Name: isolation and characterization of mouse primary liver sinusoidal endothelial cells
Uploaded: 2021-12-16T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells at JoVE.com

Bu çalışma, NIH Ulusal Diyabet ve Sindirim ve Böbrek Hastalıkları Enstitüsü (1RO1DK122948'den SHI'ye) ve NIH Silvio O. Conte Sindirim Hastalıkları Araştırma Çekirdek Merkezleri P30 hibe mekanizması (DK084567) tarafından desteklenmiştir. Japonya Bilimi Geliştirme Derneği (JSPS) Denizaşırı Araştırma Bursu tarafından KF'ye de destek sağlandı. Ayrıca Dr. Gregory J. Gores ve Steven Bronk'a kollajenaz perfüzyon aparatının orijinal tasarımı ve optimizasyonu için teşekkür ederiz.

Hayvan protokolleri, Mayo Clinic'in Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylandığı şekilde yürütülmüştür. Jackson Laboratuvarı'ndan sekiz haftalık C57BL/6J erkek fareler satın alındı. Fareler, diyete ücretsiz erişimi olan sıcaklık kontrollü 12: 12 saatlik bir aydınlık-karanlık döngü tesisinde barındırıldı.
1. Kollajen kaplı kültür tabağı veya tabağının hazırlanması
<ol><li>50 mL 0.02 mol / L asetik asit...

<ol>
	<li>Morin, O., Goulet, F., Normand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+sinusoidal+endothelial+cells:+isolation,+purification,+characterization+and+interaction+with+hepatocytes.">Liver sinusoidal endothelial cells: isolation, purification, characterization and interaction with hepatocytes.</a> Revisiones Sobre Biologia Celular: RBC. 15, 1-85 (1988).</li><li>Ibrahim, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sinusoidal+endotheliopathy+in+nonalcoholic+steatohepatitis:+therapeutic+implications.">Sinusoidal endotheliopathy in nonalcoholic steatohepatitis: therapeutic implications.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 321 (1), 67-74 (2021).</li><li>Poisson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+sinusoidal+endothelial+cells:+Physiology+and+role+in+liver+diseases.">Liver sinusoidal endothelial cells: Physiology and role in liver diseases.</a> Journal of Hepatology. 66 (1), 212-227 (2017).</li><li>Marrone, G., Shah, V. H., Gracia-Sancho, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sinusoidal+communication+in+liver+fibrosis+and+regeneration.">Sinusoidal communication in liver fibrosis and regeneration.</a> Journal of Hepatology. 65 (3), 608-617 (2016).</li><li>Shetty, S., Lalor, P. F., Adams, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+sinusoidal+endothelial+cells+-+gatekeepers+of+hepatic+immunity.">Liver sinusoidal endothelial cells - gatekeepers of hepatic immunity.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. 15 (9), 555-567 (2018).</li><li>Smedsr&#248;d, B., Pertoft, H., Gustafson, S., Laurent, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scavenger+functions+of+the+liver+endothelial+cell.">Scavenger functions of the liver endothelial cell.</a> Biochemical Journal. 266 (2), 313-327 (1990).</li><li>DeLeve, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+sinusoidal+endothelial+cells+in+hepatic+fibrosis.">Liver sinusoidal endothelial cells in hepatic fibrosis.</a> Hepatology. 61 (5), 1740-1746 (2015).</li><li>Dar, W. A., Sullivan, E., Bynon, J. S., Eltzschig, H., Ju, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischaemia+reperfusion+injury+in+liver+transplantation:+Cellular+and+molecular+mechanisms.">Ischaemia reperfusion injury in liver transplantation: Cellular and molecular mechanisms.</a> Liver International. 39 (5), 788-801 (2019).</li><li>Furuta, K., Guo, Q., Hirsova, P., Ibrahim, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Roles+of+Liver+Sinusoidal+Endothelial+Cells+in+Nonalcoholic+Steatohepatitis.">Emerging Roles of Liver Sinusoidal Endothelial Cells in Nonalcoholic Steatohepatitis.</a> Biology. 9 (11), 395 (2020).</li><li>Wu, L. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+functional+differences+between+human+liver+cancer+endothelial+cells+and+liver+sinusoidal+endothelial+cells.">Phenotypic and functional differences between human liver cancer endothelial cells and liver sinusoidal endothelial cells.</a> Journal of Vascular Research. 45 (1), 78-86 (2008).</li><li>Meyer, J., Gonelle-Gispert, C., Morel, P., B&#252;hler, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+isolation+and+purification+of+murine+liver+sinusoidal+endothelial+cells:+A+systematic+review.">Methods for isolation and purification of murine liver sinusoidal endothelial cells: A systematic review.</a> PLoS One. 11 (3), 0151945 (2016).</li><li>Meyer, J., Lacotte, S., Morel, P., Gonelle-Gispert, C., Buhler, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+for+mouse+liver+sinusoidal+endothelial+cell+isolation.">An optimized method for mouse liver sinusoidal endothelial cell isolation.</a> Experimental Cell Research. 349 (2), 291-301 (2016).</li><li>Furuta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-induced+endothelial+vascular+cell+adhesion+molecule+1+promotes+nonalcoholic+steatohepatitis+pathogenesis.">Lipid-induced endothelial vascular cell adhesion molecule 1 promotes nonalcoholic steatohepatitis pathogenesis.</a> Journal of Clinical Investigation. 131 (6), (2021).</li><li>Guo, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+&#946;(1)-enriched+extracellular+vesicles+mediate+monocyte+adhesion+and+promote+liver+inflammation+in+murine+NASH.">Integrin &#946;(1)-enriched extracellular vesicles mediate monocyte adhesion and promote liver inflammation in murine NASH.</a> Journal of Hepatology. 71 (1), 1193-1205 (2019).</li><li>Hirsova, P., Ibrahim, S. H., Bronk, S. F., Yagita, H., Gores, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vismodegib+suppresses+TRAIL-mediated+liver+injury+in+a+mouse+model+of+nonalcoholic+steatohepatitis.">Vismodegib suppresses TRAIL-mediated liver injury in a mouse model of nonalcoholic steatohepatitis.</a> PLoS One. 8 (7), 70599 (2013).</li><li>Schrage, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+CD146+is+widely+expressed+on+endothelial+cells+and+is+recognized+by+the+monoclonal+antibody+ME-9F1.">Murine CD146 is widely expressed on endothelial cells and is recognized by the monoclonal antibody ME-9F1.</a> Histochemistry and Cell Biology. 129 (4), 441-451 (2008).</li><li>Olsavszky, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+transcriptomic+network+of+multi-ligand+scavenger+receptor+Stabilin-1-+and+Stabilin-2-deficient+liver+sinusoidal+endothelial+cells.">Exploring the transcriptomic network of multi-ligand scavenger receptor Stabilin-1- and Stabilin-2-deficient liver sinusoidal endothelial cells.</a> Gene. 768, 145284 (2021).</li><li>DeLeve, L. D., Maretti-Mira, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+sinusoidal+endothelial+cell:+An+update.">Liver sinusoidal endothelial cell: An update.</a> Seminars in Liver Disease. 37 (4), 377-387 (2017).</li><li>DeLeve, L. D., Wang, X., Hu, L., McCuskey, M. K., McCuskey, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+liver+sinusoidal+endothelial+cell+phenotype+is+maintained+by+paracrine+and+autocrine+regulation.">Rat liver sinusoidal endothelial cell phenotype is maintained by paracrine and autocrine regulation.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 287 (4), 757-763 (2004).</li><li>Cabral, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+hepatocytes+and+sinusoidal+endothelial+cells+from+mouse+liver+perfusion.">Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).</li><li>Ishiguro, K., Yan, I. K., Patel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+tissue+extracellular+vesicles+from+the+liver.">Isolation of tissue extracellular vesicles from the liver.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e58649 (2019).</li><li>Topp, S. A., Upadhya, G. A., Strasberg, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cold+preservation+of+isolated+sinusoidal+endothelial+cells+in+MMP+9+knockout+mice:+effect+on+morphology+and+platelet+adhesion.">Cold preservation of isolated sinusoidal endothelial cells in MMP 9 knockout mice: effect on morphology and platelet adhesion.</a> Liver Transplantation. 10 (8), 1041-1048 (2004).</li><li>Katz, S. C., Pillarisetty, V. G., Bleier, J. I., Shah, A. B., DeMatteo, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+sinusoidal+endothelial+cells+are+insufficient+to+activate+T+cells.">Liver sinusoidal endothelial cells are insufficient to activate T cells.</a> Journal of Immunology. 173 (1), 230-235 (2004).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+preparation+method+for+isolation+of+single-cell+types+from+mouse+liver+for+proteomic+studies.">Sample preparation method for isolation of single-cell types from mouse liver for proteomic studies.</a> Proteomics. 11 (17), 3556-3564 (2011).</li><li>Do, H., Healey, J. F., Waller, E. K., Lollar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+factor+VIII+by+murine+liver+sinusoidal+endothelial+cells.">Expression of factor VIII by murine liver sinusoidal endothelial cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (28), 19587-19592 (1999).</li><li>Schrage, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+T+cell+transmigration+across+the+murine+liver+sinusoidal+endothelium+is+mediated+by+transcytosis+and+surface+presentation+of+chemokines.">Enhanced T cell transmigration across the murine liver sinusoidal endothelium is mediated by transcytosis and surface presentation of chemokines.</a> Hepatology. 48 (4), 1262-1272 (2008).</li><li>Chou, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysophosphatidic+acid+alters+the+expression+profiles+of+angiogenic+factors,+cytokines,+and+chemokines+in+mouse+liver+sinusoidal+endothelial+cells.">Lysophosphatidic acid alters the expression profiles of angiogenic factors, cytokines, and chemokines in mouse liver sinusoidal endothelial cells.</a> PLoS One. 10 (3), 0122060 (2015).</li><li>Deleve, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dacarbazine+toxicity+in+murine+liver+cells:+a+model+of+hepatic+endothelial+injury+and+glutathione+defense.">Dacarbazine toxicity in murine liver cells: a model of hepatic endothelial injury and glutathione defense.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 268 (3), 1261-1270 (1994).</li><li>Smedsr&#248;d, B., Pertoft, H., Eggertsen, G., Sundstr&#246;m, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+morphological+characterization+of+cultures+of+Kupffer+cells+and+liver+endothelial+cells+prepared+by+means+of+density+separation+in+Percoll,+and+selective+substrate+adherence.">Functional and morphological characterization of cultures of Kupffer cells and liver endothelial cells prepared by means of density separation in Percoll, and selective substrate adherence.</a> Cell and Tissue Research. 241 (3), 639-649 (1985).</li><li>Despoix, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+CD146/MCAM+is+a+marker+of+natural+killer+cell+maturation.">Mouse CD146/MCAM is a marker of natural killer cell maturation.</a> European Journal of Immunology. 38 (10), 2855-2864 (2008).</li><li>Strauss, O., Phillips, A., Ruggiero, K., Bartlett, A., Dunbar, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+identifies+distinct+subsets+of+endothelial+cells+in+the+human+liver.">Immunofluorescence identifies distinct subsets of endothelial cells in the human liver.</a> Scientific Reports. 7, 44356 (2017).</li><li>Halpern, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paired-cell+sequencing+enables+spatial+gene+expression+mapping+of+liver+endothelial+cells.">Paired-cell sequencing enables spatial gene expression mapping of liver endothelial cells.</a> Nature Biotechnology. 36 (10), 962-970 (2018).</li></ol>

Bu makalede, iki aşamalı kollajenaz perfüzyonu ve ardından manyetik aktive hücre sıralamadan (MACS) oluşan fare karaciğerinden LSEC izolasyonu için bir protokol açıklanmaktadır. Bu protokol aşağıdaki üç adımdan oluşur: (1) Karaciğer hücresi dispersiyonunu sağlamak için kalsiyum içermeyen bir tampon ile PV yoluyla perfüzyon ve ardından kollajenaz içeren bir tampon; (2) Düşük hızlı santrifüjleme ile hepatositlerin dışlanması; ve (3) anti-CD146 manyetik boncuklar kullanarak parankimal olm...

Karaciğer sinüzoidal endotel hücreleri (LSEC'ler) hepatik sinüzoid duvarları kaplar ve karaciğerde en bol bulunan parankimal olmayan hücrelerdir1. LSEC'ler, vücudun başka yerlerindeki diğer kılcal endotel hücrelerinden fenestra varlığı ve klasik bir bazal membran veya diyaframeksikliği ile ayırt edilir 2,3. Bu nedenle, LSEC'ler, lipitler ve lipoproteinler de dahil olmak üzere çeşitli dolaşımdaki makromolekülleri ortadan kaldırmak için geçirgenliklerini ve endositik kapasitelerini artıran ayırt edici fenotipik ve yapısal özelliklere sahiptir. LSEC'ler, yıldız hücreleri ve bağışıklık hücreleri gibi parankimal ve parankimal olmayan hücreler arasındaki çapraz konuşmada çok önemli bir rol oynar. LSEC'ler, yıldız hücrelerini ve Kupffer hücrelerini sessiz bir durumda tutarak karaciğer homeostazını korumada anahtardır4. LSEC'ler, dolaşımdaki lökositlerin adezyona ve transendotel göçüne aracılık ederek hepatik immün hücre popülasyonlarının bileşimini modüle eder 5,6. İskemi-reperfüzyon hasarı (IRI)8, alkolsüz steatohepatit (NASH)9 ve hepatosellüler karsinom (HCC) dahil olmak üzere akut ve kronik karaciğer hasarı7 sırasında, LSEC'ler defenestrasyon ve bazal membran oluşumu ile karakterize kapillarizasyon olarak bilinen fenotipik değişikliklere uğrar10. LSEC'lerdeki bu fenotipik değişiklikler, LSEC'lerin disfonksiyonu ve protrombotik, proenflamatuar ve profibrojenik özelliklerin kazanılması ile ilişkilidir.
LSEC'lerin fare karaciğerinden izolasyonu için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir11. Bazı teknikler, parankimal olmayan ve parankimal hücrelerin ayrılmasına ve ardından LSEC'leri parankimal olmayan fraksiyonlardan arındırmak için yoğunluk gradyanı santrifüjlenmesine bağlıdır. Bu yöntemin sınırlaması, LSEC'lerin izolasyonunun son adımlarında kirletici makrofajların varlığıdır ve bu da izole edilmiş LSEC'lerin saflığını etkileyebilir12. Bu protokol, fare karaciğerinin kollajenaz perfüzyonuna ve LSEC'leri saflaştırmak için CD146 + manyetik boncukların parankimal olmayan hücrelerin pozitif seçimine dayanmaktadır. Bu yöntem kullanılarak izole edilen LSEC'ler yüksek saflık ve korunmuş morfoloji ve canlılık gösterir. Bu LSEC'ler, geçirgenlik ve adezyon testi de dahil olmak üzere fonksiyonel çalışmaların yanı sıra ilgilenilen yollar için aşağı akış çalışmaları için de optimumdur. Dahası, hem klinik araştırma hem de keşif biliminde büyük veri kümeleri oluşturmaya olan ilginin artmasıyla birlikte, alkolsüz steatohepatit (NASH) veya diğer koşullara sahip hem sağlıklı hem de hastalıklı karaciğerlerden izole edilen bu yüksek kaliteli LSEC'ler, çoklu omik veri üretimine ve sağlık ile hastalık arasında karşılaştırmaya izin vererek ayrı ayrı toplanabilir veyakullanılabilir13,14 . Ek olarak, izole LSEC'ler, LSEC'lerdeki aktif sinyal yolunu ve farklı zararlı uyaranlar altında ve çeşitli terapötik müdahalelere yanıt olarak diğer karaciğer hücreleriyle hücresel iletişimlerini deşifre etmek için organoidler gibi iki boyutlu ve üç boyutlu in vitro modeller geliştirmek için kullanılabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2.0-inch 20 G Intra Venous (IV) catheter</td>
			<td>Terumo, SOmerset, NJ, USA</td>
			<td>SR-OX2051CA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#8211;3-inch perfuion tray with a hole in the center</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>customized; made in house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>405/520 viability dye</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-110-205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-inch regular curved dressing forceps</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>FS16-100-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-0 Perma-Hand silk suture</td>
			<td>Ethicon, Raritan, NJ, USA</td>
			<td>A182H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-stabilin-2 (Mouse) mAb-Alexa Fluor&#195; 488</td>
			<td>MBL International, Woburn, MA, USA</td>
			<td>D317-A48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA stock</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD146 (LSEC)-PE, anti-mouse</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-118-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD146 (LSEC) MicroBeads, mouse</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-092-007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD45-Viogreen, anti-mouse</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-110-803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen type I</td>
			<td>Corning, Corning, NY, USA</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase II</td>
			<td>Gibco, Waltham, MA, USA</td>
			<td>17101-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial cells growth medium</td>
			<td>ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>211-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FcR blocking reagent, mouse</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-092-575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo software, version 10.6</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardened Fine scissors</td>
			<td>F.S.T, Foster city, CA, USA</td>
			<td>14091-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated (37 &#176;C) and humidified recirculating perfusion apparatus equipped with Oxygen injection at a rate of 10psi.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>customized; made in house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hitachi S 4700 scanning electron microscope</td>
			<td>Hitachi Inc, Pleasanton, CA, USA</td>
			<td>SEM096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS columns</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS pre-separation filters (70 &#956;m)</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-095-823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS rinsing buffer</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-091-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Smart Strainer (70 &#956;m)</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-098-462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACSQunt flow cytometer</td>
			<td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell Cell Culture Insert</td>
			<td>Millipore Sigma, Burlington, MA, USA</td>
			<td>PITP01250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nexcelom cell counter</td>
			<td>Nexcelom bioscience, Lawrence, MA, USA</td>
			<td>Cellometer Auto T4 Plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare, Chicago, IL, USA</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>F.S.T, Foster city, CA, USA</td>
			<td>14001-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Very small curved dressing forceps</td>
			<td>F.S.T, Foster city, CA, USA</td>
			<td>11063-07</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of mouse primary liver sinusoidal endothelial cells

Karaciğer sinüzoidal endotel hücreleri (LSEC'ler), dolaşım ve karaciğer parankimi arasındaki arayüzde yer alan özelleşmiş endotel hücreleridir. LSEC'ler, fenestra varlığı ve bazal membranın yokluğu ile karakterize edilen farklı bir morfolojiye sahiptir. LSEC'ler, metabolik disregülasyon, inflamasyon, fibroz, anjiyogenez ve karsinogenez dahil olmak üzere karaciğerdeki birçok patolojik bozuklukta önemli rol oynamaktadır. Bununla birlikte, LSEC'lerin izolasyonu ve karakterizasyonu hakkında çok az şey yayınlanmıştır. Burada, bu protokol LSEC'in hem sağlıklı hem de alkolsüz yağlı karaciğer hastalığı (NAFLD) farelerinden izolasyonunu tartışmaktadır. Protokol, fare karaciğerinin kollajenaz perfüzyonuna ve LSEC'leri saflaştırmak için manyetik boncukların parankimal olmayan hücrelerin pozitif seçimine dayanmaktadır. Bu çalışma, akış sitometrisi ile spesifik belirteçler kullanarak LSEC'leri karakterize eder ve elektron mikroskobu taraması ile karakteristik fenotipik özellikleri tanımlar. Bu protokolü takiben izole edilen LSEC'ler, yapışma ve geçirgenlik testleri de dahil olmak üzere fonksiyonel çalışmaların yanı sıra belirli bir ilgi yolu için aşağı akış çalışmaları için kullanılabilir. Ek olarak, bu LSEC'ler ayrı ayrı havuzlanabilir veya kullanılabilir, RNA-seq kütlesi veya tek hücreli, proteomik veya fosfo-proteomik ve diğerlerinin yanı sıra dizileme (ATAC-seq) kullanarak Transpozaz-Erişilebilir Kromatin Testi dahil olmak üzere multi-omik veri üretimine izin verir. Bu protokol, LSEC'lerin sağlık ve hastalıktaki diğer karaciğer hücreleri ile iletişimini inceleyen araştırmacılar için yararlı olacak ve LSEC'lerin akut ve kronik karaciğer hasarının patojenik mekanizmalarındaki rolünün derinlemesine anlaşılmasını sağlayacaktır.

Deneysel şemalar ve ekipman kurulumu: Bu protokolde, fare karaciğeri kapalı bir perfüzyon devresi kullanılarak sindirildi, daha sonra parankimal olmayan hücreler ve hepatositler 2 dakika boyunca 50 x g'de düşük hızlı santrifüjleme ile ayrıldı. Primer LSEC'ler parankimal olmayan fraksiyondan CD146 manyetik boncuk seçimi kullanılarak izole edildi. Deneysel şemalar Şekil 1A'da gösterilmiştir. Kanül PV yoluyla yerleştirilirken, inferior vena kav...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells at JoVE.com

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

Burada primer fare karaciğeri sinüzoidal endotel hücresi (LSEC) izolasyonu için bir protokol özetlenmekte ve gösterilmektedir. Protokol, karaciğer kollajenaz perfüzyonu, düşük hızlı santrifüjleme ile parankimal olmayan hücre saflaştırılması ve CD146 manyetik boncuk seçimine dayanmaktadır. Ayrıca bu izole LSEC'leri akış sitometrisi ve taramalı elektron mikroskobu kullanarak fenotipler ve karakterize ediyoruz.

Fare primer karaciğer sinüzoidal endotel hücrelerinin izolasyonu ve karakterizasyonu

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...

Burada, primer fare karaciğeri sinüzoidal hücre izolasyonu veya LSECs izolasyonu protokolümüzü gösteriyoruz. Protokol, karaciğer kollajenaz perfüzyonu ve parankimal olmayan hücre saflaştırması ve CD146 manyetik boncuk seçimi için düşük hızlı ultrasantrifüjlemeden oluşur. LSEC izolasyon yöntemimiz oldukça verimlidir ve sağlıklı ve hastalıklı fare karaciğerine uygulanabilir.İzole edilmiş LSEC'ler yüksek saflık gösterir ve yapıyı ve işlevi korur. Bu protokol kullanılarak izole edilen LSEC'ler, fonksiyonel ve moleküler çalışmalar ve multi-omik veri üretimi için optimumdur. Bu protokol, karaciğerdeki hücreler arası iletişimi incelemek için yararlı olacaktır.10 santimetrelik kültür tabaklarını üç mililitre kollajen çözeltisi ile kaplayarak başlayın. Ardından, bulaşıkları oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. Bir saat sonra, fazla sıvıyı kaplanmış yüzeyden çıkarın.Bulaşıkları PBS ile üç kez yıkayın ve havayla kurumasını bekleyin. Isıtmalı ve nemlendirilmiş devridaim perfüzyon aparatını kurun. Perfüzyon sistemini beş dakika boyunca% 10 ağartıcı kullanarak durulayın.Ardından, sistemi 10 dakika daha steril suyla tekrar durulayın. Kollajenaz çözeltisi ile perfüze etmeden önce durulama sıvısını mümkün olduğunca boşaltın. Kollajenaz çözeltisini perfüzyon sisteminden geçirerek 37 santigrat dereceye kadar ısıtın.Pompa hızını, hız kontrol kadranındaki bir hızı olacak şekilde ayarlayın. Tüm prosedür boyunca hızı aynı tutun. İşlem için fareyi tartın.Daha sonra cerrahi yüzeye sabitleyin. Fare karnına% 70 etanol püskürtün. Cerrahi makas kullanarak, karnın alt kısmından başlayarak ksifoid sürece kadar yaklaşık beş santimetrelik bir kesi yapın.Bundan sonra, karın organlarını tamamen ortaya çıkarmak için karnın her iki tarafında küçük iris makası kullanarak iki yanal kesim yapın. Karnı kaldırmak ve düzleştirmek için IV kateterin kılıfını hayvanın sırtının altına yerleştirin. Düzenli bir kavisli pansuman forseps kullanarak, bağırsakları ve mideyi hayvanın soluna doğru yavaşça çekin.Daha sonra, maruz kalan sol böbreğin hemen altındaki inferior vena kava veya IVC'nin altına 5-0'lık bir cerrahi sütür yerleştirin. Dikişe gevşek bir bağlantı bağlayın. Daha sonra, hepatik portal venin etrafına 5-0 cerrahi sütür daha yerleştirin.Sütürü, hepatik portal venin dalak damar dallanma noktasının hemen üzerine yerleştirin. Yine, dikişe gevşek bir bağlantı bağlayın. Portal ven sütürünü gerginlik olarak kullanarak, 20-gauge IV kateteri, sağ ve sol hepatik portal vene dallandığı bir santimetre aşağıda hepatik portal ven içine yerleştirin.Ardından, kateteri damardan yukarı kaydırın, ancak dallanma alanının altında tutun. Kanın damlamaya başlayana kadar kateterden aşağı inmesine izin verin. IV kateteri portal ven sütürü ile sabitleyin.Kateterine A tamponlu bir IV şişesi takmak için bir IV hattı kullanın. Daha sonra, sisteme hava girmesini önlerken karaciğeri bu çözelti ile yıkayın. Böbreğin altındaki IVC'nin etrafındaki dikişi bağlayın.Bundan sonra, hayvanın kanamasına izin vermek için IVC'yi dikişin altında kesin. Rahatsız ettikten sonra, mideyi, bağırsakları, dalağı ve karaciğere bağlı diğer bağırsakları kesin. Ardından, diyaframı ve ana damarları göğüs boşluğundan kesin.Karaciğeri hayvandan çıkarın ve perfüzyon tepsisine yerleştirin. IV hattını dikkatlice çıkarın ve kollajenaz çözeltisini devridaim odasına bağlayın. Kapsül modellenene ve yumuşak görünene kadar karaciğerin perfüzyonuna izin verin.Bu işlem genellikle 10 ila 15 dakika sürecektir. Sindirildikten sonra, karaciğeri odadan çıkarın ve yaklaşık 20 mililitre serumsuz DMEM içeren 10 santimetrelik bir Petri kabına yerleştirin. Karaciğeri birkaç pipet ucuyla yavaşça ayırın ve safra ağacını atın.Bundan sonra, karaciğer süspansiyonunu 70 mikrometrelik bir hücre süzgecinden 50 mililitrelik bir konik tüpe filtreleyin. Hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında iki dakika boyunca 50 kez G'de santrifüj yapın. Daha sonra, parankimal olmayan hepatik hücreler içeren süpernatantı toplayın.Süpernatantı dört santigrat derecede beş dakika boyunca 300 kez G'de santrifüj yapın. Bundan sonra, hücre peletini toplayın ve bir mililitre izolasyon tamponunda yeniden askıya alın. Üreticinin yönergelerini izleyerek otomatik hücre sayacı kullanarak hücre numarasını belirleyin.Ardından, hücre süspansiyonunu santrifüj edin. Süpernatantı tamamen aspire edin ve peleti 10 milyon hücre başına 90 mikrolitre izolasyon tamponu ile yeniden askıya alın. Toplam 10 milyon hücre başına 10 mikrolitre CD146 MicroBeads ekleyin.İyice karıştırın ve dört santigrat derecede 15 dakika kuluçkaya yatırın. Hücreleri yıkamak için, 10 milyon hücre başına bir ila iki mililitre izolasyon tamponu ekleyin. Çözeltiyi 10 dakika boyunca 300 kez G'de santrifüj edin.Bundan sonra, süpernatantı tamamen aspire edin ve 500 mikrolitre izolasyon tamponunda bir milyara kadar hücreyi yeniden askıya alın. Daha sonra, ayırma kolonunu üç mililitre izolasyon tamponu ile durulayarak hazırlayın. Hücre süspansiyonunu, 70 mikrometrelik ön ayırma filtreleriyle istiflenmiş sütuna uygulayın.Kolonu üç mililitre izolasyon tamponu ile üç kez yıkayın. Bundan sonra, kolonu ayırıcıdan çıkarın ve 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne yerleştirin. Pipet, kolon üzerine beş mililitre izolasyon tamponu yerleştirin.Manyetik boncuk etiketli hücreleri kurtarmak için, hücreleri temizlemek için pistonu sütuna sıkıca itin. Son olarak, hücreleri dört santigrat derecede beş dakika boyunca 300 kez G'de santrifüj edin. İzole LSEC'lerin saflığı ve yüzey belirteçleri akım sitometrisi ile değerlendirildi.Kapılı LSEC'ler ve tekiller için veri analizi ve geçit stratejisi, ileri dağılım ve yan saçılma verilerine dayanmaktadır. İzole LSEC'ler bir canlılık boyası ve CD45, CD146 ve Stabilin-2 antikorlarının bir kombinasyonu ile boyandı. Canlı LSEC'ler CD45 negatif populasyona bağlandı ve CD146 ve Stabilin-2 ekspresyonu için analiz edildi.Bu verilerden, izole edilmiş LSEC'lerin% 94'ten daha fazla canlılığa ve% 90'dan fazla saflığa sahip olduğu doğrulandı. İzole hücrelerin LSEC'e özgü fenotipi, ışık mikroskobu ve taramalı elektron mikroskobu kullanılarak daha da doğrulandı. İzole LSEC'ler altı saat boyunca tam büyüme ortamında kültürlendi ve ışık mikroskobu ile incelendi.SEM görüntüsündeki beyaz oklar, LSEC'lerin karakteristik bir morfolojik özelliği olan LSEC fenestrae'yi gösterir. Bir karaciğer dokusunun tam perfüzyonunu sağlamak için kritik adımlar, uygun kateter bandı konumlandırması, kateterde hava girmesini önlemek ve kollajenaz sindiriminin optimum zamanlamasıdır. Protokolümüz kullanılarak elde edilen yüksek kaliteli LSEC, LSEC fonksiyonunun moleküler mekanizmasının tanımlanmasını kolaylaştıracak ve karaciğerde, sağlıkta ve hastalıkta hücreler arası iletişimdeki rollerini anlamamızı geliştirecektir.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Kapak Endotel Hücreleri İzolasyon

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Isolation &#38; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Isolation & Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Hoechst İzolasyonu ve Karakterizasyonu Düşük CD45 Negatif Fare Akciğer Mezenkimal Kök Hücre

Tissue resident mesenchymal stem cells (MSC) are important regulators of tissue repair or regeneration, fibrosis, inflammation, angiogenesis and tumor ...

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

Birincil Fare trofoblast hücreleri ve trofoblast invazyonu Assay İzolasyonu

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Embriyonik Ventriküler Endotel Hücre İzolasyonu

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Fare Primer Pankreas Asiner Hücreleri İzolasyon ve Kültür

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Murin Vana Endotel Hücreleri İzolasyon

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

A Standardized Method for the Analysis of Liver Sinusoidal Endothelial Cells and Their Fenestrations by Scanning Electron Microscopy

Taramalı Elektron Mikroskobu Karaciğer Sinüs Endotel Hücreleri Analizi ve Bunların fenestrasyonlar için Standart Yöntemi

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

İzolasyon ve Fare aort endotel hücreleri İlköğretim Kültür

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells

İlköğretim İnsan Hepatositlerin İzolasyonu ve Non-parankimal karaciğer hücrelerinin Binbaşı popülasyonları İlgili Protokolü

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic ...

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

Fare Koroner Endotel Hücreleri İzolasyon

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...