Name: isolation and characterization of mouse primary liver sinusoidal endothelial cells
Uploaded: 2021-12-16T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells at JoVE.com

Detta arbete stöddes av National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases of the NIH (1RO1DK122948 to SHI) och NIH Silvio O. Conte Digestive Diseases Research Core Centers P30 bidragsmekanism (DK084567). Stöd gavs också till KF av Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) Overseas Research Fellowships. Vi vill också tacka Dr. Gregory J. Gores och Steven Bronk för deras ursprungliga design och optimering av kollagenasperfusionsapparaten.

Djurprotokoll genomfördes som godkänt av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) på Mayo Clinic. Åtta veckor gamla C57BL/6J hanmöss köptes från Jackson Laboratory. Möss var inrymda i en temperaturkontrollerad 12:12-h ljus-mörk cykelanläggning med fri tillgång till kost.
1. Beredning av kollagenbelagd odlingsskål eller tallrik
<ol><li>För att göra 50 ml 0,02 mol / L ättiksyra, tillsätt 0,6 ml isättika till 49,4 mlH2O.</li>
	<li>Gör 50 ...

<ol>
	<li>Morin, O., Goulet, F., Normand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+sinusoidal+endothelial+cells:+isolation,+purification,+characterization+and+interaction+with+hepatocytes.">Liver sinusoidal endothelial cells: isolation, purification, characterization and interaction with hepatocytes.</a> Revisiones Sobre Biologia Celular: RBC. 15, 1-85 (1988).</li><li>Ibrahim, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sinusoidal+endotheliopathy+in+nonalcoholic+steatohepatitis:+therapeutic+implications.">Sinusoidal endotheliopathy in nonalcoholic steatohepatitis: therapeutic implications.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 321 (1), 67-74 (2021).</li><li>Poisson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+sinusoidal+endothelial+cells:+Physiology+and+role+in+liver+diseases.">Liver sinusoidal endothelial cells: Physiology and role in liver diseases.</a> Journal of Hepatology. 66 (1), 212-227 (2017).</li><li>Marrone, G., Shah, V. H., Gracia-Sancho, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sinusoidal+communication+in+liver+fibrosis+and+regeneration.">Sinusoidal communication in liver fibrosis and regeneration.</a> Journal of Hepatology. 65 (3), 608-617 (2016).</li><li>Shetty, S., Lalor, P. F., Adams, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+sinusoidal+endothelial+cells+-+gatekeepers+of+hepatic+immunity.">Liver sinusoidal endothelial cells - gatekeepers of hepatic immunity.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. 15 (9), 555-567 (2018).</li><li>Smedsr&#248;d, B., Pertoft, H., Gustafson, S., Laurent, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scavenger+functions+of+the+liver+endothelial+cell.">Scavenger functions of the liver endothelial cell.</a> Biochemical Journal. 266 (2), 313-327 (1990).</li><li>DeLeve, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+sinusoidal+endothelial+cells+in+hepatic+fibrosis.">Liver sinusoidal endothelial cells in hepatic fibrosis.</a> Hepatology. 61 (5), 1740-1746 (2015).</li><li>Dar, W. A., Sullivan, E., Bynon, J. S., Eltzschig, H., Ju, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischaemia+reperfusion+injury+in+liver+transplantation:+Cellular+and+molecular+mechanisms.">Ischaemia reperfusion injury in liver transplantation: Cellular and molecular mechanisms.</a> Liver International. 39 (5), 788-801 (2019).</li><li>Furuta, K., Guo, Q., Hirsova, P., Ibrahim, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Roles+of+Liver+Sinusoidal+Endothelial+Cells+in+Nonalcoholic+Steatohepatitis.">Emerging Roles of Liver Sinusoidal Endothelial Cells in Nonalcoholic Steatohepatitis.</a> Biology. 9 (11), 395 (2020).</li><li>Wu, L. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+functional+differences+between+human+liver+cancer+endothelial+cells+and+liver+sinusoidal+endothelial+cells.">Phenotypic and functional differences between human liver cancer endothelial cells and liver sinusoidal endothelial cells.</a> Journal of Vascular Research. 45 (1), 78-86 (2008).</li><li>Meyer, J., Gonelle-Gispert, C., Morel, P., B&#252;hler, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+isolation+and+purification+of+murine+liver+sinusoidal+endothelial+cells:+A+systematic+review.">Methods for isolation and purification of murine liver sinusoidal endothelial cells: A systematic review.</a> PLoS One. 11 (3), 0151945 (2016).</li><li>Meyer, J., Lacotte, S., Morel, P., Gonelle-Gispert, C., Buhler, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+for+mouse+liver+sinusoidal+endothelial+cell+isolation.">An optimized method for mouse liver sinusoidal endothelial cell isolation.</a> Experimental Cell Research. 349 (2), 291-301 (2016).</li><li>Furuta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-induced+endothelial+vascular+cell+adhesion+molecule+1+promotes+nonalcoholic+steatohepatitis+pathogenesis.">Lipid-induced endothelial vascular cell adhesion molecule 1 promotes nonalcoholic steatohepatitis pathogenesis.</a> Journal of Clinical Investigation. 131 (6), (2021).</li><li>Guo, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+&#946;(1)-enriched+extracellular+vesicles+mediate+monocyte+adhesion+and+promote+liver+inflammation+in+murine+NASH.">Integrin &#946;(1)-enriched extracellular vesicles mediate monocyte adhesion and promote liver inflammation in murine NASH.</a> Journal of Hepatology. 71 (1), 1193-1205 (2019).</li><li>Hirsova, P., Ibrahim, S. H., Bronk, S. F., Yagita, H., Gores, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vismodegib+suppresses+TRAIL-mediated+liver+injury+in+a+mouse+model+of+nonalcoholic+steatohepatitis.">Vismodegib suppresses TRAIL-mediated liver injury in a mouse model of nonalcoholic steatohepatitis.</a> PLoS One. 8 (7), 70599 (2013).</li><li>Schrage, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+CD146+is+widely+expressed+on+endothelial+cells+and+is+recognized+by+the+monoclonal+antibody+ME-9F1.">Murine CD146 is widely expressed on endothelial cells and is recognized by the monoclonal antibody ME-9F1.</a> Histochemistry and Cell Biology. 129 (4), 441-451 (2008).</li><li>Olsavszky, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+transcriptomic+network+of+multi-ligand+scavenger+receptor+Stabilin-1-+and+Stabilin-2-deficient+liver+sinusoidal+endothelial+cells.">Exploring the transcriptomic network of multi-ligand scavenger receptor Stabilin-1- and Stabilin-2-deficient liver sinusoidal endothelial cells.</a> Gene. 768, 145284 (2021).</li><li>DeLeve, L. D., Maretti-Mira, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+sinusoidal+endothelial+cell:+An+update.">Liver sinusoidal endothelial cell: An update.</a> Seminars in Liver Disease. 37 (4), 377-387 (2017).</li><li>DeLeve, L. D., Wang, X., Hu, L., McCuskey, M. K., McCuskey, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+liver+sinusoidal+endothelial+cell+phenotype+is+maintained+by+paracrine+and+autocrine+regulation.">Rat liver sinusoidal endothelial cell phenotype is maintained by paracrine and autocrine regulation.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 287 (4), 757-763 (2004).</li><li>Cabral, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+hepatocytes+and+sinusoidal+endothelial+cells+from+mouse+liver+perfusion.">Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).</li><li>Ishiguro, K., Yan, I. K., Patel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+tissue+extracellular+vesicles+from+the+liver.">Isolation of tissue extracellular vesicles from the liver.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e58649 (2019).</li><li>Topp, S. A., Upadhya, G. A., Strasberg, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cold+preservation+of+isolated+sinusoidal+endothelial+cells+in+MMP+9+knockout+mice:+effect+on+morphology+and+platelet+adhesion.">Cold preservation of isolated sinusoidal endothelial cells in MMP 9 knockout mice: effect on morphology and platelet adhesion.</a> Liver Transplantation. 10 (8), 1041-1048 (2004).</li><li>Katz, S. C., Pillarisetty, V. G., Bleier, J. I., Shah, A. B., DeMatteo, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+sinusoidal+endothelial+cells+are+insufficient+to+activate+T+cells.">Liver sinusoidal endothelial cells are insufficient to activate T cells.</a> Journal of Immunology. 173 (1), 230-235 (2004).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+preparation+method+for+isolation+of+single-cell+types+from+mouse+liver+for+proteomic+studies.">Sample preparation method for isolation of single-cell types from mouse liver for proteomic studies.</a> Proteomics. 11 (17), 3556-3564 (2011).</li><li>Do, H., Healey, J. F., Waller, E. K., Lollar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+factor+VIII+by+murine+liver+sinusoidal+endothelial+cells.">Expression of factor VIII by murine liver sinusoidal endothelial cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (28), 19587-19592 (1999).</li><li>Schrage, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+T+cell+transmigration+across+the+murine+liver+sinusoidal+endothelium+is+mediated+by+transcytosis+and+surface+presentation+of+chemokines.">Enhanced T cell transmigration across the murine liver sinusoidal endothelium is mediated by transcytosis and surface presentation of chemokines.</a> Hepatology. 48 (4), 1262-1272 (2008).</li><li>Chou, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysophosphatidic+acid+alters+the+expression+profiles+of+angiogenic+factors,+cytokines,+and+chemokines+in+mouse+liver+sinusoidal+endothelial+cells.">Lysophosphatidic acid alters the expression profiles of angiogenic factors, cytokines, and chemokines in mouse liver sinusoidal endothelial cells.</a> PLoS One. 10 (3), 0122060 (2015).</li><li>Deleve, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dacarbazine+toxicity+in+murine+liver+cells:+a+model+of+hepatic+endothelial+injury+and+glutathione+defense.">Dacarbazine toxicity in murine liver cells: a model of hepatic endothelial injury and glutathione defense.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 268 (3), 1261-1270 (1994).</li><li>Smedsr&#248;d, B., Pertoft, H., Eggertsen, G., Sundstr&#246;m, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+morphological+characterization+of+cultures+of+Kupffer+cells+and+liver+endothelial+cells+prepared+by+means+of+density+separation+in+Percoll,+and+selective+substrate+adherence.">Functional and morphological characterization of cultures of Kupffer cells and liver endothelial cells prepared by means of density separation in Percoll, and selective substrate adherence.</a> Cell and Tissue Research. 241 (3), 639-649 (1985).</li><li>Despoix, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+CD146/MCAM+is+a+marker+of+natural+killer+cell+maturation.">Mouse CD146/MCAM is a marker of natural killer cell maturation.</a> European Journal of Immunology. 38 (10), 2855-2864 (2008).</li><li>Strauss, O., Phillips, A., Ruggiero, K., Bartlett, A., Dunbar, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+identifies+distinct+subsets+of+endothelial+cells+in+the+human+liver.">Immunofluorescence identifies distinct subsets of endothelial cells in the human liver.</a> Scientific Reports. 7, 44356 (2017).</li><li>Halpern, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paired-cell+sequencing+enables+spatial+gene+expression+mapping+of+liver+endothelial+cells.">Paired-cell sequencing enables spatial gene expression mapping of liver endothelial cells.</a> Nature Biotechnology. 36 (10), 962-970 (2018).</li></ol>

I det aktuella manuskriptet beskriver vi ett protokoll för LSEC-isolering från muslever bestående av tvåstegs kollagenasperfusion och efterföljande magnetisk aktiverad cellsortering (MACS). Detta protokoll består av följande tre steg: (1) Perfusion genom PV med en kalciumfri buffert följt av en kollagenasinnehållande buffert för att uppnå levercellsdispersion; (2) Uteslutning av hepatocyter med låghastighetscentrifugering. och (3) MACS-baserat positivt urval av LSECs från icke-föräldrarkymala celler (NPC) ...

Lever sinusformade endotelceller (LSECs) kantar leverns sinusoidväggar och är de vanligaste icke-parerenkymala cellerna i levern1. LSECs skiljer sig från andra kapillärendotelceller någon annanstans i kroppen genom närvaron av fenestrae och bristen på ett klassiskt basalmembran eller ett membran 2,3. Därför har LSECs distinkta fenotypiska och strukturella egenskaper som förbättrar deras permeabilitet och endocytiska kapacitet för att eliminera en mängd cirkulerande makromolekyler, inklusive lipider och lipoproteiner. LSECs spelar en central roll i överhörningen mellan parenkymala och icke-föräldrarkymala celler, såsom stellatceller och immunceller. LSECs är nyckeln till att upprätthålla leverhomeostas genom att hålla stellatcellerna och Kupffer-cellerna i vilande status4. LSECs modulerar sammansättningen av populationer av leverimmunceller genom att förmedla vidhäftning och transendotelmigration av cirkulerande leukocyter 5,6. Under akut och kronisk leverskada7, inklusive ischemi-reperfusionsskada (IRI)8, alkoholfri steatohepatit (NASH)9 och hepatocellulärt karcinom (HCC), genomgår LSECs fenotypiska förändringar som kallas kapillarisering kännetecknad av defenestration och bildning av basalmembran10. Dessa fenotypiska förändringar i LSECs är associerade med LSECs dysfunktion och förvärv av protrombotiska, proinflammatoriska och profibrogena egenskaper.
Flera metoder för isolering av LSECs från muslever har utvecklats11. Vissa tekniker är beroende av att separera icke-föräldrarkymala och parenkymala celler följt av densitetsgradientcentrifugering för att rena LSECc från icke-parenkymala fraktioner. Begränsningen av denna metod är förekomsten av förorenande makrofager i de sista stegen av LSECs isolering, vilket kan påverka renheten hos de isolerade LSECs12. Detta protokoll är baserat på kollagenasperfusion av muslevern och CD146+ magnetiska pärlor positivt urval av icke-föräldrarkymala celler för att rena LSECs. LSECs isolerade med denna metod visar hög renhet och bevarad morfologi och livskraft. Dessa LSECs är optimala för funktionella studier, inklusive permeabilitet och vidhäftningsanalys, samt nedströmsstudier för vägar av intresse. Dessutom, med det växande intresset för att generera stora dataset inom både klinisk forskning och upptäcktsvetenskap, kan dessa högkvalitativa LSECs isolerade från både friska och sjuka lever med alkoholfri steatohepatit (NASH) eller andra tillstånd slås samman eller användas individuellt, vilket möjliggör multi-omics datagenerering och jämförelse mellan hälsa och sjukdom13,14 . Dessutom kan de isolerade LSEC: erna användas för att utveckla tvådimensionella såväl som tredimensionella in vitro-modeller som organoider för att dechiffrera den aktiverade signalvägen i LSECs och deras intercellulära kommunikation med andra leverceller under olika skadliga stimuli och som svar på olika terapeutiska ingrepp.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2.0-inch 20 G Intra Venous (IV) catheter</td>
			<td>Terumo, SOmerset, NJ, USA</td>
			<td>SR-OX2051CA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#8211;3-inch perfuion tray with a hole in the center</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>customized; made in house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>405/520 viability dye</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-110-205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-inch regular curved dressing forceps</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>FS16-100-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-0 Perma-Hand silk suture</td>
			<td>Ethicon, Raritan, NJ, USA</td>
			<td>A182H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-stabilin-2 (Mouse) mAb-Alexa Fluor&#195; 488</td>
			<td>MBL International, Woburn, MA, USA</td>
			<td>D317-A48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA stock</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD146 (LSEC)-PE, anti-mouse</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-118-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD146 (LSEC) MicroBeads, mouse</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-092-007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD45-Viogreen, anti-mouse</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-110-803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen type I</td>
			<td>Corning, Corning, NY, USA</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase II</td>
			<td>Gibco, Waltham, MA, USA</td>
			<td>17101-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial cells growth medium</td>
			<td>ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>211-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FcR blocking reagent, mouse</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-092-575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo software, version 10.6</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardened Fine scissors</td>
			<td>F.S.T, Foster city, CA, USA</td>
			<td>14091-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated (37 &#176;C) and humidified recirculating perfusion apparatus equipped with Oxygen injection at a rate of 10psi.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>customized; made in house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hitachi S 4700 scanning electron microscope</td>
			<td>Hitachi Inc, Pleasanton, CA, USA</td>
			<td>SEM096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS columns</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS pre-separation filters (70 &#956;m)</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-095-823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS rinsing buffer</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-091-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Smart Strainer (70 &#956;m)</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-098-462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACSQunt flow cytometer</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell Cell Culture Insert</td>
			<td>Millipore Sigma, Burlington, MA, USA</td>
			<td>PITP01250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nexcelom cell counter</td>
			<td>Nexcelom bioscience, Lawrence, MA, USA</td>
			<td>Cellometer Auto T4 Plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare, Chicago, IL, USA</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>F.S.T, Foster city, CA, USA</td>
			<td>14001-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Very small curved dressing forceps</td>
			<td>F.S.T, Foster city, CA, USA</td>
			<td>11063-07</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of mouse primary liver sinusoidal endothelial cells

Lever sinusformade endotelceller (LSECs) är specialiserade endotelceller belägna vid gränssnittet mellan cirkulationen och leverparenkymen. LSC har en distinkt morfologi som kännetecknas av närvaron av fenestrae och frånvaron av basalmembran. LSECs spelar viktiga roller i många patologiska störningar i levern, inklusive metabolisk dysregulering, inflammation, fibros, angiogenes och cancerframkallande. Lite har dock publicerats om isoleringen och karakteriseringen av LSECs. Här diskuterar detta protokoll isoleringen av LSEC från både friska och alkoholfria fettleversjukdomar (NAFLD) möss. Protokollet är baserat på kollagenasperfusion av muslevern och magnetiska pärlor positivt urval av icke-föräldrarkymala celler för att rena LSECC. Denna studie karakteriserar LSECs med hjälp av specifika markörer genom flödescytometri och identifierar de karakteristiska fenotypiska egenskaperna genom att skanna elektronmikroskopi. LSECs isolerade enligt detta protokoll kan användas för funktionella studier, inklusive vidhäftnings- och permeabilitetsanalyser, samt nedströmsstudier för en viss väg av intresse. Dessutom kan dessa LSECs poolas eller användas individuellt, vilket möjliggör multi-omics datagenerering inklusive RNA-seq bulk eller single cell, proteomic eller phospho-proteomics, och Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing (ATAC-seq), bland andra. Detta protokoll kommer att vara användbart för utredare som studerar LSECs kommunikation med andra leverceller i hälsa och sjukdom och möjliggöra en fördjupad förståelse av LSECs roll i de patogena mekanismerna för akut och kronisk leverskada.

Experimentella scheman och utrustning som ställs in: I detta protokoll smältes muslever med hjälp av en sluten perfusionskrets, sedan separerades icke-föräldrarkymala celler och hepatocyter genom centrifugering med låg hastighet vid 50 x g i 2 minuter. Primära LSECs isolerades med användning av CD146 magnetiska pärlor urval från den icke-parerkymala fraktionen. De experimentella scheman visas i figur 1A. Kanylen placerades genom PV medan den underlägsn...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells at JoVE.com

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

Här beskriver och demonstrerar vi ett protokoll för primär muslever sinusformad endotelcell (LSEC) isolering. Protokollet är baserat på leverkollagenasperfusion, icke-parerkymal cellrening genom låghastighetscentrifugering och CD146 magnetiskt pärlval. Vi fenotypar och karakteriserar också dessa isolerade LSECs med hjälp av flödescytometri och svepelektronmikroskopi.

Isolering och karakterisering av mus primära lever sinusformade endotelceller

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...

Här demonstrerar vi vårt protokoll för primär muslever sinusformad cellisolering eller LSECs isolering. Protokollet består av leverkollagenasperfusion och ultracentrifugering med låg hastighet för icke-parenkymal cellrening och CD146 magnetiskt pärlval. Vår LSEC-isoleringsmetod är mycket effektiv och tillämplig på frisk och sjuk muslever.De isolerade LSEC: erna visar hög renhet och bevarar strukturen och funktionen. LSECs isolerade med hjälp av detta protokoll är optimala för funktionella och molekylära studier och multi-omics datagenerering. Detta protokoll kommer att vara till hjälp för att studera intercellulär kommunikation i levern.Börja med att belägga 10 centimeter kulturrätter med tre milliliter kollagenlösning. Inkubera sedan diskarna vid rumstemperatur i en timme. Efter en timme, ta bort överskottsvätskan från den belagda ytan.Tvätta diskarna med PBS tre gånger och låt dem lufttorka. Ställ in den uppvärmda och fuktade återcirkulerande perfusionsapparaten. Skölj perfusionssystemet med 10% blekmedel i fem minuter.Skölj sedan systemet igen med sterilt vatten i ytterligare 10 minuter. Töm sköljvätskan så mycket som möjligt innan du perfuserar med kollagenaslösning. Infusera kollagenaslösningen genom perfusionssystemet för att förvärma den till 37 grader Celsius.Ställ in pumphastigheten på hastighet ett på kortkontrollratten. Håll hastigheten densamma under hela proceduren. Väg musen för proceduren.Fäst den sedan på den kirurgiska ytan. Spraya musbuken med 70%etanol. Använd kirurgisk sax, gör ett snitt på cirka fem centimeter från underdelen av buken upp till xiphoidprocessen.Därefter gör du två laterala snitt med en liten irissax på varje sida av buken för att exponera bukorganen helt. Placera manteln på IV-katetern under djurets rygg för att lyfta och jämna buken. Använd en vanlig krökt dressing pincett, dra försiktigt tarmarna och magen av till vänster om djuret.Placera sedan en 5-0 kirurgisk sutur under den underlägsna vena cava, eller IVC, strax under den exponerade vänstra njuren. Bind en lös hitch i suturen. Placera sedan en annan 5-0 kirurgisk sutur runt leverportalvenen.Placera suturen strax ovanför den mjältevens förgreningspunkt i leverportalvenen. Återigen, knyt en lös hitch i suturen. Använd portalvensuturen som spänning, sätt in den 20-gauge IV-katetern i leverportalvenen en centimeter nedanför där den grenar sig till höger och vänster leverportalven.Skjut sedan katetern upp i venen, men håll den under förgreningsområdet. Låt blodet färdas ner i katetern tills det börjar droppa ut. Säkra IV-katetern med portalvensuturen.Använd en IV-linje för att fästa en IV-flaska med buffert A på katetern. Spola sedan levern med denna lösning samtidigt som du undviker luftinträde i systemet. Bind av suturen runt IVC under njurarna.Skär sedan IVC under suturen så att djuret kan blöda ut. När du har perfuserat, skär bort magen, tarmarna, mjälten och andra ingångar som är fästa vid levern. Skär sedan bort membranet och de stora kärlen från brösthålan.Ta bort levern från djuret och placera den på perfusionsbrickan. Ta försiktigt bort IV-linjen och anslut kollagenaslösningen i recirkulerande kammare. Låt levern perfusera tills kapseln blir modellerad och verkar grumlig.Detta bör vanligtvis ta 10 till 15 minuter. När du har smält, ta bort levern från kammaren och lägg den på en 10-centimeter petriskål med cirka 20 ml serumfri DMEM. Plocka försiktigt isär levern med ett par pipettspetsar och kasta gallträdet.Därefter filtrera leversuspensionen genom en 70-mikrometer cellsil i ett 50-milliliter koniskt rör. Centrifugera cellsuspensionen vid 50 gånger G i två minuter vid rumstemperatur. Samla sedan supernatanten som innehåller icke-parenkymala leverceller.Centrifugera supernatanten vid 300 gånger G i fem minuter vid fyra grader Celsius. Därefter samla cellpelleten och resuspendera den i en milliliter isoleringsbuffert. Bestäm cellnumret med en automatisk cellräknare enligt tillverkarens instruktioner.Därefter centrifugera cellsuspensionen. Aspirera supernatanten helt och hållet och återsuspendera pelletsen med 90 mikroliter isoleringsbuffert per 10 miljoner celler. Lägg till 10 mikroliter CD146 MicroBeads per 10 miljoner totala celler.Blanda det väl och inkubera i 15 minuter vid fyra grader Celsius. För att tvätta cellerna, lägg till en till två milliliter isoleringsbuffert per 10 miljoner celler. Centrifugera lösningen vid 300 gånger G i 10 minuter.Därefter aspirera supernatanten helt och resuspendera upp till en miljard celler i 500 mikroliter isoleringsbuffert. Förbered sedan separationskolonnen genom att skölja den med tre milliliter isoleringsbuffert. Applicera cellsuspensionen på kolonnen staplad med 70 mikrometer förseparationsfilter.Tvätta kolonnen med tre milliliter isoleringsbuffert tre gånger. Ta sedan bort kolonnen från separatorn och placera den på ett 15 ml centrifugrör. Pipettera fem milliliter isoleringsbuffert på kolonnen.För att återställa de magnetiska pärlmärkta cellerna, tryck kolven ordentligt in i kolonnen för att spola ut cellerna. Slutligen centrifugera cellerna vid 300 gånger G i fem minuter vid fyra grader Celsius. Isolerade LSECs renhet och ytmarkörer bedömdes med flödescytometri.Dataanalys och grindstrategi för gated LSECs och singlets baseras på framåtriktade spridnings- och sidospridningsdata. Isolerade LSECs färgades med ett viabilitetsfärgämne och en kombination av CD45-, CD146- och Stabilin-2-antikroppar. Livskraftiga LSECs gated på CD45 negativ population och analyserades för CD146 och Stabilin-2 uttryck.Från dessa data bekräftades att de isolerade LSEC: erna hade större än 94% livskraft och större än 90% renhet. Den LSEC-specifika fenotypen hos de isolerade cellerna bekräftades ytterligare med hjälp av ljusmikroskopi och svepelektronmikroskopi. Isolerade LSECs odlades i hela tillväxtmediet i sex timmar och undersöktes med ljusmikroskopi.De vita pilarna i SEM-bilden indikerar LSEC fenestrae, vilket är ett karakteristiskt morfologiskt drag hos LSEC. De kritiska stegen för att säkerställa fullständig perfusion av en levervävnad är korrekt kateterbandspositionering, undvikande av införande av luft i katetern och optimal tidpunkt för kollagenas matsmältning. Högkvalitativ LSEC förvärvad med hjälp av vårt protokoll kommer att underlätta identifieringen av den molekylära mekanismen för LSEC-funktionen och kommer att förbättra vår förståelse för deras roll i intercellulär kommunikation i levern, i hälsa och i sjukdom.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Isolering av valvulär endotelceller

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Isolation &#38; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Isolation & Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Isolering och karakterisering av Hoechst Låg CD45 Negativa Mus Lung mesenkymala stamceller

Tissue resident mesenchymal stem cells (MSC) are important regulators of tissue repair or regeneration, fibrosis, inflammation, angiogenesis and tumor ...

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

Isolering av primära celler Mus trofoblaster och trofoblaster Invasion Assay

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Isolering av embryonala Ventrikulära Endotelceller

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Isolering och odling av mus Primära bukspottkörtel Acinar

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Isolering av murint Ventil Endotelceller

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

A Standardized Method for the Analysis of Liver Sinusoidal Endothelial Cells and Their Fenestrations by Scanning Electron Microscopy

En standardiserad metod för analys av lever Sinusformig endotelceller och deras fenestrationer genom svepelektronmikroskopi

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolering och Primär kultur av mus aortaendotelceller

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells

Protokoll för isolering av primära humana hepatocyter och Motsvarande Större populationer av icke-parenkymala leverceller

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic ...

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

Isolering av mus koronära endotelceller

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...