Name: culture and imaging of human nasal epithelial organoids
Uploaded: 2021-12-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culture and Imaging of Human Nasal Epithelial Organoids at JoVE.com

Nous remercions tous les participants qui ont fait don de biopsies à la brosse HNE pour développer ce protocole. Nous remercions Latona Kersh et le personnel de l’Unité de recherche pour enfants d’avoir coordonné le recrutement de volontaires de l’étude et les collectes d’échantillons. Nous remercions Lily Deng, Johnathan Bailey et Stephen Mackay, anciens stagiaires de notre laboratoire, pour leur assistance technique. Nous remercions Zhong Liu et Rui Zhao pour leur aide technique. Steven M. Rowe, directeur du Centre de recherche sur les FC à l’UAB, fournit un leadership et des ressources sans lesquels ce travail ne serait pas possible. Nous tenons également à remercier Sarah Guadiana de Biotek pour son aide à la formation aux instruments, Robert Grabski pour l’assistance en microscopie confocale au centre d’imagerie haute résolution de l’UAB et Dezhi Wang pour son assistance histologique au noyau d’histologie de l’UAB. Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health (NIH). Grant K23HL143167 (à JSG), Cystic Fibrosis Foundation (CFF), Grant GUIMBE18A0-Q (à JSG), le Gregory Fleming James Cystic Fibrosis Center [NIH Grants R35HL135816 et DK072482 et le CFF University of Alabama at Birmingham (UAB) Research and Development Program (Rowe19RO)], et le UAB Center for Clinical and Translational Science (NIH Grant UL1TR001417).

Des échantillons de HNE ont été prélevés à l’hôpital Children’s of Alabama. Toutes les procédures et méthodes décrites ici ont été approuvées par l’IRB University of Alabama à Birmingham (UAB IRB #151030001). Pour faciliter l’expansion et améliorer la fonction des cellules épithéliales nasales humaines (HNE), les méthodes de culture actuelles sont adaptées de la méthode de culture bien connue de l’interface air-liquide (ALI)28,34. Le...

<ol>
	<li>Brewington, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brushed+nasal+epithelial+cells+are+a+surrogate+for+bronchial+epithelial+CFTR+studies.">Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies.</a> JCI Insight. 3 (13), (2018).</li><li>Brewington, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+nasal+epithelial+cell+spheroids+for+individualized+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+study.">Generation of human nasal epithelial cell spheroids for individualized cystic fibrosis transmembrane conductance regulator study.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57492 (2018).</li><li>Brewington, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+CFTR+function+and+modulation+in+primary+human+nasal+cell+spheroids.">Detection of CFTR function and modulation in primary human nasal cell spheroids.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 17 (1), 26-33 (2017).</li><li>Bridges, M. A., Walker, D. C., Davidson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+and+control+nasal+epithelial+cells+harvested+by+a+brushing+procedure.">Cystic fibrosis and control nasal epithelial cells harvested by a brushing procedure.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. 27 (9), 684-686 (1991).</li><li>Bridges, M. A., Walker, D. C., Harris, R. A., Wilson, B. R., Davidson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultured+human+nasal+epithelial+multicellular+spheroids:+polar+cyst-like+model+tissues.">Cultured human nasal epithelial multicellular spheroids: polar cyst-like model tissues.</a> Biochemistry and Cell Biology. 69 (2-3), 102-108 (1991).</li><li>Collie, G., Buchwald, M., Harper, P., Riordan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+sweat+gland+epithelial+cells+from+normal+individuals+and+patients+with+cystic+fibrosis.">Culture of sweat gland epithelial cells from normal individuals and patients with cystic fibrosis.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. 21 (10), 597-602 (1985).</li><li>Conger, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+(CFTR)+and+ciliary+beat+frequency+activation+by+the+CFTR+Modulators+Genistein,+VRT-532,+and+UCCF-152+in+primary+sinonasal+epithelial+cultures.">Comparison of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) and ciliary beat frequency activation by the CFTR Modulators Genistein, VRT-532, and UCCF-152 in primary sinonasal epithelial cultures.</a> JAMA Otolaryngology-Head &amp; Neck Surgery. 139 (8), 822-827 (2013).</li><li>de Courcey, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+primary+human+nasal+epithelial+cell+cultures+for+the+study+of+cystic+fibrosis+pathophysiology.">Development of primary human nasal epithelial cell cultures for the study of cystic fibrosis pathophysiology.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 303 (11), 1173-1179 (2012).</li><li>Gruenert, D. C., Basbaum, C. B., Widdicombe, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+normal+and+cystic+fibrosis+epithelial+cells+grown+under+serum-free+conditions.">Long-term culture of normal and cystic fibrosis epithelial cells grown under serum-free conditions.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. 26 (4), 411-418 (1990).</li><li>Mosler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feasibility+of+nasal+epithelial+brushing+for+the+study+of+airway+epithelial+functions+in+CF+infants.">Feasibility of nasal epithelial brushing for the study of airway epithelial functions in CF infants.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 7 (1), 44-53 (2008).</li><li>Anderson, J. D., Liu, Z., Odom, L. V., Kersh, L., Guimbellot, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFTR+function+and+clinical+response+to+modulators+parallel+nasal+epithelial+organoid+swelling.">CFTR function and clinical response to modulators parallel nasal epithelial organoid swelling.</a> The American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 321 (1), 119-129 (2021).</li><li>Guimbellot, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasospheroids+permit+measurements+of+CFTR-dependent+fluid+transport.">Nasospheroids permit measurements of CFTR-dependent fluid transport.</a> JCI Insight. 2 (22), (2017).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+nasal+epithelial+organoids+for+therapeutic+development+in+cystic+fibrosis.">Human nasal epithelial organoids for therapeutic development in cystic fibrosis.</a> Genes (Basel). 11 (6), (2020).</li><li>Muller, L., Brighton, L. E., Carson, J. L., Fischer, W. A., Jaspers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+of+human+nasal+epithelial+cells+at+the+air+liquid+interface.">Culturing of human nasal epithelial cells at the air liquid interface.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2013).</li><li>Dekkers, J. F., vander Ent, C. K., Beekman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+opportunities+for+CFTR-targeting+drug+development+using+organoids.">Novel opportunities for CFTR-targeting drug development using organoids.</a> Rare Diseases. 1, 27112 (2013).</li><li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+CFTR+assay+using+primary+cystic+fibrosis+intestinal+organoids.">A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids.</a> Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).</li><li>Okiyoneda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism-based+corrector+combination+restores+DeltaF508-CFTR+folding+and+function.">Mechanism-based corrector combination restores DeltaF508-CFTR folding and function.</a> Nature Chemical Biology. 9 (7), 444-454 (2013).</li><li>Schwank, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+repair+of+CFTR+by+CRISPR/Cas9+in+intestinal+stem+cell+organoids+of+cystic+fibrosis+patients.">Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients.</a> Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).</li><li>Geurts, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-based+adenine+editors+correct+nonsense+mutations+in+a+cystic+fibrosis+organoid+biobank.">CRISPR-based adenine editors correct nonsense mutations in a cystic fibrosis organoid biobank.</a> Cell Stem Cell. 26 (4), 503-510 (2020).</li><li>Bove, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+in+vitro+alveolar+type+II+cell+proliferation+barrier+while+retaining+ion+transport+properties.">Breaking the in vitro alveolar type II cell proliferation barrier while retaining ion transport properties.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (4), 767-776 (2014).</li><li>Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+keratinocytes+are+efficiently+immortalized+by+a+Rho+kinase+inhibitor.">Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor.</a> Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2619-2626 (2010).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK+inhibitor+and+feeder+cells+induce+the+conditional+reprogramming+of+epithelial+cells.">ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells.</a> The American Journal of Pathology. 180 (2), 599-607 (2012).</li><li>Palechor-Ceron, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation+induces+diffusible+feeder+cell+factor(s)+that+cooperate+with+ROCK+inhibitor+to+conditionally+reprogram+and+immortalize+epithelial+cells.">Radiation induces diffusible feeder cell factor(s) that cooperate with ROCK inhibitor to conditionally reprogram and immortalize epithelial cells.</a> The American Journal of Pathology. 183 (6), 1862-1870 (2013).</li><li>Scudieri, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionocytes+and+CFTR+chloride+channel+expression+in+normal+and+cystic+fibrosis+nasal+and+bronchial+epithelial+cells.">Ionocytes and CFTR chloride channel expression in normal and cystic fibrosis nasal and bronchial epithelial cells.</a> Cells. 9 (9), (2020).</li><li>Marthin, J. K., Stevens, E. M., Larsen, L. A., Christensen, S. T., Nielsen, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+three-dimensional+explant+spheroids+derived+from+human+nasal+airway+epithelium:+a+simple+methodological+approach+for+ex+vivo+studies+of+primary+ciliary+dyskinesia.">Patient-specific three-dimensional explant spheroids derived from human nasal airway epithelium: a simple methodological approach for ex vivo studies of primary ciliary dyskinesia.</a> Cilia. 6, 3 (2017).</li><li>Blouquit, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+and+fluid+transport+properties+of+small+airways+in+cystic+fibrosis.">Ion and fluid transport properties of small airways in cystic fibrosis.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 174 (3), 299-305 (2006).</li><li>Birket, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+therapy+with+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+modulators+augment+the+airway+functional+microanatomy.">Combination therapy with cystic fibrosis transmembrane conductance regulator modulators augment the airway functional microanatomy.</a> The American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 310 (10), 928-939 (2016).</li><li>Birket, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+anatomic+defect+of+the+cystic+fibrosis+airway.">A functional anatomic defect of the cystic fibrosis airway.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 190 (4), 421-432 (2014).</li><li>Chu, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle-tracking+microrheology+using+micro-optical+coherence+tomography.">Particle-tracking microrheology using micro-optical coherence tomography.</a> Biophysical Journal. 111 (5), 1053-1063 (2016).</li><li>Chu, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.+In+vivo+imaging+of+airway+cilia+and+mucus+clearance+with+micro-optical+coherence+tomography.">et al. In vivo imaging of airway cilia and mucus clearance with micro-optical coherence tomography.</a> Biomedical Optics Express. 7 (7), 2494-2505 (2016).</li><li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+quantitative+study+of+airway+functional+microanatomy+using+micro-optical+coherence+tomography.">Method for quantitative study of airway functional microanatomy using micro-optical coherence tomography.</a> PLoS One. 8 (1), 54473 (2013).</li><li>Tuggle, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+defects+in+ion+transport+and+tissue+development+in+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+(CFTR)-knockout+rats.">Characterization of defects in ion transport and tissue development in cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-knockout rats.</a> PLoS One. 9 (3), 91253 (2014).</li><li>McCravy, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalised+medicine+for+non-classic+cystic+fibrosis+resulting+from+rare+CFTR+mutations.">Personalised medicine for non-classic cystic fibrosis resulting from rare CFTR mutations.</a> European Respiratory Journal. 56 (1), 2000062 (2020).</li><li>Mutyam, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+benefit+observed+with+the+CFTR+potentiator,+ivacaftor,+in+a+CF+patient+homozygous+for+the+W1282X+CFTR+nonsense+mutation.">Therapeutic benefit observed with the CFTR potentiator, ivacaftor, in a CF patient homozygous for the W1282X CFTR nonsense mutation.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 16 (1), 24-29 (2017).</li><li>Corning Inc. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> CORNING CELL-TAK CELL AND TISSUE ADHESIVE. , (2013).</li><li>Anderson, J. D., Liu, Z., Odom, L. V., Kersh, L., Guimbellot, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFTR+function+and+clinical+response+to+modulators+parallel+nasal+epithelial+organoid+swelling.">CFTR function and clinical response to modulators parallel nasal epithelial organoid swelling.</a> The American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 321 (1), 119-129 (2021).</li><li>Biotek Instruments, Incorporated. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Lionheart FX Live Cell Imager Operator's Manual. , (2016).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Simmonds, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+it+cystic+fibrosis?+The+challenges+of+diagnosing+cystic+fibrosis.">Is it cystic fibrosis? The challenges of diagnosing cystic fibrosis.</a> Paediatric Respiratory Reviews. 31, 6-8 (2019).</li><li>McGarry, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+and+in+vitro+ivacaftor+response+in+cystic+fibrosis+patients+with+residual+CFTR+function:+N-of-1+studies.">In vivo and in vitro ivacaftor response in cystic fibrosis patients with residual CFTR function: N-of-1 studies.</a> Pediatric Pulmonology. 52 (4), 472-479 (2017).</li><li>Garratt, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+culture+success+in+an+airway+epithelium+sampling+program+of+young+children+with+cystic+fibrosis.">Determinants of culture success in an airway epithelium sampling program of young children with cystic fibrosis.</a> Experimental Lung Research. 40 (9), 447-459 (2014).</li></ol>

Ce manuscrit fournit des méthodologies détaillées pour l’imagerie complète en direct et fixe des organoïdes épithéliaux des voies respiratoires dérivés de la biopsie par brosse HNE. Il décrit les tests fonctionnels qui peuvent déterminer l’activité CFTR chez un individu. Les HNE fournissent un tissu primaire peu invasif pour une variété d’applications. Les techniques d’expansion proposées ici peuvent être utilisées pour modéliser les maladies des voies respiratoires, y compris les organoïdes. L...

Introduction à la technique Les tests basés sur la culture ex vivo sont un outil de plus en plus utilisé pour la médecine de précision et l’étude de la physiopathologie des maladies. La culture épithéliale nasale humaine primaire (HNE) a été utilisée dans de nombreuses études sur la fibrose kystique 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 , une maladie autosomique récessive qui affecte la fonction des cellules épithéliales dans plusieurs organes. La culture HNE fournit une source renouvelable d’épithélium des voies respiratoires qui peut être obtenue prospectivement et récapitule les qualités électrophysiologiques et biochimiques pour tester l’activité du régulateur de conductance transmembranaire de la fibrose kystique (CFTR). Les cellules HNE peuvent être échantillonnées avec des effets secondaires minimes14, similaires aux écouvillons respiratoires viraux courants. Des travaux de recherche décrivant un modèle d’étude sur la fibrose kystique dérivé de biopsies à la brosse HNE ont été récemment publiés11,13. Bien que similaire à d’autres modèles utilisantl’HNE primaire 2,3 et le tissu intestinal 15,16,17,18,19, la caractérisation détaillée de la différenciation et de l’imagerie de ce modèle est décrite ici pour une utilisation dans la recherche sur la FK et pour aider aux études d’autres maladies des voies respiratoires 13 . Le modèle organoïde n’est pas illimité comme les lignées cellulaires immortalisées, mais peut être étendu par reprogrammation conditionnelle (en utilisant des fibroblastes d’alimentation irradiés et inactivés et des inhibiteurs de rho-kinase) à un état plus semblable à celui des cellules souches 20,21,22,23. Le traitement des biopsies au pinceau HNE à l’aide de cette méthode produit un grand nombre de cellules épithéliales pour une utilisation dans de multiples applications à un débit plus élevé tout en conservant la capacité de se différencier pleinement. Bien que ce protocole ait été élaboré à l’aide de cellules nourricières, d’autres méthodologies peuvent être utilisées par les chercheurs qui souhaitent éviter la technologie des cellules d’alimentation 14,24.
Importance de la technique pour la biologie pulmonaire Une étude importante a été consacrée à la compréhension de la façon dont l’absence de CFTR régulier et fonctionnel dans la membrane cellulaire des cellules épithéliales entraîne un dysfonctionnement des poumons, du pancréas, du foie, de l’intestin ou d’autres tissus. Le transport dysfonctionnel des ions épithéliaux, en particulier celui du chlorure et du bicarbonate, entraîne une diminution du volume des fluides de la muqueuse épithéliale et des modifications des sécrétions muqueuses, entraînant une stase muqueuse et une obstruction. Dans d’autres maladies des voies respiratoires, telles que la dyskinésie ciliaire primaire, une altération du mouvement ciliaire altère la clairance mucociliaire et entraîne une stase muqueuse et une obstruction25. Par conséquent, le modèle organoïde HNE actuel a été développé pour diverses applications, en fonction de la conception expérimentale et des ressources de l’investigateur. Cela comprend l’imagerie de cellules vivantes à l’aide de taches de cellules vivantes; fixation et sectionnement pour caractériser la morphologie; coloration par immunofluorescence avec des anticorps et imagerie confocale à montage entier pour éviter de perturber les structures intraluminales; et l’imagerie en champ lumineux et la tomographie par cohérence micro-optique pour les mesures quantitatives de la fréquence des battements ciliaires et du transport mucociliaire13. Pour faciliter l’expansion à d’autres chercheurs, des réactifs et des fournitures disponibles dans le commerce ont été utilisés pour la culture. Un test fonctionnel a été développé qui utilisait des techniques de microscope courantes et un équipement plus spécialisé. Dans l’ensemble, bien que le présent modèle ait été conçu pour évaluer l’activité du CFTR au départ ou en réponse à des traitements, les techniques décrites dans ce protocole peuvent être appliquées à d’autres maladies impliquant la fonction des cellules épithéliales, en particulier le transport du liquide cellulaire épithélial.
Comparaison avec d’autres méthodologies Récemment, l’utilité de ce modèle organoïde a été développée en corrélant les réponses in vitro du modulateur CFTR des organoïdes des patients avec leur réponse clinique11. Notamment, il est également démontré que le modèle actuel était parallèle aux réponses de courant de court-circuit, l’étalon-or actuel pour évaluer la fonction CFTR, chez les mêmes patients. Le courant de court-circuit diffère du test de gonflement car le premier mesure la fonction CFTR via le transport ionique26. En revanche, ce test mesure un effet plus en aval avec le transport de fluide, fournissant des informations supplémentaires sur la fonction globale du CFTR 27,28,29,30,31,32. Les mesures de courant de court-circuit ont continué d’être une méthode courante et fiable pour déterminer l’activitédu canal chlorure CFTR 1,33. Ces essais électrophysiologiques nécessitent un équipement spécialisé et coûteux, nécessitent beaucoup plus de cellules pour chaque réplication expérimentale que le test organoïde, ne peuvent pas être facilement automatisés et ne se prêtent pas à une mise à l’échelle pour des applications à haut débit. Un autre modèle organoïde dérivé de l’épithélium intestinal présente des avantages supplémentaires 15,16,17,18, tels qu’une capacité de réplication plus excellente, mais n’est ni dérivé d’un tissu des voies respiratoires ni universellement disponible. Les brossages HNE sont obtenus avec des brosses cytologiques peu coûteuses sans sédation et avec un risque minimal. L’obtention du brossage ne nécessite pas de clinicien et peut être effectuée par des coordonnateurs de recherche formés et d’autres membres du personnel de recherche14. Le modèle organoïde HNE peut être cultivé par n’importe quel laboratoire doté de capacités de culture cellulaire primaire, et certaines des applications peuvent être réalisées avec des techniques de microscopie standard. Dans l’ensemble, ces avantages offrent un accès supplémentaire à la technologie d’évaluation de la fonction épithéliale des voies respiratoires qui pourrait autrement ne pas être disponible pour certains laboratoires. En outre, les organoïdes HNE peuvent être utilisés pour étudier d’autres états pathologiques qui affectent les voies respiratoires, tels que la dyskinésie ciliaire primaire25 ou l’infection virale, ce que les organoïdes intestinaux ne peuvent pas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Nasal brush</td>
			<td>Medical Packaging CYB1</td>
			<td>CYB-1</td>
			<td>Length: 8 inches, width approximately 7 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large-Orifice Pipette Tips</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>02-707-141</td>
			<td>Large bore pipette tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>Cell detachment solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% trypsin -EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor from soybean</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6522</td>
			<td>Working solution: 1mg/mL in 1XDPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356255</td>
			<td>Extracellular matrix (EM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide Angiogenesis</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81506</td>
			<td>15-well slide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-Well Transwell</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7200154</td>
			<td>Culture insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chambered Coverglass</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>155409</td>
			<td>8-well glass-bottom chamber slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>354240</td>
			<td>Cell adhesive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>50980487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A16046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucBlue</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>R37605</td>
			<td>DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ts2-FL (Inverted Routine Microscope)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Inverted epi-fluorescence microscope or bright-field microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R-HD25</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements- Basic Research</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>manual imaging analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histogel</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Base Molds</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>41-740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lionheart FX</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BTLFX</td>
			<td>Automated image system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lionheart Cover</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1450009</td>
			<td>Environmental Control Lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity Chamber</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1450006</td>
			<td>Stage insert (environmental chamber)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Controller for CO2 and O2</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1210013</td>
			<td>Gas controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate/Slide Stage Insert</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1450527</td>
			<td>Slide holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5 Imaging Prime Software</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BTGEN5IPRIM</td>
			<td>Automated imaging analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x Phase Contrast Objective</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1320515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Phase Contrast Objective</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1320516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED Cube</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1225007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Cube (DAPI)</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1225100</td>
			<td>DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFTRinh-172</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S7139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBMX</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expansion Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12 Nutrient mix</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;16140-071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;15-140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;C8052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;PHG0314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone (HC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;H0888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;A2786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>&#160;04-0012-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceftazidime</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>&#160;J66460-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tobramycin</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>&#160;J67340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vancomycin</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>&#160;J67251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Differentiation Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 (1:1)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;11330-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultroser-G</td>
			<td>Pall</td>
			<td>&#160;15950-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Clone II</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>&#160;SH30066.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Brain Extract</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>&#160;CC-4098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;I-9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;H-0888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triiodothyronine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;T-6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;T-0665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanolamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;E-0135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epinephrine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-4250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-Phosphorylethanolamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R-2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human CFTR antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB1660</td>
			<td>Dilution: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZO-1 antibody</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>MA3-39100-A647</td>
			<td>Dilution: 1000x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MUC5B antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HPA008246</td>
			<td>Dilution: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-acetylated tubulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7451</td>
			<td>Dilution: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-beta IV Tubulin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab11315</td>
			<td>Dilution: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21202</td>
			<td>Dilution: 2000x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21207</td>
			<td>Dilution: 2000x</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture and imaging of human nasal epithelial organoids

Un traitement individualisé pour les patients atteints de mucoviscidose (FK) peut être réalisé avec un modèle de maladie in vitro pour comprendre l’activité de base du régulateur de conductance transmembranaire de la fibrose kystique (CFTR) et la restauration à partir de composés de petites molécules. Notre groupe s’est récemment concentré sur l’établissement d’un modèle organoïde bien différencié directement dérivé des cellules épithéliales nasales humaines primaires (HNE). L’histologie des organoïdes sectionnés, la coloration immunofluorescente à monture entière et l’imagerie (à l’aide de la microscopie confocale, de la microscopie immunofluorescente et du champ lumineux) sont essentielles pour caractériser les organoïdes et confirmer la différenciation épithéliale en préparation des essais fonctionnels. De plus, les organoïdes HNE produisent des lumens de différentes tailles qui sont en corrélation avec l’activité CFTR, en distinguant les organoïdes CF et non CF. Dans ce manuscrit, la méthodologie de culture des organoïdes HNE est décrite en détail, en se concentrant sur l’évaluation de la différenciation à l’aide des modalités d’imagerie, y compris la mesure de la zone lumineuse de base (une méthode de mesure de l’activité CFTR dans les organoïdes que tout laboratoire avec un microscope peut utiliser) ainsi que l’approche automatisée développée pour un test fonctionnel (qui nécessite un équipement plus spécialisé).

L’expansion des HNE est essentielle à une culture organoïde florissante. Les HNE d’une collecte d’échantillons réussie devraient s’étendre à plus de 70% de confluence vers 10 jours. Un exemple d’échantillons réussis et infructueux est illustré à la figure 1A et à la figure 1B, respectivement. Les cellules doivent être jetées si elles ne peuvent pas atteindre 70% de confluence 14 jours après la co-culture avec des cellules...

Watch this Scientific Journal Video about Culture and Imaging of Human Nasal Epithelial Organoids at JoVE.com

Culture and Imaging of Human Nasal Epithelial Organoids

Un protocole détaillé est présenté ici pour décrire un modèle organoïde in vitro à partir de cellules épithéliales nasales humaines. Le protocole propose des options pour les mesures nécessitant un équipement de laboratoire standard, avec des possibilités supplémentaires pour l’équipement et les logiciels spécialisés.

Culture et imagerie des organoïdes épithéliaux nasaux humains

Individualized therapy for cystic fibrosis (CF) patients can be achieved with an in vitro disease model to understand baseline Cystic Fibrosis ...

Un traitement individualisé pour les patients atteints de mucoviscidose peut être réalisé par un modèle de maladie in vitro pour comprendre l’activité CFTR au départ. Les organoïdes épithéliaux nasaux humains, ou organoïdes HNE, produisent des lumens de différentes tailles qui sont en corrélation avec l’activité CFTR, distinguant les organoïdes CF et non CF. Ici, nous avons décrit en détail une méthodologie pour la culture et l’imagerie de ces organoïdes HNE.Le transport dysfonctionnel des ions épithéliaux, en particulier celui du chlorure et du bicarbonate, entraîne une diminution du volume des fluides de la muqueuse épithéliale. Cela affecte également les sécrétions de mucus conduisant à la mucostase et à l’obstruction. Par conséquent, notre modèle HNE a été développé pour diverses applications, en fonction de la conception expérimentale et des ressources de l’investigateur.Outre l’évaluation de l’activité cftr au départ ou en réponse à des traitements, cette technique peut également être appliquée à d’autres maladies impliquant la fonction des cellules épithéliales, en particulier le transport du liquide cellulaire épithélial. Ces méthodes ont été développées principalement pour être utilisées dans les études sur la fibrose kystique. D’autres études évaluant l’épithélium des voies respiratoires, telles que la dyskinésie ciliaire primaire, peuvent également trouver ces méthodes utiles.Ces techniques nécessitent une attention aux détails et à la précision. Ils nécessitent également une observation attentive pour s’assurer que l’expansion initiale des cellules est appropriée. Surveillez toutes les cultures tous les jours, et le succès sera plus probable.Pour commencer, dissocier la biopsie de la brosse nasale en 8 millitres de milieu RPMI dans un tube conique de 15 millilitres en passant la brosse de cytologie plusieurs fois à travers une pointe de pipette de gros calibre d’un millilitre. Centrifuger les cellules à 500 fois g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Jetez le surnageant, puis remettez-la en suspension dans trois millilitres de solution de détachement cellulaire.Incuber à température ambiante pendant 16 minutes pour digérer. Utilisez cinq millilitres de milieu d’expansion pour laver les cellules deux fois. Ensuite, ajoutez-les à une fiole T75, pré-ensemencée avec des fibroblastes 3T3 irradiés, inactivés et confluents à 50 à 60%.Permettre aux cellules de co-cultiver et de se développer dans le milieu d’expansion pendant 7 à 14 jours. Si des antibiotiques ont été introduits pour des cellules dérivées de patients atteints de mucoviscidose, les milieux doivent être remplacés par des milieux d’expansion sans antibiotiques après les trois premiers jours de culture et peuvent continuer à changer de milieu tous les deux jours jusqu’à 80% de confluent. Lavez les cellules avec 1x DPBS.Ensuite, ajoutez 1,5 millilitre de 0,05% de trypsine-EDTA dans la fiole T75 et incubez pendant quatre minutes à 37 degrés Celsius pour éliminer le fibroblaste 3T3 irradié et inactivé de la culture. Rincez la fiole T75 avec 1x DPBS deux fois pour bien laver les fibroblastes 3T3 restants. Ajouter 1,5 millilitre de 0,05 % de trypsine-EDTA dans la fiole T75 et incuber pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius pour détacher les HNE.Neutraliser la trypsine avec un inhibiteur de la trypsine de soja à un rapport de un pour un. Centrifugez les cellules à 500 fois gi pendant cinq minutes. Ensuite, jetez le surnageant et lavez les cellules avec cinq millilitres de milieu d’expansion une fois.Les cellules sont maintenant prêtes à être ensemencées pour développer des organoïdes. Décongelez la matrice extracellulaire ou ECM de culture organoïde pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Refroidir les diapositives d’angiogenèse à 15 puits pendant la nuit à la même température.Ensuite, refroidissez les pointes de la pipette à quatre degrés Celsius. Enduisez les toboggans de cinq microlitres de froid 100% ECM sur de la glace. Placez-les dans un incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius pendant au moins 30 minutes pour la consolidation.Compter les HNE récoltés en co-culture à l’aide d’un hémocytomètre. Ensuite, diluez les cellules à 500 cellules par microlitre en nombre total, avec 20% ECM dilué par des milieux de différenciation sur glace. Sortez les lames revêtues d’ECM de l’incubateur et ensemencez cinq microlitres du mélange ECM à cellules froides dans chacun des puits.Transférer les lames immédiatement dans un incubateur de culture à 37 degrés Celsius pendant une heure pour consolider le mélange ECM cellulaire. Après cela, sortez les lames de l’incubateur et alimentez les cellules dans chaque puits des lames d’angiogenèse à 15 puits avec 50 microlitres du milieu de différenciation. Retournez la lame dans l’incubateur de culture à 37 degrés Celsius, en changeant le milieu tous les deux jours jusqu’à ce que les organoïdes soient prêts pour d’autres expériences.Prétraitez les glissières de la chambre à fond de verre à 8 puits avec de l’adhésif cellulaire pendant 30 minutes. Jeter la solution et sécher les puits à l’air libre pendant encore 30 minutes. Ensuite, jetez le média du haut de l’ECM, puis ajoutez 50 microlitres du PBS froid 1x dans chaque puits des 15 puits sur glace.Pipette de haut en bas trois à cinq fois en utilisant 200 microlitres de la pointe de la pipette de gros calibre. Distribuer la solution au centre d’un puits des glissières de chambre à 8 puits. Retirez immédiatement l’excès de liquide des puits à l’aide d’une pipette à pointe fine.Ensuite, placez la chambre glisser dans un incubateur de 37 degrés Celsius pendant 40 minutes pour améliorer l’organoïde adhérant au fond du verre. Après 40 minutes, lavez doucement les organoïdes avec 1x PBS deux fois et fixez-les avec 300 microlitres de 4% de paraformaldéhyde dans chaque puits pendant 30 minutes à température ambiante réglée. Lavez deux fois avec 1x PBS et stockez les organoïdes dans 1x PBS réglé à quatre degrés Celsius pour l’immunocoloration jusqu’à deux semaines.Pour prélever les organoïdes pour des études histologiques, retirez le milieu de la culture et ajoutez 50 microlitres de froid un 1x PBS dans chaque puits des lames sur glace. Pipette de haut en bas trois à cinq fois à l’aide d’une pointe de pipette de gros calibre de 200 microlitres. Combinez toutes les solutions de la lame de 15 puits ou des inserts de culture dans un tube conique de 15 millilitres sur glace.Réglez le volume total de la solution dans le tube à 10 millilitres en ajoutant 1x PBS froid. Centrifuger le tube à quatre degrés Celsius, 300 fois g pendant cinq minutes. Ensuite, aspirez le surnageant et ajoutez 60 microlitres d’histogel chaud à mélanger avec la pastille organoïde à l’aide d’une pointe de pipette de gros calibre de 200 microlitres.Transférer immédiatement la suspension dans un moule d’histologie. Après avoir consolidé l’histogel à température ambiante, mettez le bloc de moisissure dans du paraformaldéhyde à 4% pour la fixation pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Ouvrez le logiciel et faites un clic droit en bas de l’écran.Ensuite, sélectionnez Contrôles d’analyse, puis Résultats de mesure automatisés. Ouvrez l’image organoïde et sélectionnez 5 à 10 organoïdes avec des lumens visibles. Maintenez la touche droit de la souris sur l’image pour ouvrir le menu et sélectionnez Roi polygonal pour dessiner le contour de l’organoïde complet afin d’obtenir la surface totale de l’organoïde.Ensuite, tracez le contour de la lumière pour obtenir la zone de la lumière. Répétez cette opération pour les organoïdes restants dans le puits et tous les puits du test. Enfin, exportez les données vers Excel.Divisez la zone lumineuse par la surface totale et faites la moyenne de tous les organoïdes de l’échantillon pour obtenir le rapport de lumen de base. Les images en champ lumineux représentent les HNE d’une collecte d’échantillons réussie et infructueuse. Les HNE poussent bien dans un grand cluster.En revanche, les HNE se développent mal en deux petits amas entourant les cellules 3T3 irradiées. Les organoïdes de la diapositive à 15 puits ont des images plus précises et plus nettes que celles de l’insert de culture. En outre, aucune différence morphologique significative n’a été observée dans ces deux méthodes de culture.Les organoïdes non atteints de mucoviscidose ont généralement une lumière plus grande et plus fluide que les organoïdes de la mucoviscidose. La coloration HNE dans les organoïdes d’un sujet non CF, F508del/F508del, et la coloration immunofluorescente des cils dans un organoïde sont montrées dans ces images. Les cils colorés avec de la tubuline acétylée, l’anticorps secondaire marqué FITC et les noyaux marqués avec DAPI sont montrés ici.Les images de projection maximale des deux organoïdes représentatifs par coloration immunofluorescente de montage entier et leurs images de reconstruction tridimensionnelle correspondantes sont montrées ici. Le mucus et les cils dans la lumière des organoïdes sont montrés. Les images graphiques représentent le test de gonflement induit par la forskoline pour tester la fonction CFTR sur les cellules épithéliales nasales primaires.Une expérience dose-réponse représentative de la forskoline chez des volontaires non atteints de mucoviscidose est présentée ici. La dose-réponse de FSK est comparée à un changement fractionnaire moyen à une heure, par rapport à huit heures, ce qui suggère que le test de huit heures peut produire une différence de gonflement plus significative entre les différentes doses de FSK que celles d’une heure. L’aire sous la courbe peut montrer une différence mineure de gonflement par rapport au changement fractionnaire moyen à huit heures.En essayant cette procédure, gardez à l’esprit que les organoïdes seront perdus pendant le processus de collecte, de fixation et de coloration. Ainsi, un soin méticuleux doit être apporté à chaque étape et un nombre de départ suffisant doit être obtenu pour assurer le succès. La croissance d’organoïdes dans des inserts de culture peut aider à cet égard, car ces techniques sont développées.Ici, nous avons utilisé des réactifs et des fournitures disponibles dans le commerce pour faciliter l’expansion à d’autres chercheurs. Un test fonctionnel a également été développé qui utilisait des techniques de microscope courantes et un équipement plus spécialisé.

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

L&#39;isolement, la culture, et de l&#39;imagerie de l&#39;homme causés par des amas de cellules pancréatiques

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

Recherche

Médecine

Primary Culture of Human Vestibular Schwannomas

Culture primaire de l&#39;homme vestibulaire schwannomes

Vestibular schwannomas (VSs) represent Schwann cell (SC) tumors of the vestibular nerve, compromising 10% of all intracranial neoplasms. VSs occur in ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Isolement, cryoconservation et de la culture des droits de cellules épithéliales Amnion pour des applications cliniques

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Establishment of Human Epithelial Enteroids and Colonoids from Whole Tissue and Biopsy

Mise en place d&#39;épithéliales humaines Enteroids et Colonoids de tout le tissu et la biopsie

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem ...

Absorption of Nasal and Bronchial Fluids: Precision Sampling of the Human Respiratory Mucosa and Laboratory Processing of Samples

Absorption de liquides nasales et bronchiques : échantillonnage Precision de la muqueuse respiratoire humaine et traitement des échantillons en laboratoire

The methods of nasal absorption (NA) and bronchial absorption (BA) use synthetic absorptive matrices (SAM) to absorb the mucosal lining fluid (MLF) of the ...

Standardized Measurement of Nasal Membrane Transepithelial Potential Difference (NPD)

Standardized Measurement of Nasal Membrane Transepithelial Potential Difference NPD

Normalisée de mesure de différence de potentiel transépithélial Membrane nasale (NPD)

We describe a standardized measurement of nasal potential difference (NPD). In this technique, cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) ...

Generation of Human Nasal Epithelial Cell Spheroids for Individualized Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Study

Génération de cellules épithéliales nasales humaines sphéroïdes pour mucoviscidose individualisé Transmembrane Conductance Regulator étude

While the introduction of Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) modulator drugs has revolutionized care in Cystic Fibrosis (CF), the ...

Muscle Imbalances: Testing and Training Functional Eccentric Hamstring Strength in Athletic Populations

Les déséquilibres musculaires : Essais et formation fonctionnelle ischio-jambiers excentrique force athlétique populations

Many hamstring injuries that occur during physical activity occur while the muscles are lengthening, during eccentric hamstring muscle actions. Opposite ...

Quantitative Mapping of Specific Ventilation in the Human Lung using Proton Magnetic Resonance Imaging and Oxygen as a Contrast Agent

Cartographie quantitative de la ventilation spécifique dans le poumon humain utilisant l’imagerie par résonance magnétique de proton et l’oxygène comme agent de contraste

Specific ventilation imaging (SVI) is a functional magnetic resonance imaging technique capable of quantifying specific ventilation &#8213; the ratio of ...

A Fluorescence-based Assay for Characterization and Quantification of Lipid Droplet Formation in Human Intestinal Organoids

Un test basé sur la fluorescence pour la caractérisation et la quantification de la formation de gouttelettes lipidiques chez les organoïdes intestinaux humains