Name: culture and imaging of human nasal epithelial organoids
Uploaded: 2021-12-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culture and Imaging of Human Nasal Epithelial Organoids at JoVE.com

Wir danken allen Teilnehmern, die HNE-Bürstenbiopsien zur Entwicklung dieses Protokolls gespendet haben. Wir danken Latona Kersh und den Mitarbeitern der Children's Research Unit für die Koordination der Freiwilligenrekrutierung und der Probensammlungen. Wir danken Lily Deng, Johnathan Bailey und Stephen Mackay, ehemaligen Auszubildenden in unserem Labor, für die technische Unterstützung. Wir danken Zhong Liu und Rui Zhao für ihre technische Hilfe. Steven M. Rowe, Direktor des CF Research Center an der UAB, stellt Führung und Ressourcen zur Verfügung, ohne die diese Arbeit nicht möglich wäre. Wir danken auch Sarah Guadiana von Biotek für die Unterstützung bei der Instrumentenausbildung, Robert Grabski für die Unterstützung der konfokalen Mikroskopie in der UAB High-Resolution Imaging Facility und Dezhi Wang für die histologische Unterstützung im UAB Histology Core. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (NIH) unterstützt. Grant K23HL143167 (an JSG), Cystic Fibrosis Foundation (CFF) Grant GUIMBE18A0-Q (an JSG), das Gregory Fleming James Cystic Fibrosis Center [NIH Grants R35HL135816 und DK072482 und das CFF University of Alabama at Birmingham (UAB) Research and Development Program (Rowe19RO)] und das UAB Center for Clinical and Translational Science (NIH Grant UL1TR001417).

HNE-Proben wurden im Children's of Alabama Hospital gesammelt. Alle hier beschriebenen Verfahren und Methoden wurden von der IRB University of Alabama in Birmingham (UAB IRB #151030001) zugelassen. Um die Expansion zu erleichtern und die Funktion menschlicher Nasenepithelzellen (HNEs) zu verbessern, werden die derzeitigen Kultivierungsmethoden von der bekannten Luft-Flüssigkeits-Schnittstelle (ALI) Kulturmethode28,34 übernommen. HNEs wurden zunächst durch Bür...

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	<li>Brewington, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brushed+nasal+epithelial+cells+are+a+surrogate+for+bronchial+epithelial+CFTR+studies.">Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies.</a> JCI Insight. 3 (13), (2018).</li><li>Brewington, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+nasal+epithelial+cell+spheroids+for+individualized+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+study.">Generation of human nasal epithelial cell spheroids for individualized cystic fibrosis transmembrane conductance regulator study.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57492 (2018).</li><li>Brewington, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+CFTR+function+and+modulation+in+primary+human+nasal+cell+spheroids.">Detection of CFTR function and modulation in primary human nasal cell spheroids.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 17 (1), 26-33 (2017).</li><li>Bridges, M. A., Walker, D. C., Davidson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+and+control+nasal+epithelial+cells+harvested+by+a+brushing+procedure.">Cystic fibrosis and control nasal epithelial cells harvested by a brushing procedure.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. 27 (9), 684-686 (1991).</li><li>Bridges, M. A., Walker, D. C., Harris, R. A., Wilson, B. R., Davidson, A. 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Dieses Manuskript bietet detaillierte Methoden für eine umfassende Live- und fixe Bildgebung der Atemwegsepithelorganoide, die aus der HNE-Pinselbiopsie stammen. Es beschreibt funktionelle Assays, die die CFTR-Aktivität in einer Person bestimmen können. HNEs bieten ein minimalinvasives, primäres Gewebe für eine Vielzahl von Anwendungen. Die hier angebotenen Expansionstechniken können zur Modellierung von Atemwegserkrankungen, einschließlich Organoiden, verwendet werden. Organoide können für präzise therapeutisc...

Einführung in die Technik Ex-vivo-kulturbasierte Assays sind ein zunehmend eingesetztes Werkzeug für die Präzisionsmedizin und das Studium der Krankheitspathophysiologie. Primäre humane Nasenepithel-Zellkultur (HNE) wurde in zahlreichen Studien zur Mukoviszidoseverwendet 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 , eine autosomal-rezessive Erkrankung, die die Funktion von Epithelzellen in mehreren Organen beeinträchtigt. Die HNE-Kultur bietet eine erneuerbare Quelle für Atemwegsepithele, die prospektiv erhalten werden kann und elektrophysiologische und biochemische Eigenschaften rekapituliert, um die Aktivität des Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) zu testen. HNE-Zellen können mit minimalen Nebenwirkungen14 beprobt werden, ähnlich wie bei herkömmlichen viralen Atemwegsabstrichen. Forschungsarbeiten, die ein Modell für Mukoviszidose-Studien beschreiben, die von HNE-Bürstenbiopsien abgeleitet wurden, wurden kürzlichveröffentlicht 11,13. Während ähnlich wie bei anderen Modellen, die primäres HNE2,3 und Darmgewebe15,16,17,18,19 verwenden, werden hier detaillierte Charakterisierungen der Differenzierung und Bildgebung dieses Modells für den Einsatz in der CF-Forschung und zur Unterstützung bei der Untersuchung anderer Atemwegserkrankungen beschrieben 13 . Das Organoidmodell ist nicht unbegrenzt wie immortalisierte Zelllinien, sondern kann durch bedingte Reprogrammierung (unter Verwendung von bestrahlten und inaktivierten Feeder-Fibroblasten und Rho-Kinase-Inhibitoren) auf einen stammzellähnlicheren Zustand20,21,22,23 erweitert werden. Die Verarbeitung von HNE-Bürstenbiopsien mit dieser Methode ergibt eine große Anzahl von Epithelzellen, die in mehreren Anwendungen bei höherem Durchsatz eingesetzt werden können, während gleichzeitig die Fähigkeit zur vollständigen Differenzierung erhalten bleibt. Während dieses Protokoll unter Verwendung von Feederzellen entwickelt wurde, können andere Methoden von Forschern verwendet werden, die die Feederzelltechnologie vermeiden möchten14,24.
Bedeutung der Technik für die Lungenbiologie Eine bedeutende Studie wurde dem Verständnis gewidmet, wie das Fehlen von regelmäßiger, funktionierender CFTR in der Zellmembran von Epithelzellen zu Funktionsstörungen in der Lunge, der Bauchspeicheldrüse, der Leber, dem Darm oder anderen Geweben führt. Ein dysfunktionaler epithelialer Ionentransport, insbesondere der von Chlorid und Bicarbonat, führt zu einem verringerten Volumen der epithelialen Auskleidungsflüssigkeiten und zu Veränderungen der Schleimsekrete, was zu Schleimbildung und Obstruktion führt. Bei anderen Atemwegserkrankungen, wie der primären ziliären Dyskinesie, beeinträchtigt eine veränderte Ziliarbewegung die mukoziliäre Clearance und führt zu Schleimhautstauung und Obstruktion25. Daher wurde das aktuelle HNE-Organoidmodell für verschiedene Anwendungen entwickelt, abhängig vom experimentellen Design und den Ressourcen des Prüfers. Dazu gehört die Lebendzellbildgebung unter Verwendung von Lebendzellflecken; Fixierung und Schnitt zur Charakterisierung der Morphologie; Immunfluoreszenzfärbung mit Antikörpern und konfokale Bildgebung ganz, um eine Störung intraluminaler Strukturen zu vermeiden; und Hellfeldbildgebung und mikrooptische Kohärenztomographie zur quantitativen Messung der Ziliarschlagfrequenz und des mukoziliären Transports13. Um die Expansion zu anderen Forschern zu erleichtern, wurden kommerziell erhältliche Reagenzien und Vorräte für die Kultivierung verwendet. Es wurde ein funktioneller Assay entwickelt, der gängige Mikroskoptechniken und speziellere Geräte verwendete. Während das vorliegende Modell entwickelt wurde, um die CFTR-Aktivität zu Studienbeginn oder als Reaktion auf Therapeutika zu bewerten, können die in diesem Protokoll beschriebenen Techniken auf andere Krankheiten angewendet werden, die die Funktion von Epithelzellen, insbesondere den Flüssigkeitstransport von Epithelzellen, betreffen.
Vergleich mit anderen Methoden Vor kurzem wurde der Nutzen dieses Organoidmodells entwickelt, indem die In-vitro-CFTR-Modulatorreaktionen der Organoide der Patienten mit ihrer klinischen Reaktionkorreliert wurden 11. Insbesondere wird auch gezeigt, dass das vorliegende Modell parallel zu Kurzschlussstromreaktionen, dem aktuellen Goldstandard für die Beurteilung der CFTR-Funktion, bei denselben Patienten war. Der Kurzschlussstrom unterscheidet sich vom Quellassay, da ersterer die CFTR-Funktion über den Ionentransport misst26. Im Gegensatz dazu misst dieser Assay einen eher nachgeschalteten Effekt mit dem Flüssigkeitstransport und liefert zusätzliche Informationen über die Gesamtfunktion von CFTR 27,28,29,30,31,32. Kurzschlussstrommessungen sind nach wie vor eine gängige und zuverlässige Methode zur Bestimmung der CFTR-Chloridkanalaktivität 1,33. Diese elektrophysiologischen Assays erfordern spezielle, teure Ausrüstung, erfordern ein Vielfaches mehr Zellen für jedes experimentelle Replikat als der Organoid-Assay, können nicht einfach automatisiert werden und sind nicht für eine Skalierung für Anwendungen mit höherem Durchsatz geeignet. Ein weiteres Organoidmodell, das von der Darmepithel abgeleitet wurde, hat zusätzliche Vorteile15,16,17,18, wie z.B. eine bessere Replikationsfähigkeit, ist aber weder aus einem Atemwegsgewebe abgeleitet noch universell verfügbar. HNE-Bürsten werden mit kostengünstigen Zytologiebürsten ohne Sedierung und mit minimalem Risiko erhalten. Das Bürsten erfordert keinen Kliniker und kann von ausgebildeten Forschungskoordinatoren und anderen Forschungsmitarbeiterndurchgeführt werden 14. Das HNE-Organoidmodell kann von jedem Labor mit primären Zellkulturfähigkeiten kultiviert werden, und einige der Anwendungen können mit Standard-Mikroskopietechniken durchgeführt werden. Insgesamt bieten diese Vorteile einen zusätzlichen Zugang zu Technologien zur Beurteilung der Epithelfunktion der Atemwege, die sonst einigen Labors möglicherweise nicht zur Verfügung stünden. Darüber hinaus können HNE-Organoide verwendet werden, um andere Krankheitszustände zu untersuchen, die die Atemwege betreffen, wie primäre ziliäre Dyskinesie25 oder Virusinfektion, die Darmorganoide nicht können.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Nasal brush</td>
			<td>Medical Packaging CYB1</td>
			<td>CYB-1</td>
			<td>Length: 8 inches, width approximately 7 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large-Orifice Pipette Tips</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>02-707-141</td>
			<td>Large bore pipette tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>Cell detachment solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% trypsin -EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor from soybean</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6522</td>
			<td>Working solution: 1mg/mL in 1XDPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356255</td>
			<td>Extracellular matrix (EM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide Angiogenesis</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81506</td>
			<td>15-well slide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-Well Transwell</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7200154</td>
			<td>Culture insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chambered Coverglass</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>155409</td>
			<td>8-well glass-bottom chamber slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>354240</td>
			<td>Cell adhesive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>50980487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A16046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucBlue</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>R37605</td>
			<td>DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ts2-FL (Inverted Routine Microscope)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Inverted epi-fluorescence microscope or bright-field microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R-HD25</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements- Basic Research</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>manual imaging analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histogel</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Base Molds</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>41-740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lionheart FX</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BTLFX</td>
			<td>Automated image system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lionheart Cover</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1450009</td>
			<td>Environmental Control Lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity Chamber</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1450006</td>
			<td>Stage insert (environmental chamber)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Controller for CO2 and O2</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1210013</td>
			<td>Gas controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate/Slide Stage Insert</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1450527</td>
			<td>Slide holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5 Imaging Prime Software</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BTGEN5IPRIM</td>
			<td>Automated imaging analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x Phase Contrast Objective</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1320515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Phase Contrast Objective</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1320516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED Cube</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1225007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Cube (DAPI)</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1225100</td>
			<td>DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFTRinh-172</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S7139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBMX</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expansion Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12 Nutrient mix</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;16140-071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;15-140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;C8052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;PHG0314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone (HC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;H0888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;A2786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>&#160;04-0012-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceftazidime</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>&#160;J66460-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tobramycin</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>&#160;J67340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vancomycin</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>&#160;J67251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Differentiation Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 (1:1)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;11330-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultroser-G</td>
			<td>Pall</td>
			<td>&#160;15950-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Clone II</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>&#160;SH30066.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Brain Extract</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>&#160;CC-4098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;I-9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;H-0888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triiodothyronine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;T-6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;T-0665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanolamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;E-0135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epinephrine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-4250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-Phosphorylethanolamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R-2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human CFTR antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB1660</td>
			<td>Dilution: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZO-1 antibody</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>MA3-39100-A647</td>
			<td>Dilution: 1000x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MUC5B antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HPA008246</td>
			<td>Dilution: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-acetylated tubulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7451</td>
			<td>Dilution: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-beta IV Tubulin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab11315</td>
			<td>Dilution: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21202</td>
			<td>Dilution: 2000x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21207</td>
			<td>Dilution: 2000x</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture and imaging of human nasal epithelial organoids

Eine individualisierte Therapie für Mukoviszidose-Patienten (CF) kann mit einem In-vitro-Krankheitsmodell erreicht werden, um die Aktivität des Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) und die Wiederherstellung aus niedermolekularen Verbindungen zu verstehen. Unsere Gruppe konzentrierte sich kürzlich auf die Etablierung eines gut differenzierten Organoidmodells, das direkt von primären menschlichen Nasenepithelzellen (HNE) abgeleitet ist. Die Histologie der geschnittenen Organoide, die Ganzkörper-Immunfluoreszenzfärbung und die Bildgebung (unter Verwendung von konfokaler Mikroskopie, Immunfluoreszenzmikroskopie und Hellfeld) sind unerlässlich, um Organoide zu charakterisieren und die epitheliale Differenzierung in Vorbereitung auf funktionelle Assays zu bestätigen. Darüber hinaus produzieren HNE-Organoide Lumen unterschiedlicher Größe, die mit der CFTR-Aktivität korrelieren und zwischen CF- und Nicht-CF-Organoiden unterscheiden. In diesem Manuskript wird die Methodik zur Kultivierung von HNE-Organoiden ausführlich beschrieben, wobei der Schwerpunkt auf der Beurteilung der Differenzierung unter Verwendung der Bildgebungsmodalitäten liegt, einschließlich der Messung der Ausgangslumenfläche (eine Methode zur CFTR-Aktivitätsmessung in Organoiden, die jedes Labor mit einem Mikroskop anwenden kann) sowie des entwickelten automatisierten Ansatzes für einen funktionellen Assay (der speziellere Ausrüstung erfordert).

Die Expansion von HNE ist für eine blühende Organoidkultur unerlässlich. HNEs aus einer erfolgreichen Probenentnahme sollten sich auf über 70% Konfluenz um 10 Tage ausdehnen. Ein Beispiel für erfolgreiche und nicht erfolgreiche Stichproben ist in Abbildung 1A bzw. Abbildung 1B dargestellt. Die Zellen müssen verworfen werden, wenn sie 14 Tage nach der Co-Kultur mit bestrahlten 3T3-Zellen keinen 70%igen Zusammenfluss erreichen können. Konta...

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Culture and Imaging of Human Nasal Epithelial Organoids

Hier wird ein detailliertes Protokoll vorgestellt, um ein in vitro Organoidmodell aus menschlichen Nasenepithelzellen zu beschreiben. Das Protokoll bietet Optionen für Messungen, die Standardlaborgeräte erfordern, mit zusätzlichen Möglichkeiten für spezielle Geräte und Software.

Kultur und Bildgebung von humanen nasalen Epithelorganoiden

Individualized therapy for cystic fibrosis (CF) patients can be achieved with an in vitro disease model to understand baseline Cystic Fibrosis ...

Eine individualisierte Therapie für Mukoviszidose-Patienten kann durch ein In-vitro-Krankheitsmodell erreicht werden, um die CFTR-Aktivität zu Studienbeginn zu verstehen. Menschliche nasale Epithelorganoide oder HNE-Organoide produzieren Lumen unterschiedlicher Größe, die mit der CFTR-Aktivität korrelieren und zwischen CF- und Nicht-CF-Organoiden unterscheiden. Hier haben wir eine Methodik zur Kultivierung und Abbildung dieser HNE-Organoide im Detail beschrieben.Ein dysfunktionaler epithelialer Ionentransport, insbesondere der von Chlorid und Bicarbonat, führt zu einem verringerten Volumen der epithelialen Auskleidungsflüssigkeiten. Dies betrifft auch die Schleimsekrete, die zu Mucostasis und Obstruktion führen. Daher wurde unser HNE-Modell für verschiedene Anwendungen entwickelt, abhängig vom experimentellen Design und den Ressourcen des Prüfers.Neben der Beurteilung der CFTR-Aktivität zu Studienbeginn oder als Reaktion auf Therapeutika kann diese Technik auch auf andere Erkrankungen der Epithelzellfunktion, insbesondere des Flüssigkeitstransports von Epithelzellen, angewendet werden. Diese Methoden wurden in erster Linie für den Einsatz in Mukoviszidose-Studien entwickelt. Andere Studien, die die Atemwegsepithelien bewerten, wie die primäre ziliäre Dyskinesie, können diese Methoden ebenfalls hilfreich finden.Diese Techniken erfordern Liebe zum Detail und Präzision. Sie erfordern auch eine sorgfältige Beobachtung, um sicherzustellen, dass die anfängliche Expansion der Zellen angemessen ist. Überwachen Sie jeden Tag alle Kulturen, und der Erfolg wird wahrscheinlicher.Dissoziieren Sie zunächst die Nasenbürstenbiopsie in 8 Milliter RPMI-Medien in einem 15-Milliliter-Konusröhrchen, indem Sie die Zytologiebürste mehrmals durch eine Ein-Milliliter-Pipettenspitze mit großer Bohrung führen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 500 mal g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Verwerfen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Zellpellet dann wieder in drei Milliliter Zellablösungslösung.16 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren, um sie zu verdauen. Verwenden Sie fünf Milliliter des Expansionsmediums, um die Zellen zweimal zu waschen. Dann fügen Sie sie zu einem T75-Kolben hinzu, der mit bestrahlten, inaktivierten und 50 bis 60% konfluierenden 3T3-Fibroblasten vorgesät ist.Lassen Sie die Zellen 7 bis 14 Tage lang in den Expansionsmedien kokultivieren und expandieren. Wenn Antibiotika für Zellen von Patienten mit Mukoviszidose eingeführt wurden, sollten die Medien nach den ersten drei Tagen der Kultur durch antibiotikafreie Expansionsmedien ersetzt werden und können alle zwei Tage bis zu 80% Konfluent weiter wechseln. Waschen Sie die Zellen mit 1x DPBS.Dann fügen Sie 1,5 Milliliter 0,05% Trypsin-EDTA in den T75-Kolben hinzu und inkubieren Sie vier Minuten lang bei 37 Grad Celsius, um den bestrahlten und inaktivierten 3T3-Fibroblasten aus der Kultur zu entfernen. Spülen Sie den T75-Kolben zweimal mit 1x DPBS ab, um die verbleibenden 3T3-Fibroblasten gründlich abzuwaschen. Geben Sie 1,5 Milliliter 0,05% Trypsin-EDTA in den T75-Kolben und inkubieren Sie für 10 Minuten bei 37 Grad Celsius, um HNEs zu lösen.Neutralisieren Sie das Trypsin mit Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor in einem Eins-zu-Eins-Verhältnis. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 500 mal gi für fünf Minuten. Verwerfen Sie dann den Überstand und waschen Sie die Zellen einmal mit fünf Millilitern Expansionsmedien.Die Zellen sind jetzt bereit für die Aussaat, um Organoide zu züchten. Tauen Sie die extrazelluläre Matrix der Organoidkultur oder ECM über Nacht bei vier Grad Celsius auf. Kühlen Sie die 15-Well-Angiogenese-Rutschen über Nacht bei gleicher Temperatur ab.Als nächstes kühlen Sie die Pipettenspitzen auf vier Grad Celsius ab. Beschichten Sie die Objektträger mit fünf Mikrolitern kaltem 100% ECM auf Eis. Legen Sie sie für mindestens 30 Minuten zur Konsolidierung in einen Zellkultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius.Zählen Sie die HNEs, die aus der Kokultur mit einem Hämozytometer gewonnen wurden. Verdünnen Sie dann die Zellen auf 500 Zellen pro Mikroliter in der Gesamtzahl, wobei 20% ECM durch Differenzierungsmedien auf Eis verdünnt werden. Nehmen Sie die ECM-beschichteten Objektträger aus dem Inkubator und säen Sie fünf Mikroliter der Kaltzellen-ECM-Mischung in jede der Vertiefungen.Überführen Sie die Objektträger sofort für eine Stunde in einen Kulturinkubator bei 37 Grad Celsius, um die Zell-ECM-Mischung zu konsolidieren. Danach nehmen Sie die Objektträger aus dem Inkubator und führen die Zellen mit 50 Mikrolitern des Differenzierungsmediums in jede Vertiefung der 15-Well-Angiogenese-Objektträger ein. Bringen Sie den Objektträger bei 37 Grad Celsius in den Kulturinkubator zurück und wechseln Sie die Medien jeden zweiten Tag, bis die Organoide für weitere Experimente bereit sind.Behandeln Sie die 8-Well-Glasboden-Kammerobjektträger 30 Minuten lang mit Zellkleber vor. Entsorgen Sie die Lösung und trocknen Sie die Brunnen für weitere 30 Minuten an der Luft. Als nächstes entsorgen Sie das Medium von der Oberseite des ECM und fügen Sie dann 50 Mikroliter des kalten 1x PBS in jede Vertiefung der 15-Well-Rutschen auf Eis hinzu.Pipette drei- bis fünfmal mit 200 Mikrolitern der großvolumigen Pipettenspitze auf und ab. Verteilen Sie die Lösung auf die Mitte einer Vertiefung der 8-Well-Kammerobjektträger. Entfernen Sie die überschüssige Flüssigkeit sofort aus den Vertiefungen mit einer feinspitzen Pipette.Legen Sie dann die Kammer für 40 Minuten in einen 37 Grad Celsius-Inkubator, um das Organoid, das am Glasboden haftet, zu verbessern. Nach 40 Minuten die Organoide zweimal vorsichtig mit 1x PBS waschen und mit 300 Mikrolitern 4% Paraformaldehyd in jeder Vertiefung für 30 Minuten Raumtemperatur fixieren. Zweimal mit 1x PBS waschen und die Organoide in 1x PBS Set vier Grad Celsius zur Immunfärbung für bis zu zwei Wochen lagern.Um die Organoide für histologische Studien zu ernten, entfernen Sie die Medien aus der Kultur und fügen Sie 50 Mikroliter kaltes 1x PBS in jede Vertiefung der Objektträger auf Eis hinzu. Pipette drei- bis fünfmal mit einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze mit großer Bohrung. Kombinieren Sie alle Lösungen aus dem 15-Well-Slide oder den Kultureinsätzen in einem 15-Milliliter-Konusrohr auf Eis.Stellen Sie das Gesamtlösungsvolumen im Rohr auf 10 Milliliter ein, indem Sie kaltes 1x PBS hinzufügen. Zentrieren Sie das Röhrchen bei vier Grad Celsius, 300 mal g für fünf Minuten. Dann den Überstand absaugen und 60 Mikroliter warmes Histogel hinzufügen, um es mit einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze mit großer Bohrung mit dem Organoidpellet zu mischen.Übertragen Sie die Suspension sofort in eine histologische Form. Nachdem Sie das Histogel bei Raumtemperatur konsolidiert haben, geben Sie den Formblock in 4% Paraformaldehyd zur Fixierung über Nacht bei vier Grad Celsius. Öffnen Sie die Software und klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den unteren Bildschirmrand.Wählen Sie dann Analysesteuerelemente und anschließend Automatisierte Messergebnisse aus. Öffnen Sie das Organoidbild und wählen Sie 5 bis 10 Organoide mit sichtbaren Lumen. Halten Sie den Rechtsklick auf das Bild gedrückt, um das Menü zu öffnen, und wählen Sie Polygonal ROI, um das vollständige Organoid zu skizzieren, um die Gesamtoberfläche des Organoids zu erhalten.Umreißen Sie dann das Lumen, um den Lumenbereich zu erhalten. Wiederholen Sie dies für die verbleibenden Organoide im Bohrloch und alle Vertiefungen im Assay. Exportieren Sie schließlich die Daten nach Excel.Teilen Sie die Lumenfläche durch die Gesamtoberfläche und berechnen Sie den Durchschnitt aller Organoide aus der Probe, um das Basis-Lumenverhältnis zu erhalten. Die Hellfeldbilder stellen HNEs aus einer erfolgreichen und erfolglosen Probensammlung dar. Die HNEs wachsen gut in einem großen Cluster.Im Gegensatz dazu wachsen die HNEs schlecht in zwei kleinen Clustern, die die bestrahlten 3T3-Zellen umgeben. Organoide im 15-Well-Dia haben präzisere und schärfere Bilder als die im Kultureinsatz. Abgesehen davon wurde bei diesen beiden Kulturmethoden kein signifikanter morphologischer Unterschied beobachtet.Nicht-CF-Organoide haben typischerweise ein größeres Lumen und mehr Flüssigkeit als CF-Organoide. Die HNE-Färbung in Organoiden von einem Nicht-CF, F508del/F508del-Subjekt, und die immunfluoreszierende Färbung von Zilien in einem Organoid sind in diesen Bildern dargestellt. Die mit Acetyliert-Tubulin gefärbten Zilien, der mit FITC markierte sekundäre Antikörper und die mit DAPI markierten Kerne sind hier dargestellt.Hier werden maximale Projektionsbilder der beiden repräsentativen Organoide durch ganzmontierbare Immunfluoreszenzfärbung und die entsprechenden dreidimensionalen Rekonstruktionsbilder gezeigt. Schleim und Zilien innerhalb des Lumens der Organoide werden gezeigt. Die grafischen Bilder stellen den Forskolin-induzierten Schwellungsassay dar, um die CFTR-Funktion an den primären Nasenepithelzellen zu testen.Ein repräsentatives Forskolin-Dosis-Wirkungs-Experiment von Nicht-CF-Freiwilligen ist hier gezeigt. Die FSK-Dosis-Wirkungs-Beziehung wird mit der durchschnittlichen Bruchteilsänderung nach einer Stunde im Vergleich zu acht Stunden verglichen, was darauf hindeutet, dass der Acht-Stunden-Assay einen signifikanteren Schwellungsunterschied zwischen verschiedenen FSK-Dosen erzeugen kann als bei einer Stunde. Der Bereich unter der Kurve kann einen geringfügigen Unterschied in der Schwellung im Vergleich zur durchschnittlichen Bruchänderung nach acht Stunden zeigen.Beachten Sie beim Ausprobieren dieses Verfahrens, dass Organoide während des Sammlungs-, Fixierungs- und Färbeprozesses verloren gehen. Daher muss bei jedem Schritt sorgfältig vorgegangen und ausreichende Startnummern erzielt werden, um den Erfolg zu gewährleisten. Der Anbau von Organoiden in Kultureinlagen kann in dieser Hinsicht hilfreich sein, da diese Techniken entwickelt werden.Hier haben wir kommerziell erhältliche Reagenzien und Verbrauchsmaterialien verwendet, um die Expansion auf andere Ermittler zu erleichtern. Es wurde auch ein funktioneller Assay entwickelt, der gängige Mikroskoptechniken und speziellere Geräte verwendete.

Research

JoVE Journal

Medicine

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Forschung

Medizin

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