, пока она не начнет капать. Закрепите внутривенный катетер швом воротной вены.Используйте внутривенную линию, чтобы прикрепить к катетеру флакон iv с буфером А. Затем промыть печень этим раствором, избегая попадания воздуха в систему. Завяжите шов вокруг IVC ниже почки.После этого отрежьте IVC ниже шва, чтобы животное кровоточило. После перфузии отрежьте желудок, кишечник, селезенку и другие внутренности, прикрепленные к печени. Затем отрежьте диафрагму и основные сосуды от грудной полости.Извлеките печень у животного и поместите ее на перфузионный лоток. Осторожно удалите внутривенную линию и подключите раствор коллагеназы в рециркуляционную камеру. Позвольте печени перфузиться до тех пор, пока капсула не станет смоделированной и не станет кашицеобразной.Обычно это занимает от 10 до 15 минут. После переваривания извлеките печень из камеры и поместите ее на 10-сантиметровую чашку Петри с примерно 20 миллилитрами dmem без сыворотки. Аккуратно разберите печень парой кончиков пипетки и выбросьте билиарное дерево.После этого фильтруют суспензию печени через 70-микрометровый клеточный ситечко в 50-миллилитровую коническую трубку. Центрифугируйте клеточную суспензию в 50 раз G в течение двух минут при комнатной температуре. Затем соберите супернатант, содержащий непаренхиматозные печеночные клетки.Центрифугируйте супернатант в 300 раз G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. После этого соберите гранулу клетки и повторно суспендируйте ее в один миллилитр изоляционного буфера. Определите номер ячейки с помощью автоматического счетчика ячеек, следуя инструкциям производителя.Далее центрифугируют клеточную суспензию. Аспирировать супернатант полностью и повторно суспендировать гранулу с 90 микролитрами изоляционного буфера на 10 миллионов клеток. Добавьте 10 микролитров CD146 MicroBeads на 10 миллионов клеток.Хорошо перемешать и инкубировать в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия. Чтобы промыть клетки, добавьте один-два миллилитра изоляционного буфера на 10 миллионов клеток. Центрифугируйте раствор в 300 раз G в течение 10 минут.После этого аспирируют супернатант целиком и повторно суспендируют до одного миллиарда клеток в 500 микролитрах изоляционного буфера. Далее подготовьте разделительную колонну, промыв ее тремя миллилитрами изоляционного буфера. Нанесите суспензию ячейки на колонну, уложенную 70-микрометровыми фильтрами предварительного разделения.Трижды промыть колонну тремя миллилитрами изоляционного буфера. После этого снимите колонну с сепаратора и поместите ее на 15-миллилитровую центрифужную трубку. Пипетка пять миллилитров изоляционного буфера на колонну.Чтобы восстановить ячейки, помеченные магнитным шариком, плотно втолкните поршень в колонну, чтобы промыть ячейки. Наконец, центрифугируйте клетки в 300 раз G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Изолированную чистоту ЛСЭС и поверхностные маркеры оценивали с помощью проточной цитометрии.Анализ данных и стратегия сбора данных для закрытых ЛСЭК и синглетов основаны на данных прямого рассеяния и бокового рассеяния. Изолированные ЛСЭС были окрашены красителем жизнеспособности и комбинацией антител CD45, CD146 и Stabilin-2. Жизнеспособные LSECs были обнаружены на CD45 отрицательной популяции и проанализированы на cd146 и экспрессию стабилина-2.Из этих данных было подтверждено, что изолированные ЛСЭК имели более 94% жизнеспособности и более 90% чистоты. LSEC-специфический фенотип изолированных клеток был дополнительно подтвержден с помощью световой микроскопии и сканирующей электронной микроскопии. Изолированные ЛСЭС культивировали в полной питательной среде в течение шести часов и исследовали с помощью световой микроскопии.Белые стрелки на изображении SEM указывают на LSEC fenestrae, что является характерной морфологической особенностью LSECs. Критическими шагами для обеспечения полной перфузии ткани печени являются правильное позиционирование катетерной ленты, избегание введения воздуха в катетер и оптимальные сроки переваривания коллагеназы. Высококачественные LSEC, полученные с использованием нашего протокола, облегчат идентификацию молекулярного механизма функции LSEC и улучшат наше понимание их роли в межклеточной связи в печени, в здоровье и в болезни.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Выделение клапанные эндотелиальных клеток

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Isolation &#38; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Isolation & Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Изоляция и характеристика Hoechst Низкий CD45 Отрицательный Мышь легких мезенхимальных стволовых клеток

Tissue resident mesenchymal stem cells (MSC) are important regulators of tissue repair or regeneration, fibrosis, inflammation, angiogenesis and tumor ...

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

Изоляция первичной мышь клетки трофобласта и анализа трофобласта Вторжение

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Выделение эмбриональных клетках эндотелия желудочков

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Выделение и культивирование Мышь первичные клетки поджелудочной Ацинарных

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Выделение Мышиный клапана эндотелиальных клеток

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

A Standardized Method for the Analysis of Liver Sinusoidal Endothelial Cells and Their Fenestrations by Scanning Electron Microscopy

Стандартизованный метод для анализа печени Синусоидальная эндотелиальных клеток и их фенестраций по сканирующей электронной микроскопии

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Выделение и первичной культуре мышиных эндотелиальных клеток аорты

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells

Протокол для изоляции первичных гепатоцитов человека и соответствующие основные популяциями Non-паренхиматозных клеток печени

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic ...

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

Выделение мыши ишемическая эндотелиальных клеток

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...