Name: culture and imaging of human nasal epithelial organoids
Uploaded: 2021-12-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culture and Imaging of Human Nasal Epithelial Organoids at JoVE.com

Vi anerkender taknemmeligt bidragene fra alle de deltagere, der donerede HNE børstebiopsier til at udvikle denne protokol. Vi takker Latona Kersh og Children's Research Unit personale for at koordinere rekruttering af frivillige studier og prøvesamlinger. Vi takker Lily Deng, Johnathan Bailey og Stephen Mackay, tidligere praktikanter i vores laboratorium, for teknisk assistance. Vi takker Zhong Liu og Rui Zhao for deres tekniske hjælp. Steven M. Rowe, direktør for CF Research Center ved UAB, leverer lederskab og ressourcer, uden hvilke dette arbejde ikke ville være muligt. Vi vil også gerne takke Sarah Guadiana hos Biotek for hjælp med instrumenttræning, Robert Grabski for konfokal mikroskopi assistance på UAB High-Resolution Imaging Facility og Dezhi Wang for histologisk bistand på UAB Histology Core. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (NIH.) Grant K23HL143167 (til JSG), Cystic Fibrosis Foundation (CFF) Grant GUIMBE18A0-Q (til JSG), Gregory Fleming James Cystic Fibrosis Center [NIH Grants R35HL135816 og DK072482 og CFF University of Alabama i Birmingham (UAB) Research and Development Program (Rowe19RO)], og UAB Center for Clinical and Translational Science (NIH Grant UL1TR001417).

HNE prøver blev indsamlet på Children's of Alabama hospitalet. Alle procedurer og metoder, der er beskrevet her, er blevet godkendt af IRB University of Alabama i Birmingham (UAB IRB #151030001). For at lette udvidelsen og forbedre funktionen af humane nasale epitelceller (HNE'er) er de nuværende dyrkningsmetoder tilpasset fra den velkendte luft-væske-grænseflade (ALI) dyrkningsmetode28,34. HVE'er blev oprindeligt indsamlet ved børstebiopsi som tidligere be...

<ol>
	<li>Brewington, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brushed+nasal+epithelial+cells+are+a+surrogate+for+bronchial+epithelial+CFTR+studies.">Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies.</a> JCI Insight. 3 (13), (2018).</li><li>Brewington, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+nasal+epithelial+cell+spheroids+for+individualized+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+study.">Generation of human nasal epithelial cell spheroids for individualized cystic fibrosis transmembrane conductance regulator study.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57492 (2018).</li><li>Brewington, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+CFTR+function+and+modulation+in+primary+human+nasal+cell+spheroids.">Detection of CFTR function and modulation in primary human nasal cell spheroids.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 17 (1), 26-33 (2017).</li><li>Bridges, M. A., Walker, D. C., Davidson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+and+control+nasal+epithelial+cells+harvested+by+a+brushing+procedure.">Cystic fibrosis and control nasal epithelial cells harvested by a brushing procedure.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. 27 (9), 684-686 (1991).</li><li>Bridges, M. A., Walker, D. C., Harris, R. A., Wilson, B. R., Davidson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultured+human+nasal+epithelial+multicellular+spheroids:+polar+cyst-like+model+tissues.">Cultured human nasal epithelial multicellular spheroids: polar cyst-like model tissues.</a> Biochemistry and Cell Biology. 69 (2-3), 102-108 (1991).</li><li>Collie, G., Buchwald, M., Harper, P., Riordan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+sweat+gland+epithelial+cells+from+normal+individuals+and+patients+with+cystic+fibrosis.">Culture of sweat gland epithelial cells from normal individuals and patients with cystic fibrosis.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. 21 (10), 597-602 (1985).</li><li>Conger, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+(CFTR)+and+ciliary+beat+frequency+activation+by+the+CFTR+Modulators+Genistein,+VRT-532,+and+UCCF-152+in+primary+sinonasal+epithelial+cultures.">Comparison of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) and ciliary beat frequency activation by the CFTR Modulators Genistein, VRT-532, and UCCF-152 in primary sinonasal epithelial cultures.</a> JAMA Otolaryngology-Head &amp; Neck Surgery. 139 (8), 822-827 (2013).</li><li>de Courcey, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+primary+human+nasal+epithelial+cell+cultures+for+the+study+of+cystic+fibrosis+pathophysiology.">Development of primary human nasal epithelial cell cultures for the study of cystic fibrosis pathophysiology.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 303 (11), 1173-1179 (2012).</li><li>Gruenert, D. C., Basbaum, C. B., Widdicombe, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+normal+and+cystic+fibrosis+epithelial+cells+grown+under+serum-free+conditions.">Long-term culture of normal and cystic fibrosis epithelial cells grown under serum-free conditions.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. 26 (4), 411-418 (1990).</li><li>Mosler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feasibility+of+nasal+epithelial+brushing+for+the+study+of+airway+epithelial+functions+in+CF+infants.">Feasibility of nasal epithelial brushing for the study of airway epithelial functions in CF infants.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 7 (1), 44-53 (2008).</li><li>Anderson, J. D., Liu, Z., Odom, L. V., Kersh, L., Guimbellot, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFTR+function+and+clinical+response+to+modulators+parallel+nasal+epithelial+organoid+swelling.">CFTR function and clinical response to modulators parallel nasal epithelial organoid swelling.</a> The American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 321 (1), 119-129 (2021).</li><li>Guimbellot, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasospheroids+permit+measurements+of+CFTR-dependent+fluid+transport.">Nasospheroids permit measurements of CFTR-dependent fluid transport.</a> JCI Insight. 2 (22), (2017).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+nasal+epithelial+organoids+for+therapeutic+development+in+cystic+fibrosis.">Human nasal epithelial organoids for therapeutic development in cystic fibrosis.</a> Genes (Basel). 11 (6), (2020).</li><li>Muller, L., Brighton, L. E., Carson, J. L., Fischer, W. A., Jaspers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+of+human+nasal+epithelial+cells+at+the+air+liquid+interface.">Culturing of human nasal epithelial cells at the air liquid interface.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2013).</li><li>Dekkers, J. F., vander Ent, C. K., Beekman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+opportunities+for+CFTR-targeting+drug+development+using+organoids.">Novel opportunities for CFTR-targeting drug development using organoids.</a> Rare Diseases. 1, 27112 (2013).</li><li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+CFTR+assay+using+primary+cystic+fibrosis+intestinal+organoids.">A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids.</a> Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).</li><li>Okiyoneda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism-based+corrector+combination+restores+DeltaF508-CFTR+folding+and+function.">Mechanism-based corrector combination restores DeltaF508-CFTR folding and function.</a> Nature Chemical Biology. 9 (7), 444-454 (2013).</li><li>Schwank, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+repair+of+CFTR+by+CRISPR/Cas9+in+intestinal+stem+cell+organoids+of+cystic+fibrosis+patients.">Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients.</a> Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).</li><li>Geurts, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-based+adenine+editors+correct+nonsense+mutations+in+a+cystic+fibrosis+organoid+biobank.">CRISPR-based adenine editors correct nonsense mutations in a cystic fibrosis organoid biobank.</a> Cell Stem Cell. 26 (4), 503-510 (2020).</li><li>Bove, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+in+vitro+alveolar+type+II+cell+proliferation+barrier+while+retaining+ion+transport+properties.">Breaking the in vitro alveolar type II cell proliferation barrier while retaining ion transport properties.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (4), 767-776 (2014).</li><li>Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+keratinocytes+are+efficiently+immortalized+by+a+Rho+kinase+inhibitor.">Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor.</a> Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2619-2626 (2010).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK+inhibitor+and+feeder+cells+induce+the+conditional+reprogramming+of+epithelial+cells.">ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells.</a> The American Journal of Pathology. 180 (2), 599-607 (2012).</li><li>Palechor-Ceron, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation+induces+diffusible+feeder+cell+factor(s)+that+cooperate+with+ROCK+inhibitor+to+conditionally+reprogram+and+immortalize+epithelial+cells.">Radiation induces diffusible feeder cell factor(s) that cooperate with ROCK inhibitor to conditionally reprogram and immortalize epithelial cells.</a> The American Journal of Pathology. 183 (6), 1862-1870 (2013).</li><li>Scudieri, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionocytes+and+CFTR+chloride+channel+expression+in+normal+and+cystic+fibrosis+nasal+and+bronchial+epithelial+cells.">Ionocytes and CFTR chloride channel expression in normal and cystic fibrosis nasal and bronchial epithelial cells.</a> Cells. 9 (9), (2020).</li><li>Marthin, J. K., Stevens, E. M., Larsen, L. A., Christensen, S. T., Nielsen, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+three-dimensional+explant+spheroids+derived+from+human+nasal+airway+epithelium:+a+simple+methodological+approach+for+ex+vivo+studies+of+primary+ciliary+dyskinesia.">Patient-specific three-dimensional explant spheroids derived from human nasal airway epithelium: a simple methodological approach for ex vivo studies of primary ciliary dyskinesia.</a> Cilia. 6, 3 (2017).</li><li>Blouquit, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+and+fluid+transport+properties+of+small+airways+in+cystic+fibrosis.">Ion and fluid transport properties of small airways in cystic fibrosis.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 174 (3), 299-305 (2006).</li><li>Birket, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+therapy+with+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+modulators+augment+the+airway+functional+microanatomy.">Combination therapy with cystic fibrosis transmembrane conductance regulator modulators augment the airway functional microanatomy.</a> The American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 310 (10), 928-939 (2016).</li><li>Birket, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+anatomic+defect+of+the+cystic+fibrosis+airway.">A functional anatomic defect of the cystic fibrosis airway.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 190 (4), 421-432 (2014).</li><li>Chu, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle-tracking+microrheology+using+micro-optical+coherence+tomography.">Particle-tracking microrheology using micro-optical coherence tomography.</a> Biophysical Journal. 111 (5), 1053-1063 (2016).</li><li>Chu, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.+In+vivo+imaging+of+airway+cilia+and+mucus+clearance+with+micro-optical+coherence+tomography.">et al. In vivo imaging of airway cilia and mucus clearance with micro-optical coherence tomography.</a> Biomedical Optics Express. 7 (7), 2494-2505 (2016).</li><li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+quantitative+study+of+airway+functional+microanatomy+using+micro-optical+coherence+tomography.">Method for quantitative study of airway functional microanatomy using micro-optical coherence tomography.</a> PLoS One. 8 (1), 54473 (2013).</li><li>Tuggle, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+defects+in+ion+transport+and+tissue+development+in+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+(CFTR)-knockout+rats.">Characterization of defects in ion transport and tissue development in cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-knockout rats.</a> PLoS One. 9 (3), 91253 (2014).</li><li>McCravy, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalised+medicine+for+non-classic+cystic+fibrosis+resulting+from+rare+CFTR+mutations.">Personalised medicine for non-classic cystic fibrosis resulting from rare CFTR mutations.</a> European Respiratory Journal. 56 (1), 2000062 (2020).</li><li>Mutyam, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+benefit+observed+with+the+CFTR+potentiator,+ivacaftor,+in+a+CF+patient+homozygous+for+the+W1282X+CFTR+nonsense+mutation.">Therapeutic benefit observed with the CFTR potentiator, ivacaftor, in a CF patient homozygous for the W1282X CFTR nonsense mutation.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 16 (1), 24-29 (2017).</li><li>Corning Inc. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> CORNING CELL-TAK CELL AND TISSUE ADHESIVE. , (2013).</li><li>Anderson, J. D., Liu, Z., Odom, L. V., Kersh, L., Guimbellot, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFTR+function+and+clinical+response+to+modulators+parallel+nasal+epithelial+organoid+swelling.">CFTR function and clinical response to modulators parallel nasal epithelial organoid swelling.</a> The American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 321 (1), 119-129 (2021).</li><li>Biotek Instruments, Incorporated. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Lionheart FX Live Cell Imager Operator's Manual. , (2016).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Simmonds, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+it+cystic+fibrosis?+The+challenges+of+diagnosing+cystic+fibrosis.">Is it cystic fibrosis? The challenges of diagnosing cystic fibrosis.</a> Paediatric Respiratory Reviews. 31, 6-8 (2019).</li><li>McGarry, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+and+in+vitro+ivacaftor+response+in+cystic+fibrosis+patients+with+residual+CFTR+function:+N-of-1+studies.">In vivo and in vitro ivacaftor response in cystic fibrosis patients with residual CFTR function: N-of-1 studies.</a> Pediatric Pulmonology. 52 (4), 472-479 (2017).</li><li>Garratt, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+culture+success+in+an+airway+epithelium+sampling+program+of+young+children+with+cystic+fibrosis.">Determinants of culture success in an airway epithelium sampling program of young children with cystic fibrosis.</a> Experimental Lung Research. 40 (9), 447-459 (2014).</li></ol>

Dette manuskript giver detaljerede metoder til omfattende levende og fast billeddannelse af luftvejsepitelorganoiderne afledt af HNE børstebiopsi. Det beskriver funktionelle assays, der kan bestemme CFTR-aktivitet hos et individ. HVE'er giver et minimalt invasivt, primært væv til en række applikationer. De ekspansionsteknikker, der tilbydes her, kan bruges til modellering af luftvejssygdomme, herunder organoider. Organoider kan bruges til præcisionsterapeutiske tilgange og til at overvåge stabiliteten af gen- eller...

Introduktion til teknikken Ex vivo kulturbaserede assays er et stadig mere anvendt værktøj til præcisionsmedicin og studiet af sygdomspatofysiologi. Primær human nasal epitel (HNE) cellekultur er blevet anvendt i adskillige undersøgelser af cystisk fibrose 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 , en autosomal recessiv sygdom, der påvirker epitelcellefunktionen i flere organer. HNE-kultur giver en vedvarende kilde til luftvejsepitel, der kan opnås fremadrettet og rekapitulerer elektrofysiologiske og biokemiske kvaliteter for at teste cystisk fibrose transmembrane konduktansregulator (CFTR) aktivitet. HNE-celler kan prøveudtages med minimale bivirkninger14, svarende til almindelige virale respiratoriske vatpinde. Forskningsarbejde, der beskriver en model for cystisk fibrose undersøgelse afledt af HNE børstebiopsier er for nylig blevet offentliggjort11,13. I lighed med andre modeller, der anvender primær HNE 2,3 og tarmvæv 15,16,17,18,19, beskrives detaljeret karakterisering af differentieringen og billeddannelsen af denne model her til brug i CF-forskning og til støtte i undersøgelser af andre luftvejssygdomme 13 . Organoidmodellen er ikke ubegrænset som udødeliggjorte cellelinjer, men kan udvides ved betinget omprogrammering (ved hjælp af bestrålede og inaktiverede feederfibroblaster og Rho-kinasehæmmere) til en mere stamcellelignende tilstand 20,21,22,23. Behandlingen af HNE-børstebiopsier ved hjælp af denne metode giver et stort antal epitelceller til brug i flere applikationer ved højere gennemstrømning, samtidig med at evnen til at differentiere fuldt ud bevares. Mens denne protokol blev udviklet ved hjælp af feederceller, kan andre metoder anvendes af efterforskere, der ønsker at undgå feedercelleteknologi14,24.
Betydningen af teknikken for lungebiologi En betydelig undersøgelse er blevet afsat til at forstå, hvordan fraværet af regelmæssig, fungerende CFTR i cellemembranen i epitelceller resulterer i dysfunktion i lungerne, bugspytkirtlen, leveren, tarmen eller andre væv. Dysfunktionel epiteliontransport, især for chlorid og bicarbonat, resulterer i et nedsat volumen af epitelforingsvæskerne og ændringer i slimhindesekretioner, hvilket fører til slimhindestasis og obstruktion. I andre luftvejssygdomme, såsom primær ciliær dyskinesi, forringer ændret ciliær bevægelse mucociliær clearance og fører til slimhindestasis og obstruktion25. Derfor er den nuværende HNE-organoidmodel udviklet til forskellige anvendelser afhængigt af investigatorens eksperimentelle design og ressourcer. Dette omfatter levende cellebilleddannelse ved hjælp af levende cellepletter; fiksering og sektionering for at karakterisere morfologien; immunofluorescensfarvning med antistoffer og helmonteret konfokal billeddannelse for at undgå at forstyrre intraluminale strukturer; og lysfeltsbilleddannelse og mikrooptisk kohærenstomografi til kvantitative målinger af ciliary beat-frekvens og mucociliær transport13. For at lette udvidelsen til andre efterforskere blev kommercielt tilgængelige reagenser og forsyninger brugt til dyrkning. Der blev udviklet et funktionelt assay, der brugte almindelige mikroskopteknikker og mere specialiseret udstyr. Samlet set, mens den nuværende model blev designet til at vurdere CFTR-aktivitet ved baseline eller som reaktion på terapi, kan de teknikker, der er beskrevet i denne protokol, anvendes på andre sygdomme, der involverer epitelcellefunktion, især epitelcellevæsketransport.
Sammenligning med andre metoder For nylig blev nytten af denne organoidmodel udviklet ved at korrelere in vitro CFTR-modulatorresponser fra patienters organoider med deres kliniske respons11. Det er navnlig også påvist, at den nuværende model parallelt med kortslutningsstrømresponser, den nuværende guldstandard for vurdering af CFTR-funktion, hos de samme patienter. Kortslutningsstrøm adskiller sig fra hævelsesassayet, fordi førstnævnte måler CFTR-funktion via iontransport26. I modsætning hertil måler dette assay en mere nedstrøms effekt med væsketransport, hvilket giver yderligere oplysninger om den samlede funktion af CFTR 27,28,29,30,31,32. Kortslutningsstrømmålinger har fortsat været en almindelig og pålidelig metode til bestemmelse af CFTR-chloridkanalaktivitet 1,33. Disse elektrofysiologiske assays kræver specialiseret, dyrt udstyr, kræver mange gange flere celler til hver eksperimentel replikat end organoidassayet, kan ikke let automatiseres og er ikke modtagelige for opskalering til applikationer med højere gennemstrømning. En anden organoidmodel afledt af tarmepitel har yderligere fordele 15,16,17,18, såsom mere fremragende replikativ kapacitet, men er hverken afledt af et luftvejsvæv eller er universelt tilgængeligt. HNE børstninger opnås med billige cytologibørster uden behov for sedation og med minimal risiko. At få børstningen kræver ikke en kliniker og kan udføres af uddannede forskningskoordinatorer og andet forskningspersonale14. HNE-organoidmodellen kan dyrkes af ethvert laboratorium med primærcellekulturkapacitet, og nogle af applikationerne kan udføres med standardmikroskopiteknikker. Alt i alt giver disse fordele yderligere adgang til teknologi til vurdering af luftvejsepitelfunktion, som ellers ville være utilgængelig for nogle laboratorier. Desuden kan HNE-organoider bruges til at studere andre sygdomstilstande, der påvirker luftvejene, såsom primær ciliær dyskinesi25 eller virusinfektion, som tarmorganoider ikke kan.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Nasal brush</td>
			<td>Medical Packaging CYB1</td>
			<td>CYB-1</td>
			<td>Length: 8 inches, width approximately 7 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large-Orifice Pipette Tips</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>02-707-141</td>
			<td>Large bore pipette tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>Cell detachment solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% trypsin -EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor from soybean</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6522</td>
			<td>Working solution: 1mg/mL in 1XDPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356255</td>
			<td>Extracellular matrix (EM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide Angiogenesis</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81506</td>
			<td>15-well slide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-Well Transwell</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7200154</td>
			<td>Culture insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chambered Coverglass</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>155409</td>
			<td>8-well glass-bottom chamber slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>354240</td>
			<td>Cell adhesive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>50980487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A16046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucBlue</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>R37605</td>
			<td>DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ts2-FL (Inverted Routine Microscope)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Inverted epi-fluorescence microscope or bright-field microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R-HD25</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements- Basic Research</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>manual imaging analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histogel</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Base Molds</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>41-740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lionheart FX</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BTLFX</td>
			<td>Automated image system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lionheart Cover</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1450009</td>
			<td>Environmental Control Lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity Chamber</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1450006</td>
			<td>Stage insert (environmental chamber)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Controller for CO2 and O2</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1210013</td>
			<td>Gas controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate/Slide Stage Insert</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1450527</td>
			<td>Slide holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5 Imaging Prime Software</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BTGEN5IPRIM</td>
			<td>Automated imaging analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x Phase Contrast Objective</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1320515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Phase Contrast Objective</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1320516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED Cube</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1225007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Cube (DAPI)</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1225100</td>
			<td>DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFTRinh-172</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S7139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBMX</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expansion Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12 Nutrient mix</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;16140-071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;15-140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;C8052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;PHG0314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone (HC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;H0888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;A2786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>&#160;04-0012-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceftazidime</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>&#160;J66460-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tobramycin</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>&#160;J67340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vancomycin</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>&#160;J67251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Differentiation Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 (1:1)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;11330-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultroser-G</td>
			<td>Pall</td>
			<td>&#160;15950-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Clone II</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>&#160;SH30066.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Brain Extract</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>&#160;CC-4098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;I-9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;H-0888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triiodothyronine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;T-6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;T-0665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanolamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;E-0135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epinephrine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-4250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-Phosphorylethanolamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R-2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human CFTR antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB1660</td>
			<td>Dilution: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZO-1 antibody</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>MA3-39100-A647</td>
			<td>Dilution: 1000x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MUC5B antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HPA008246</td>
			<td>Dilution: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-acetylated tubulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7451</td>
			<td>Dilution: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-beta IV Tubulin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab11315</td>
			<td>Dilution: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21202</td>
			<td>Dilution: 2000x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21207</td>
			<td>Dilution: 2000x</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture and imaging of human nasal epithelial organoids

Individualiseret terapi til cystisk fibrose (CF) patienter kan opnås med en in vitro sygdomsmodel for at forstå baseline Cystisk Fibrose Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) aktivitet og restaurering fra små molekyleforbindelser. Vores gruppe fokuserede for nylig på at etablere en veldifferentieret organoidmodel direkte afledt af primære humane nasale epitelceller (HNE). Histologi af sektionerede organoider, helmonteret immunofluorescerende farvning og billeddannelse (ved hjælp af konfokal mikroskopi, immunofluorescerende mikroskopi og lyst felt) er afgørende for at karakterisere organoider og bekræfte epiteldifferentiering som forberedelse til funktionelle assays. Desuden producerer HNE-organoider lumen af varierende størrelse, der korrelerer med CFTR-aktivitet, idet der skelnes mellem CF- og ikke-CF-organoider. I dette manuskript beskrives metoden til dyrkning af HNE-organoider detaljeret med fokus på vurdering af differentiering ved hjælp af billeddannelsesmetoderne, herunder måling af baseline lumenområde (en metode til CFTR-aktivitetsmåling i organoider, som ethvert laboratorium med et mikroskop kan anvende) samt den udviklede automatiserede tilgang til et funktionelt assay (som kræver mere specialiseret udstyr).

HNE's ekspansion er afgørende for en blomstrende organoidkultur. HVE'er fra en vellykket prøveindsamling bør udvides til over 70% sammenløb omkring 10 dage. Et eksempel på vellykkede og mislykkede prøver er vist i henholdsvis figur 1A og figur 1B. Cellerne skal kasseres, hvis de ikke kan nå 70% sammenløb inden for 14 dage efter co-kultur med bestrålede 3T3-celler. Eventuelle forurenede celler skal straks kasseres, hvis de ikke er i stan...

Watch this Scientific Journal Video about Culture and Imaging of Human Nasal Epithelial Organoids at JoVE.com

Culture and Imaging of Human Nasal Epithelial Organoids

En detaljeret protokol præsenteres her for at beskrive en in vitro-organoidmodel fra humane nasale epitelceller. Protokollen har muligheder for målinger, der kræver standard laboratorieudstyr, med yderligere muligheder for specialudstyr og software.

Kultur og billeddannelse af humane nasale epitelorganoider

Individualized therapy for cystic fibrosis (CF) patients can be achieved with an in vitro disease model to understand baseline Cystic Fibrosis ...

Individualiseret terapi til cystisk fibrose patienter kan opnås ved hjælp af en in vitro sygdomsmodel for at forstå CFTR-aktiviteten ved baseline. Humane nasale epitelorganoider eller HNE-organoider producerer lumen af varierende størrelse, der korrelerer med CFTR-aktiviteten, idet der skelnes mellem CF- og ikke-CF-organoider. Her har vi beskrevet en metode til dyrkning og billeddannelse af disse HNE-organoider i detaljer.Dysfunktionel epiteliontransport, især chlorid og bicarbonat, resulterer i et nedsat volumen af epitelforingsvæskerne. Dette påvirker også slimsekretionerne, der fører til slimhinde og obstruktion. Derfor er vores HNE-model udviklet til forskellige anvendelser, afhængigt af investigatorens eksperimentelle design og ressourcer.Bortset fra at vurdere CFTR-aktivitet ved baseline eller som reaktion på terapi, kan denne teknik også anvendes på andre sygdomme, der involverer epitelcellefunktion, især epitelcellevæsketransport. Disse metoder blev primært udviklet til brug i cystisk fibrose undersøgelser. Andre undersøgelser, der evaluerer luftvejsepethelia, såsom primær ciliær dyskinesi, kan også finde disse metoder nyttige.Disse teknikker kræver opmærksomhed på detaljer og præcision. De kræver også omhyggelig observation for at sikre, at den indledende udvidelse af celler er passende. Overvåg alle kulturer hver dag, og succesen vil være mere sandsynlig.Til at begynde med dissocieres næsebørstebiopsien i 8 milliter RPMI-medier i et 15 ml konisk rør ved at føre cytologibørsten flere gange gennem en pipettespids med stor boring. Centrifugering af cellerne ved 500 gange g i fem minutter ved fire grader Celsius. Kassér supernatanten, og suspender derefter cellepillen igen i tre milliliter celleløsningsopløsning.Inkuber ved stuetemperatur i 16 minutter for at fordøje. Brug fem milliliter ekspansionsmediet til at vaske cellerne to gange. Derefter tilsættes dem til en T75-kolbe, forfrøet med bestrålede, inaktiverede og 50 til 60% sammenflydende 3T3 fibroblaster.Lad cellerne co-kultur og ekspandere i ekspansionsmediet i 7 til 14 dage. Hvis antibiotika blev introduceret til celler afledt af patienter med cystisk fibrose, bør medierne erstattes med antibiotikafrie ekspansionsmedier efter de første tre dyrkningsdage og kan fortsætte med at skifte medie hver anden dag, indtil 80% sammenflydende. Vask cellerne med 1x DPBS.Derefter tilsættes 1,5 ml 0,05% trypsin-EDTA i T75-kolben og inkuberes i fire minutter ved 37 grader Celsius for at fjerne den bestrålede og inaktiverede 3T3 fibroblast fra kulturen. Skyl T75-kolben med 1x DPBS to gange for at vaske eventuelle resterende 3T3 fibroblaster grundigt væk. Der tilsættes 1,5 ml 0,05 % trypsin-EDTA i T75-kolben, og der inkuberes i 10 minutter ved 37 grader Celsius for at løsne HNE'er.Neutraliser trypsin med sojabønne trypsinhæmmer i et en-til-en-forhold. Centrifugering af cellerne ved 500 gange gi i fem minutter. Kassér derefter supernatanten og vask cellerne med fem milliliter ekspansionsmedier en gang.Cellerne er nu klar til såning for at dyrke organoider. Optø den organoide kultur ekstracellulær matrix eller ECM natten over ved fire grader Celsius. Afkøl angiogenesen med 15 brønde glider natten over ved samme temperatur.Derefter afkøles pipettespidserne til fire grader Celsius. Belæg diasene med fem mikroliter kold 100% ECM på is. Placer dem i en cellekulturinkubator ved 37 grader Celsius i mindst 30 minutter til konsolidering.Tæl HNE'er høstet fra samkultur ved hjælp af et hæmocytometer. Fortynd derefter cellerne til 500 celler pr. Mikroliter i samlet antal, med 20% ECM fortyndet af differentieringsmedier på is. Tag de ECM-belagte dias ud af inkubatoren, og frø fem mikroliter af den kolde celle ECM-blanding i hver af brøndene.Overfør diasene straks til en kulturinkubator ved 37 grader Celsius i en time for at konsolidere celle ECM-blandingen. Derefter tages diasene ud af inkubatoren og fodrer cellerne ind i hver brønd af de 15-brønds angiogenese dias med 50 mikroliter af differentieringsmediet. Returner diaset i kulturinkubatoren ved 37 grader Celsius, skift medierne hver anden dag, indtil organoiderne er klar til yderligere eksperimenter.Forbehandle de 8-brønds glasbundede kammerglider med celleklæbemiddel i 30 minutter. Kassér opløsningen og lufttør brøndene i yderligere 30 minutter. Kassér derefter medierne fra toppen af ECM og tilsæt derefter 50 mikroliter af den kolde 1x PBS i hver brønd af de 15 brønds dias på is.Pipette op og ned tre til fem gange ved hjælp af 200 mikroliter af pipettespidsen med stor boring. Dispenser opløsningen på midten af en brønd i 8-brønds kammerdiaserne. Fjern straks overskydende væske fra brøndene med en fin spids pipette.Placer derefter kammeret glide ind i en 37 grader Celsius inkubator i 40 minutter for at forbedre organoidet, der klæber til glasbunden. Efter 40 minutter vaskes organoiderne forsigtigt med 1x PBS to gange og fastgøres med 300 mikroliter 4% paraformaldehyd i hver brønd i 30 minutter indstillet stuetemperatur. Vask to gange med 1x PBS og opbevar organoiderne i 1x PBS sæt fire grader Celsius til immunstaining i op til to uger.For at høste organoiderne til histologiske undersøgelser skal du fjerne medierne fra kulturen og tilføje 50 mikroliter koldt en 1x PBS i hver brønd af diasene på is. Pipette op og ned tre til fem gange ved hjælp af en 200 mikroliter pipettespids med stor boring. Kombiner alle opløsningerne fra 15-brønds dias- eller kulturindsatserne i et 15 ml konisk rør på is.Juster det samlede opløsningsvolumen i røret til 10 ml ved at tilføje kold 1x PBS. Centrifugering af røret ved fire grader Celsius, 300 gange g i fem minutter. Derefter aspirerer supernatanten ud og tilsæt 60 mikroliter varm histogel for at blande med organoidpillen ved hjælp af en 200 mikroliter storboret pipettespids.Overfør suspensionen straks til en histologiform. Efter konsolidering af histoglen ved stuetemperatur sættes formblokken i 4% paraformaldehyd til fiksering natten over ved fire grader Celsius. Åbn softwaren, og højreklik nederst på skærmen.Vælg derefter Analysekontrolelementer efterfulgt af Automatiserede måleresultater. Åbn organoidbilledet, og vælg 5 til 10 organoider med synlige lumen. Hold højreklik på billedet for at åbne menuen og vælg Polygonal ROI for at skitsere den fulde organoid for at opnå organoidens samlede overfladeareal.Skitser derefter lumen for at opnå lumenområdet. Gentag dette for de resterende organoider i brønden og alle brøndene i analysen. Til sidst skal du eksportere dataene til Excel.Del lumenarealet med det samlede overfladeareal, og gennemsnit alle organoiderne fra prøven for at få Baseline Lumen Ratio. De lyse feltbilleder repræsenterer HNE'er fra en vellykket og mislykket prøvesamling. HNE'er vokser godt i en stor klynge.I modsætning hertil vokser HNE'erne dårligt i to små klynger, der omgiver de bestrålede 3T3-celler. Organoider i 15-brønds diaset har mere præcise og skarpere billeder end dem i kulturindsatsen. Derudover blev der ikke observeret nogen signifikant morfologisk forskel i disse to kulturmetoder.Ikke-CF-organoider har typisk et større lumen og mere flydende end CF-organoider. HNE-farvningen i organoider fra et ikke-CF-, F508del/F508del-emne og den immunofluorescerende farvning af cilier i en organoid er vist på disse billeder. Cilia farvet med acetyleret tubulin, FITC mærket sekundært antistof, og kernerne mærket med DAPI er vist her.Maksimale projektionsbilleder af de to repræsentative organoider ved helmonteret immunofluorescerende farvning og deres tilsvarende tredimensionelle rekonstruktionsbilleder er vist her. Slim og cilier i organoidernes lumen er vist. De grafiske billeder repræsenterer det forskolin-inducerede hævelsesassay for at teste CFTR-funktionen på de primære nasale epitelceller.Et repræsentativt forskolin dosis-respons eksperiment af ikke-CF frivillige er vist her. FSK-dosisrespons sammenlignes med gennemsnitlig fraktioneret ændring på en time versus på otte timer, hvilket tyder på, at de otte timers assay kan producere en mere signifikant hævelsesforskel mellem forskellige FSK-doser end dem på en time. Området under kurven kan vise en mindre forskel i hævelse sammenlignet med gennemsnitlig brøkdelsændring efter otte timer.Mens du forsøger denne procedure, skal du huske på, at organoider vil gå tabt under indsamlings-, fikserings- og farvningsprocessen. Så der skal udvises omhyggelig omhu under hvert trin, og der skal opnås tilstrækkelige startnumre for at sikre succes. Voksende organoider i kulturindsatser kan hjælpe i denne henseende, da disse teknikker udvikles.Her har vi brugt kommercielt tilgængelige reagenser og forsyninger til at lette ekspansionen til andre efterforskere. Der blev også udviklet et funktionelt assay, der brugte almindelige mikroskopteknikker og mere specialiseret udstyr.

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

Isolation, Kultur og Imaging for Human Føtal pankreascelle Clusters

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

Primary Culture of Human Vestibular Schwannomas

Primær Culture of Human vestibulær schwannomas

Vestibular schwannomas (VSs) represent Schwann cell (SC) tumors of the vestibular nerve, compromising 10% of all intracranial neoplasms. VSs occur in ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Isolation, Kryopræservering og dyrkning af humane amnion epitelceller ved kliniske anvendelser

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Establishment of Human Epithelial Enteroids and Colonoids from Whole Tissue and Biopsy

Etablering af menneskelige Epithelial Enteroids og Colonoids fra Whole Tissue og biopsi

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem ...

Absorption of Nasal and Bronchial Fluids: Precision Sampling of the Human Respiratory Mucosa and Laboratory Processing of Samples

Absorption af Nasal og bronchiale væsker: Precision prøveudtagning af menneskelige respiratoriske slimhinden og laboratorium behandling af prøver

The methods of nasal absorption (NA) and bronchial absorption (BA) use synthetic absorptive matrices (SAM) to absorb the mucosal lining fluid (MLF) of the ...

Standardized Measurement of Nasal Membrane Transepithelial Potential Difference (NPD)

Standardized Measurement of Nasal Membrane Transepithelial Potential Difference NPD

Standardiseret måling af Nasal membran Transepithelial potentiale forskel (NPD)

We describe a standardized measurement of nasal potential difference (NPD). In this technique, cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) ...

Generation of Human Nasal Epithelial Cell Spheroids for Individualized Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Study

Generation af menneskers Nasal epitelcelle Spheroids for individualiseret cystisk fibrose Transmembrane ledningsevne Regulator undersøgelse

While the introduction of Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) modulator drugs has revolutionized care in Cystic Fibrosis (CF), the ...

Muscle Imbalances: Testing and Training Functional Eccentric Hamstring Strength in Athletic Populations

Muskel ubalancer: Test og uddannelse funktionelle excentrisk forstrækning styrke i Athletic populationer

Many hamstring injuries that occur during physical activity occur while the muscles are lengthening, during eccentric hamstring muscle actions. Opposite ...

Quantitative Mapping of Specific Ventilation in the Human Lung using Proton Magnetic Resonance Imaging and Oxygen as a Contrast Agent

Kvantitativ kortlægning af specifik ventilation i den menneskelige lunge ved hjælp af Proton magnetisk resonans imaging og ilt som kontrastmiddel

Specific ventilation imaging (SVI) is a functional magnetic resonance imaging technique capable of quantifying specific ventilation &#8213; the ratio of ...