Name: culture and imaging of human nasal epithelial organoids
Uploaded: 2021-12-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culture and Imaging of Human Nasal Epithelial Organoids at JoVE.com

We zijn dankbaar voor de bijdragen van alle deelnemers die HNE-borstelbiopten hebben gedoneerd om dit protocol te ontwikkelen. We bedanken Latona Kersh en medewerkers van de Children's Research Unit voor het coördineren van de werving van onderzoeksvrijwilligers en het verzamelen van monsters. We bedanken Lily Deng, Johnathan Bailey en Stephen Mackay, voormalige stagiaires in ons laboratorium, voor technische assistentie. We bedanken Zhong Liu en Rui Zhao voor hun technische hulp. Steven M. Rowe, directeur van het CF Research Center bij UAB, biedt leiderschap en middelen, zonder welke dit werk niet mogelijk zou zijn. We willen ook Sarah Guadiana van Biotek bedanken voor hulp bij instrumenttraining, Robert Grabski voor confocale microscopie-assistentie bij de UAB High-Resolution Imaging Facility en Dezhi Wang voor histologische hulp bij de UAB Histology Core. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (NIH.) Grant K23HL143167 (aan JSG), Cystic Fibrosis Foundation (CFF) Grant GUIMBE18A0-Q (aan JSG), het Gregory Fleming James Cystic Fibrosis Center [NIH Grants R35HL135816 en DK072482 en het CFF University of Alabama at Birmingham (UAB) Research and Development Program (Rowe19RO)], en het UAB Center for Clinical and Translational Science (NIH Grant UL1TR001417).

HNE-monsters werden verzameld in het Children's of Alabama-ziekenhuis. Alle hier beschreven procedures en methoden zijn goedgekeurd door de IRB University of Alabama in Birmingham (UAB IRB #151030001). Om de expansie te vergemakkelijken en de functie van menselijke neusepitheelcellen (HNE's) te verbeteren, zijn de huidige kweekmethoden aangepast van de bekende lucht-vloeistof interface (ALI) kweekmethode 28,34. HNE's werden aanvankelijk verzameld door borstelbiop...

<ol>
	<li>Brewington, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brushed+nasal+epithelial+cells+are+a+surrogate+for+bronchial+epithelial+CFTR+studies.">Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies.</a> JCI Insight. 3 (13), (2018).</li><li>Brewington, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+nasal+epithelial+cell+spheroids+for+individualized+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+study.">Generation of human nasal epithelial cell spheroids for individualized cystic fibrosis transmembrane conductance regulator study.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57492 (2018).</li><li>Brewington, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+CFTR+function+and+modulation+in+primary+human+nasal+cell+spheroids.">Detection of CFTR function and modulation in primary human nasal cell spheroids.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 17 (1), 26-33 (2017).</li><li>Bridges, M. A., Walker, D. C., Davidson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+and+control+nasal+epithelial+cells+harvested+by+a+brushing+procedure.">Cystic fibrosis and control nasal epithelial cells harvested by a brushing procedure.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. 27 (9), 684-686 (1991).</li><li>Bridges, M. A., Walker, D. C., Harris, R. A., Wilson, B. R., Davidson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultured+human+nasal+epithelial+multicellular+spheroids:+polar+cyst-like+model+tissues.">Cultured human nasal epithelial multicellular spheroids: polar cyst-like model tissues.</a> Biochemistry and Cell Biology. 69 (2-3), 102-108 (1991).</li><li>Collie, G., Buchwald, M., Harper, P., Riordan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+sweat+gland+epithelial+cells+from+normal+individuals+and+patients+with+cystic+fibrosis.">Culture of sweat gland epithelial cells from normal individuals and patients with cystic fibrosis.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. 21 (10), 597-602 (1985).</li><li>Conger, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+(CFTR)+and+ciliary+beat+frequency+activation+by+the+CFTR+Modulators+Genistein,+VRT-532,+and+UCCF-152+in+primary+sinonasal+epithelial+cultures.">Comparison of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) and ciliary beat frequency activation by the CFTR Modulators Genistein, VRT-532, and UCCF-152 in primary sinonasal epithelial cultures.</a> JAMA Otolaryngology-Head &amp; Neck Surgery. 139 (8), 822-827 (2013).</li><li>de Courcey, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+primary+human+nasal+epithelial+cell+cultures+for+the+study+of+cystic+fibrosis+pathophysiology.">Development of primary human nasal epithelial cell cultures for the study of cystic fibrosis pathophysiology.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 303 (11), 1173-1179 (2012).</li><li>Gruenert, D. C., Basbaum, C. B., Widdicombe, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+normal+and+cystic+fibrosis+epithelial+cells+grown+under+serum-free+conditions.">Long-term culture of normal and cystic fibrosis epithelial cells grown under serum-free conditions.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. 26 (4), 411-418 (1990).</li><li>Mosler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feasibility+of+nasal+epithelial+brushing+for+the+study+of+airway+epithelial+functions+in+CF+infants.">Feasibility of nasal epithelial brushing for the study of airway epithelial functions in CF infants.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 7 (1), 44-53 (2008).</li><li>Anderson, J. D., Liu, Z., Odom, L. V., Kersh, L., Guimbellot, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFTR+function+and+clinical+response+to+modulators+parallel+nasal+epithelial+organoid+swelling.">CFTR function and clinical response to modulators parallel nasal epithelial organoid swelling.</a> The American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 321 (1), 119-129 (2021).</li><li>Guimbellot, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasospheroids+permit+measurements+of+CFTR-dependent+fluid+transport.">Nasospheroids permit measurements of CFTR-dependent fluid transport.</a> JCI Insight. 2 (22), (2017).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+nasal+epithelial+organoids+for+therapeutic+development+in+cystic+fibrosis.">Human nasal epithelial organoids for therapeutic development in cystic fibrosis.</a> Genes (Basel). 11 (6), (2020).</li><li>Muller, L., Brighton, L. E., Carson, J. L., Fischer, W. A., Jaspers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+of+human+nasal+epithelial+cells+at+the+air+liquid+interface.">Culturing of human nasal epithelial cells at the air liquid interface.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2013).</li><li>Dekkers, J. F., vander Ent, C. K., Beekman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+opportunities+for+CFTR-targeting+drug+development+using+organoids.">Novel opportunities for CFTR-targeting drug development using organoids.</a> Rare Diseases. 1, 27112 (2013).</li><li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+CFTR+assay+using+primary+cystic+fibrosis+intestinal+organoids.">A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids.</a> Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).</li><li>Okiyoneda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism-based+corrector+combination+restores+DeltaF508-CFTR+folding+and+function.">Mechanism-based corrector combination restores DeltaF508-CFTR folding and function.</a> Nature Chemical Biology. 9 (7), 444-454 (2013).</li><li>Schwank, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+repair+of+CFTR+by+CRISPR/Cas9+in+intestinal+stem+cell+organoids+of+cystic+fibrosis+patients.">Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients.</a> Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).</li><li>Geurts, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-based+adenine+editors+correct+nonsense+mutations+in+a+cystic+fibrosis+organoid+biobank.">CRISPR-based adenine editors correct nonsense mutations in a cystic fibrosis organoid biobank.</a> Cell Stem Cell. 26 (4), 503-510 (2020).</li><li>Bove, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+in+vitro+alveolar+type+II+cell+proliferation+barrier+while+retaining+ion+transport+properties.">Breaking the in vitro alveolar type II cell proliferation barrier while retaining ion transport properties.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (4), 767-776 (2014).</li><li>Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+keratinocytes+are+efficiently+immortalized+by+a+Rho+kinase+inhibitor.">Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor.</a> Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2619-2626 (2010).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK+inhibitor+and+feeder+cells+induce+the+conditional+reprogramming+of+epithelial+cells.">ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells.</a> The American Journal of Pathology. 180 (2), 599-607 (2012).</li><li>Palechor-Ceron, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation+induces+diffusible+feeder+cell+factor(s)+that+cooperate+with+ROCK+inhibitor+to+conditionally+reprogram+and+immortalize+epithelial+cells.">Radiation induces diffusible feeder cell factor(s) that cooperate with ROCK inhibitor to conditionally reprogram and immortalize epithelial cells.</a> The American Journal of Pathology. 183 (6), 1862-1870 (2013).</li><li>Scudieri, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionocytes+and+CFTR+chloride+channel+expression+in+normal+and+cystic+fibrosis+nasal+and+bronchial+epithelial+cells.">Ionocytes and CFTR chloride channel expression in normal and cystic fibrosis nasal and bronchial epithelial cells.</a> Cells. 9 (9), (2020).</li><li>Marthin, J. K., Stevens, E. M., Larsen, L. A., Christensen, S. T., Nielsen, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+three-dimensional+explant+spheroids+derived+from+human+nasal+airway+epithelium:+a+simple+methodological+approach+for+ex+vivo+studies+of+primary+ciliary+dyskinesia.">Patient-specific three-dimensional explant spheroids derived from human nasal airway epithelium: a simple methodological approach for ex vivo studies of primary ciliary dyskinesia.</a> Cilia. 6, 3 (2017).</li><li>Blouquit, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+and+fluid+transport+properties+of+small+airways+in+cystic+fibrosis.">Ion and fluid transport properties of small airways in cystic fibrosis.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 174 (3), 299-305 (2006).</li><li>Birket, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+therapy+with+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+modulators+augment+the+airway+functional+microanatomy.">Combination therapy with cystic fibrosis transmembrane conductance regulator modulators augment the airway functional microanatomy.</a> The American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 310 (10), 928-939 (2016).</li><li>Birket, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+anatomic+defect+of+the+cystic+fibrosis+airway.">A functional anatomic defect of the cystic fibrosis airway.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 190 (4), 421-432 (2014).</li><li>Chu, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle-tracking+microrheology+using+micro-optical+coherence+tomography.">Particle-tracking microrheology using micro-optical coherence tomography.</a> Biophysical Journal. 111 (5), 1053-1063 (2016).</li><li>Chu, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.+In+vivo+imaging+of+airway+cilia+and+mucus+clearance+with+micro-optical+coherence+tomography.">et al. In vivo imaging of airway cilia and mucus clearance with micro-optical coherence tomography.</a> Biomedical Optics Express. 7 (7), 2494-2505 (2016).</li><li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+quantitative+study+of+airway+functional+microanatomy+using+micro-optical+coherence+tomography.">Method for quantitative study of airway functional microanatomy using micro-optical coherence tomography.</a> PLoS One. 8 (1), 54473 (2013).</li><li>Tuggle, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+defects+in+ion+transport+and+tissue+development+in+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+(CFTR)-knockout+rats.">Characterization of defects in ion transport and tissue development in cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-knockout rats.</a> PLoS One. 9 (3), 91253 (2014).</li><li>McCravy, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalised+medicine+for+non-classic+cystic+fibrosis+resulting+from+rare+CFTR+mutations.">Personalised medicine for non-classic cystic fibrosis resulting from rare CFTR mutations.</a> European Respiratory Journal. 56 (1), 2000062 (2020).</li><li>Mutyam, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+benefit+observed+with+the+CFTR+potentiator,+ivacaftor,+in+a+CF+patient+homozygous+for+the+W1282X+CFTR+nonsense+mutation.">Therapeutic benefit observed with the CFTR potentiator, ivacaftor, in a CF patient homozygous for the W1282X CFTR nonsense mutation.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 16 (1), 24-29 (2017).</li><li>Corning Inc. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> CORNING CELL-TAK CELL AND TISSUE ADHESIVE. , (2013).</li><li>Anderson, J. D., Liu, Z., Odom, L. V., Kersh, L., Guimbellot, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFTR+function+and+clinical+response+to+modulators+parallel+nasal+epithelial+organoid+swelling.">CFTR function and clinical response to modulators parallel nasal epithelial organoid swelling.</a> The American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 321 (1), 119-129 (2021).</li><li>Biotek Instruments, Incorporated. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Lionheart FX Live Cell Imager Operator's Manual. , (2016).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Simmonds, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+it+cystic+fibrosis?+The+challenges+of+diagnosing+cystic+fibrosis.">Is it cystic fibrosis? The challenges of diagnosing cystic fibrosis.</a> Paediatric Respiratory Reviews. 31, 6-8 (2019).</li><li>McGarry, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+and+in+vitro+ivacaftor+response+in+cystic+fibrosis+patients+with+residual+CFTR+function:+N-of-1+studies.">In vivo and in vitro ivacaftor response in cystic fibrosis patients with residual CFTR function: N-of-1 studies.</a> Pediatric Pulmonology. 52 (4), 472-479 (2017).</li><li>Garratt, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+culture+success+in+an+airway+epithelium+sampling+program+of+young+children+with+cystic+fibrosis.">Determinants of culture success in an airway epithelium sampling program of young children with cystic fibrosis.</a> Experimental Lung Research. 40 (9), 447-459 (2014).</li></ol>

Dit manuscript biedt gedetailleerde methodologieën voor uitgebreide live en vaste beeldvorming van de luchtwegepitheelorganoïden afgeleid van HNE-borstelbiopsie. Het beschrijft functionele assays die cftr-activiteit in een individu kunnen bepalen. HNE's bieden een minimaal invasief, primair weefsel voor een verscheidenheid aan toepassingen. De hier aangeboden expansietechnieken kunnen worden gebruikt voor het modelleren van luchtwegaandoeningen, waaronder organoïden. Organoïden kunnen worden gebruikt voor precisiethe...

Inleiding tot de techniek Ex vivo op cultuur gebaseerde assays zijn een steeds vaker gebruikt hulpmiddel voor precisiegeneeskunde en de studie van ziektepathofysiologie. Primaire humane neusepitheel (HNE) celcultuur is gebruikt in talrijke studies van cystische fibrose 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 , een autosomaal recessieve ziekte die de epitheelcelfunctie in meerdere organen beïnvloedt. HNE-cultuur biedt een hernieuwbare bron van luchtwegepithelia die prospectief kan worden verkregen en vat elektrofysiologische en biochemische kwaliteiten samen om cystic fibrosis transmembraangeleidingsregulator (CFTR) -activiteit te testen. HNE-cellen kunnen worden bemonsterd met minimale bijwerkingen14, vergelijkbaar met gewone virale respiratoire swabs. Onderzoekswerk dat een model beschrijft voor cystische fibrosestudie afgeleid van HNE-borstelbiopten is onlangs gepubliceerd11,13. Vergelijkbaar met andere modellen met primair HNE 2,3 en darmweefsel 15,16,17,18,19, wordt hier gedetailleerde karakterisering van de differentiatie en beeldvorming van dit model beschreven voor gebruik in CF-onderzoek en voor hulp bij de studies van andere luchtwegaandoeningen 13 . Het organoïde model is niet onbeperkt zoals onsterfelijke cellijnen, maar kan worden uitgebreid door voorwaardelijke herprogrammering (met behulp van bestraalde en geïnactiveerde feeder fibroblasten en Rho-kinaseremmers) tot een meer stamcelachtige toestand 20,21,22,23. De verwerking van HNE-borstelbiopten met behulp van deze methode levert grote aantallen epitheelcellen op voor gebruik in meerdere toepassingen met een hogere doorvoer, terwijl het vermogen om volledig te differentiëren behouden blijft. Hoewel dit protocol is ontwikkeld met behulp van feedercellen, kunnen andere methodologieën worden gebruikt door onderzoekers die feederceltechnologie willen vermijden 14,24.
Belang van de techniek voor de longbiologie Een belangrijke studie is gewijd aan het begrijpen hoe de afwezigheid van regelmatige, functionerende CFTR in het celmembraan van epitheelcellen resulteert in disfunctie in de longen, pancreas, lever, darm of andere weefsels. Disfunctioneel epitheelionentransport, met name dat van chloride en bicarbonaat, resulteert in een verminderd volume van de epitheliale voeringvloeistoffen en veranderingen in slijmafscheidingen, wat leidt tot slijmstasis en obstructie. Bij andere luchtwegaandoeningen, zoals primaire ciliaire dyskinesie, schaadt veranderde ciliaire beweging de mucociliaire klaring en leidt tot slijmstasis en obstructie25. Daarom is het huidige HNE-organoïdemodel ontwikkeld voor verschillende toepassingen, afhankelijk van het experimentele ontwerp en de middelen van de onderzoeker. Dit omvat live-cell imaging met behulp van live-cell vlekken; fixatie en sectie om de morfologie te karakteriseren; immunofluorescentiekleuring met antilichamen en confocale beeldvorming in de hele mount om verstoring van intraluminale structuren te voorkomen; en bright-field imaging en micro-optische coherentietomografie voor kwantitatieve metingen van ciliaire slagfrequentie en mucociliair transport13. Om uitbreiding naar andere onderzoekers te vergemakkelijken, werden commercieel beschikbare reagentia en benodigdheden gebruikt voor het kweken. Er werd een functionele test ontwikkeld die gebruik maakte van gangbare microscooptechnieken en meer gespecialiseerde apparatuur. Over het algemeen, terwijl het huidige model is ontworpen om CFTR-activiteit bij baseline of als reactie op therapeutica te beoordelen, kunnen de in dit protocol beschreven technieken worden toegepast op andere ziekten waarbij epitheelcelfunctie betrokken is, met name epitheelcelvloeistoftransport.
Vergelijking met andere methodologieën Onlangs werd het nut van dit organoïdemodel ontwikkeld door in vitro CFTR-modulatorresponsen van organoïden van patiënten te correleren met hun klinische respons11. Met name is ook aangetoond dat het huidige model parallel liep met kortsluitstroomresponsen, de huidige gouden standaard voor het beoordelen van de CFTR-functie, bij dezelfde patiënten. Kortsluitstroom verschilt van de zwellingstest omdat de eerste de CFTR-functie meet via ionentransport26. Deze test meet daarentegen een meer stroomafwaarts effect met vloeistoftransport en geeft aanvullende informatie over de totale functie van CFTR 27,28,29,30,31,32. Kortsluitstroommetingen zijn nog steeds een veelgebruikte en betrouwbare methode voor het bepalen van cftr-chloridekanaalactiviteit 1,33. Deze elektrofysiologische assays vereisen gespecialiseerde, dure apparatuur, vereisen vele malen meer cellen voor elke experimentele replicatie dan de organoïde assay, kunnen niet gemakkelijk worden geautomatiseerd en zijn niet vatbaar voor opschaling voor toepassingen met een hogere doorvoer. Een ander organoïde model afgeleid van intestinale epithelia heeft extra voordelen 15,16,17,18, zoals een meer uitstekend replicerend vermogen, maar is niet afgeleid van een luchtwegweefsel en is ook niet universeel beschikbaar. HNE-borstels worden verkregen met goedkope cytologieborstels zonder de noodzaak van sedatie en met minimaal risico. Het krijgen van het poetsen vereist geen clinicus en kan worden uitgevoerd door getrainde onderzoekscoördinatoren en ander onderzoekspersoneel14. Het HNE-organoïdemodel kan worden gekweekt door elk laboratorium met primaire celkweekmogelijkheden en sommige toepassingen kunnen worden uitgevoerd met standaardmicroscopietechnieken. Al met al bieden deze voordelen extra toegang tot technologie voor het beoordelen van de luchtwegepitheelfunctie die anders misschien niet beschikbaar zou zijn voor sommige laboratoria. Bovendien kunnen HNE-organoïden worden gebruikt om andere ziektetoestanden te bestuderen die de luchtwegen beïnvloeden, zoals primaire ciliaire dyskinesie25 of virale infectie, die intestinale organoïden niet kunnen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Nasal brush</td>
			<td>Medical Packaging CYB1</td>
			<td>CYB-1</td>
			<td>Length: 8 inches, width approximately 7 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large-Orifice Pipette Tips</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>02-707-141</td>
			<td>Large bore pipette tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>Cell detachment solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% trypsin -EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor from soybean</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6522</td>
			<td>Working solution: 1mg/mL in 1XDPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356255</td>
			<td>Extracellular matrix (EM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide Angiogenesis</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81506</td>
			<td>15-well slide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-Well Transwell</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7200154</td>
			<td>Culture insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chambered Coverglass</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>155409</td>
			<td>8-well glass-bottom chamber slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>354240</td>
			<td>Cell adhesive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>50980487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A16046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucBlue</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>R37605</td>
			<td>DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ts2-FL (Inverted Routine Microscope)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Inverted epi-fluorescence microscope or bright-field microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R-HD25</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements- Basic Research</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>manual imaging analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histogel</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Base Molds</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>41-740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lionheart FX</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BTLFX</td>
			<td>Automated image system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lionheart Cover</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1450009</td>
			<td>Environmental Control Lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity Chamber</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1450006</td>
			<td>Stage insert (environmental chamber)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Controller for CO2 and O2</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1210013</td>
			<td>Gas controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate/Slide Stage Insert</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1450527</td>
			<td>Slide holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5 Imaging Prime Software</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BTGEN5IPRIM</td>
			<td>Automated imaging analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x Phase Contrast Objective</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1320515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Phase Contrast Objective</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1320516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED Cube</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1225007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Cube (DAPI)</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1225100</td>
			<td>DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFTRinh-172</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S7139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBMX</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expansion Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12 Nutrient mix</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;16140-071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;15-140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;C8052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;PHG0314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone (HC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;H0888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;A2786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>&#160;04-0012-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceftazidime</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>&#160;J66460-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tobramycin</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>&#160;J67340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vancomycin</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>&#160;J67251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Differentiation Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 (1:1)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;11330-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultroser-G</td>
			<td>Pall</td>
			<td>&#160;15950-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Clone II</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>&#160;SH30066.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Brain Extract</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>&#160;CC-4098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;I-9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;H-0888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triiodothyronine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;T-6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;T-0665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanolamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;E-0135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epinephrine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-4250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-Phosphorylethanolamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R-2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human CFTR antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB1660</td>
			<td>Dilution: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZO-1 antibody</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>MA3-39100-A647</td>
			<td>Dilution: 1000x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MUC5B antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HPA008246</td>
			<td>Dilution: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-acetylated tubulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7451</td>
			<td>Dilution: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-beta IV Tubulin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab11315</td>
			<td>Dilution: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21202</td>
			<td>Dilution: 2000x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21207</td>
			<td>Dilution: 2000x</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture and imaging of human nasal epithelial organoids

Geïndividualiseerde therapie voor patiënten met cystische fibrose (CF) kan worden bereikt met een in vitro ziektemodel om de baseline Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator (CFTR) activiteit en herstel van kleine molecuulverbindingen te begrijpen. Onze groep heeft zich onlangs gericht op het opzetten van een goed gedifferentieerd organoïdemodel dat rechtstreeks is afgeleid van primaire menselijke neusepitheelcellen (HNE). Histologie van gesneden organoïden, whole-mount immunofluorescente kleuring en beeldvorming (met behulp van confocale microscopie, immunofluorescente microscopie en helder veld) zijn essentieel om organoïden te karakteriseren en epitheliale differentiatie te bevestigen ter voorbereiding op functionele assays. Bovendien produceren HNE-organoïden lumen van verschillende grootte die correleren met CFTR-activiteit, waarbij onderscheid wordt gemaakt tussen CF- en niet-CF-organoïden. In dit manuscript wordt de methodologie voor het kweken van HNE-organoïden in detail beschreven, met de nadruk op de beoordeling van differentiatie met behulp van de beeldvormingsmodaliteiten, waaronder de meting van het lumengebied (een methode voor CFTR-activiteitsmeting in organoïden die elk laboratorium met een microscoop kan gebruiken) evenals de ontwikkelde geautomatiseerde benadering van een functionele test (die meer gespecialiseerde apparatuur vereist).

De uitbreiding van HNE's is essentieel voor een bloeiende organoïde cultuur. HNE's van een succesvolle monsterverzameling moeten zich rond 10 dagen uitbreiden tot meer dan 70% samenvloeiing. Een voorbeeld van succesvolle en niet-succesvolle steekproeven is weergegeven in respectievelijk figuur 1A en figuur 1B. De cellen moeten worden weggegooid als ze 14 dagen na cocultuur met bestraalde 3T3-cellen geen 70% confluentie kunnen bereiken. Alle bes...

Watch this Scientific Journal Video about Culture and Imaging of Human Nasal Epithelial Organoids at JoVE.com

Culture and Imaging of Human Nasal Epithelial Organoids

Een gedetailleerd protocol wordt hier gepresenteerd om een in vitro organoïde model van menselijke neusepitheelcellen te beschrijven. Het protocol heeft opties voor metingen die standaard laboratoriumapparatuur vereisen, met extra mogelijkheden voor gespecialiseerde apparatuur en software.

Cultuur en beeldvorming van menselijke nasale epitheliale organoïden

Individualized therapy for cystic fibrosis (CF) patients can be achieved with an in vitro disease model to understand baseline Cystic Fibrosis ...

Geïndividualiseerde therapie voor patiënten met cystische fibrose kan worden bereikt door een in vitro ziektemodel om de CFTR-activiteit bij baseline te begrijpen. Menselijke nasale epitheliale organoïden, of HNE-organoïden, produceren lumen van verschillende grootte die correleren met de CFTR-activiteit, waarbij onderscheid wordt gemaakt tussen CF- en niet-CF-organoïden. Hier hebben we een methodologie beschreven voor het kweken en in beeld brengen van deze HNE-organoïden in detail.Disfunctioneel epitheelionentransport, met name dat van chloride en bicarbonaat, resulteert in een verminderd volume van de epitheliale voeringvloeistoffen. Dit beïnvloedt ook de slijmafscheidingen die leiden tot mucostase en obstructie. Daarom is ons HNE-model ontwikkeld voor verschillende toepassingen, afhankelijk van het experimentele ontwerp en de middelen van de onderzoeker.Afgezien van het beoordelen van CFTR-activiteit bij baseline of als reactie op therapeutica, kan deze techniek ook worden toegepast op andere ziekten waarbij de epitheelcelfunctie betrokken is, met name epitheelcelvloeistoftransport. Deze methoden zijn voornamelijk ontwikkeld voor gebruik in cystic fibrosis studies. Andere studies die de luchtwegepithelia evalueren, zoals primaire ciliaire dyskinesie, kunnen deze methoden ook nuttig vinden.Deze technieken vereisen aandacht voor detail en precisie. Ze vereisen ook zorgvuldige observatie om ervoor te zorgen dat de initiële uitbreiding van cellen geschikt is. Houd alle culturen elke dag in de gaten en het succes zal waarschijnlijker zijn.Dissociëer om te beginnen de neusborstelbiopsie in 8 milliters RPMI-media in een conische buis van 15 milliliter door de cytologieborstel meerdere keren door een pipetpunt met één milliliter met grote boring te laten gaan. Centrifugeer de cellen gedurende vijf minuten bij 500 maal g bij vier graden Celsius. Gooi het supernatant weg en suspensie de celkorrel opnieuw in drie milliliter celloslatingsoplossing.Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 16 minuten om te verteren. Gebruik vijf milliliter van de expansiemedia om de cellen twee keer te wassen. Voeg ze vervolgens toe aan een T75-kolf, voorgezaaid met doorstraalde, geïnactiveerde en 50 tot 60% confluente 3T3-fibroblasten.Laat de cellen gedurende 7 tot 14 dagen samenknijpen en uitzetten in de expansiemedia. Als antibiotica werden geïntroduceerd voor cellen afkomstig van patiënten met cystische fibrose, moeten de media na de eerste drie dagen van de kweek worden vervangen door antibioticavrije expansiemedia en kunnen ze de media om de twee dagen blijven veranderen tot 80% confluent. Was de cellen met 1x DPBS.Voeg vervolgens 1,5 milliliter van 0,05% trypsine-EDTA toe aan de T75-kolf en incubeer gedurende vier minuten bij 37 graden Celsius om de bestraalde en geïnactiveerde 3T3-fibroblast uit de kweek te verwijderen. Spoel de T75-kolf tweemaal met 1x DPBS om de resterende 3T3-fibroblasten grondig weg te spoelen. Voeg 1,5 milliliter van 0,05% trypsine-EDTA toe aan de T75-kolf en incubeer gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius om HNE's los te maken.Neutraliseer de trypsine met soja-trypsineremmer in een één-op-één verhouding. Centrifugeer de cellen gedurende vijf minuten op 500 keer gi. Gooi vervolgens het supernatant weg en was de cellen eenmaal met vijf milliliter expansiemedia.De cellen zijn nu klaar voor zaaien om organoïden te laten groeien. Ontdooi de organoïde cultuur extracellulaire matrix of ECM 's nachts bij vier graden Celsius. Koel de 15-well angiogenese 's nachts af bij dezelfde temperatuur.Koel vervolgens de pipetpunten af tot vier graden Celsius. Bestrijk de platen met vijf microliter koude 100% ECM op ijs. Plaats ze minstens 30 minuten in een celkweekincubator bij 37 graden Celsius voor consolidatie.Tel de HNE's geoogst uit co-cultuur met behulp van een hemocytometer. Verdun vervolgens de cellen tot 500 cellen per microliter in totaal aantal, met 20% ECM verdund door differentiatiemedia op ijs. Haal de met ECM gecoate glijbanen uit de incubator en zaad vijf microliter van het koude cel ECM-mengsel in elk van de putten.Breng de dia's onmiddellijk over in een kweekincubator bij 37 graden Celsius gedurende een uur om het cel-ECM-mengsel te consolideren. Haal daarna de dia's uit de incubator en voer de cellen in elke put van de 15-well angiogenese-dia's met 50 microliter van de differentiatiemedia. Breng de dia terug in de kweekincubator bij 37 graden Celsius en verander de media om de andere dag totdat de organoïden klaar zijn voor verdere experimenten.Behandel de 8-well glazen bodemkamerglijden gedurende 30 minuten voor met cellijm. Gooi de oplossing weg en droog de putten nog eens 30 minuten aan de lucht. Gooi vervolgens de media van de bovenkant van de ECU weg en voeg vervolgens 50 microliter van de koude 1x PBS toe aan elke put van de 15-putglijbanen op ijs.Pipetteer drie tot vijf keer op en neer met 200 microliter van de pipetpunt met grote boring. Doseer de oplossing op het midden van een put van de 8-putkamerglijbanen. Verwijder de overtollige vloeistof onmiddellijk uit de putjes met een pipet met fijne punt.Plaats vervolgens de kamerschuif gedurende 40 minuten in een incubator van 37 graden Celsius om de organoïde die zich aan de glazen bodem hecht te verbeteren. Was de organoïden na 40 minuten voorzichtig tweemaal met 1x PBS en bevestig ze met 300 microliter 4% paraformaldehyde in elke put gedurende 30 minuten stel de kamertemperatuur in. Was tweemaal met 1x PBS en bewaar de organoïden in 1x PBS-set vier graden Celsius voor immunostaining gedurende maximaal twee weken.Om de organoïden te oogsten voor histologisch onderzoek, verwijdert u de media uit de cultuur en voegt u 50 microliter koude één 1x PBS toe aan elke put van de dia's op ijs. Pipetteer drie tot vijf keer op en neer met behulp van een pipetpunt met een grote boring van 200 microliter. Combineer alle oplossingen van de 15-well slide of kweekinzetstukken in een conische buis van 15 milliliter op ijs.Stel het totale oplossingsvolume in de buis in op 10 milliliter door koude 1x PBS toe te voegen. Centrifugeer de buis bij vier graden Celsius, 300 keer g gedurende vijf minuten. Adem vervolgens het supernatant uit en voeg 60 microliter warme histogel toe om te mengen met de organoïde pellet met behulp van een pipetpunt met grote boring van 200 microliter.Breng de suspensie onmiddellijk over naar een histologiemal. Na het consolideren van de histogel bij kamertemperatuur, plaatst u het schimmelblok in 4% paraformaldehyde voor fixatie 's nachts bij vier graden Celsius. Open de software en klik met de rechtermuisknop onder aan het scherm.Selecteer vervolgens Analysebesturingselementen, gevolgd door Geautomatiseerde meetresultaten. Open het organoïdebeeld en selecteer 5 tot 10 organoïden met zichtbare lumen. Klik met de rechtermuisknop op de afbeelding om het menu te openen en selecteer Polygonale ROI om de volledige organoïde te schetsen om het totale oppervlak van de organoïde te verkrijgen.Schets vervolgens het lumen om het lumengebied te verkrijgen. Herhaal dit voor de resterende organoïden in de put en alle putten in de test. Exporteer ten slotte de gegevens naar Excel.Deel het lumengebied door het totale oppervlak en gemiddelde van alle organoïden uit het monster om de lumenverhouding van de basislijn te krijgen. De heldere veldafbeeldingen vertegenwoordigen HNE's uit een succesvolle en onsuccesvolle monsterverzameling. De HNE's groeien goed in een groot cluster.De HNE's groeien daarentegen slecht in twee kleine clusters rond de bestraalde 3T3-cellen. Organoïden in de 15-well dia hebben nauwkeurigere en scherpere beelden dan die in de kweekinzet. Daarnaast werd geen significant morfologisch verschil waargenomen in deze twee kweekmethoden.Niet-CF-organoïden hebben meestal een groter lumen en meer vloeistof dan CF-organoïden. De HNE-kleuring in organoïden van een niet-CF, F508del/F508del-proefpersoon en de immunofluorescente kleuring van trilharen in een organoïde zijn in deze afbeeldingen weergegeven. De trilharen gekleurd met geacetyleerd tubuline, FITC gelabeld secundair antilichaam en de kernen gelabeld met DAPI worden hier getoond.Maximale projectiebeelden van de twee representatieve organoïden door immunofluorescente kleuring met hele vatting en hun bijbehorende driedimensionale reconstructiebeelden worden hier getoond. Slijm en trilharen in het lumen van de organoïden worden getoond. De grafische afbeeldingen vertegenwoordigen de forskoline-geïnduceerde zwellingstest om de CFTR-functie op de primaire neusepitheelcellen te testen.Een representatief forskoline dosis-respons experiment van niet-CF vrijwilligers wordt hier getoond. FSK dosis-respons wordt vergeleken met de gemiddelde fractionele verandering na één uur, versus na acht uur, wat suggereert dat de acht uur durende test een significanter zwellingsverschil tussen verschillende FSK-doses kan veroorzaken dan die na één uur. Het gebied onder de curve kan een klein verschil in zwelling vertonen in vergelijking met de gemiddelde fractionele verandering na acht uur.Houd er bij het proberen van deze procedure rekening mee dat organoïden verloren gaan tijdens het verzamel-, fixatie- en kleuringsproces. Er moet dus zorgvuldig worden gezorgd tijdens elke stap en er moeten voldoende startnummers worden verkregen om succes te garanderen. Het kweken van organoïden in kweekinzetstukken kan in dit opzicht helpen, omdat deze technieken worden ontwikkeld.Hier hebben we commercieel beschikbare reagentia en benodigdheden gebruikt om uitbreiding naar andere onderzoekers te vergemakkelijken. Er werd ook een functionele test ontwikkeld die gebruik maakte van gangbare microscooptechnieken en meer gespecialiseerde apparatuur.

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

Isolatie, cultuur en beeldvorming van humane foetale Alvleesklierkanker celclusters

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

Primary Culture of Human Vestibular Schwannomas

Primaire cultuur van de mens Vestibular Schwannomen

Vestibular schwannomas (VSs) represent Schwann cell (SC) tumors of the vestibular nerve, compromising 10% of all intracranial neoplasms. VSs occur in ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Isolatie, cryopreservatie en cultuur van de mens Amnion epitheelcellen voor klinische toepassingen

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Establishment of Human Epithelial Enteroids and Colonoids from Whole Tissue and Biopsy

Oprichting van Human Epithelial Enteroids en Colonoids van Whole Tissue en Biopsie

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem ...

Absorption of Nasal and Bronchial Fluids: Precision Sampling of the Human Respiratory Mucosa and Laboratory Processing of Samples

Absorptie van vloeistoffen nasale en bronchiale: Precision bemonstering van de menselijke respiratoire Mucosa en laboratorium verwerking van de monsters

The methods of nasal absorption (NA) and bronchial absorption (BA) use synthetic absorptive matrices (SAM) to absorb the mucosal lining fluid (MLF) of the ...

Standardized Measurement of Nasal Membrane Transepithelial Potential Difference (NPD)

Standardized Measurement of Nasal Membrane Transepithelial Potential Difference NPD

Gestandaardiseerde meting van nasale membraan Transepithelial potentieel verschil (NPD)

We describe a standardized measurement of nasal potential difference (NPD). In this technique, cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) ...

Generation of Human Nasal Epithelial Cell Spheroids for Individualized Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Study

Generatie van menselijke nasale epitheliale cel spheroïden voor geïndividualiseerde Cystic Fibrosis Transmembrane huidgeleiding Regulator studie

While the introduction of Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) modulator drugs has revolutionized care in Cystic Fibrosis (CF), the ...

Muscle Imbalances: Testing and Training Functional Eccentric Hamstring Strength in Athletic Populations

Spier onevenwichtigheden: Testen en functionele excentrieke Hamstring sterkte in atletische populaties opleiding

Many hamstring injuries that occur during physical activity occur while the muscles are lengthening, during eccentric hamstring muscle actions. Opposite ...

Quantitative Mapping of Specific Ventilation in the Human Lung using Proton Magnetic Resonance Imaging and Oxygen as a Contrast Agent

Kwantitatieve mapping van specifieke ventilatie in de menselijke Long met behulp van Proton Magnetic Resonance Imaging en zuurstof als een contrast middel

Specific ventilation imaging (SVI) is a functional magnetic resonance imaging technique capable of quantifying specific ventilation &#8213; the ratio of ...

A Fluorescence-based Assay for Characterization and Quantification of Lipid Droplet Formation in Human Intestinal Organoids

Een op fluorescentie gebaseerde assay voor de karakterisering en kwantificering van de vorming van lipiden druppeltjes in humane intestinale Organoïden