Name: culture and imaging of human nasal epithelial organoids
Uploaded: 2021-12-17T14:00:00
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Riconosciamo con gratitudine i contributi di tutti i partecipanti che hanno donato biopsie con pennello HNE per sviluppare questo protocollo. Ringraziamo Latona Kersh e lo staff dell'Unità di ricerca per bambini per aver coordinato il reclutamento di volontari di studio e le raccolte di campioni. Ringraziamo Lily Deng, Johnathan Bailey e Stephen Mackay, ex tirocinanti nel nostro laboratorio, per l'assistenza tecnica. Ringraziamo Zhong Liu e Rui Zhao per il loro aiuto tecnico. Steven M. Rowe, direttore del CF Research Center presso UAB, fornisce leadership e risorse, senza le quali questo lavoro non sarebbe possibile. Vorremmo anche ringraziare Sarah Guadiana di Biotek per l'assistenza con la formazione degli strumenti, Robert Grabski per l'assistenza alla microscopia confocale presso la UAB High-Resolution Imaging Facility e Dezhi Wang per l'assistenza istologica presso l'UAB Histology Core. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health (NIH). Grant K23HL143167 (a JSG), Cystic Fibrosis Foundation (CFF) Grant GUIMBE18A0-Q (a JSG), il Gregory Fleming James Cystic Fibrosis Center [NIH Grants R35HL135816 e DK072482 e il CFF University of Alabama at Birmingham (UAB) Research and Development Program (Rowe19RO)], e l'UAB Center for Clinical and Translational Science (NIH Grant UL1TR001417).

I campioni di HNE sono stati raccolti presso l'ospedale Children's of Alabama. Tutte le procedure e i metodi qui descritti sono stati approvati dall'IRB University of Alabama di Birmingham (UAB IRB #151030001). Per facilitare l'espansione e migliorare la funzione delle cellule epiteliali nasali umane (HNE), gli attuali metodi di coltivazione sono adattati dal noto metodo di coltura dell'interfaccia aria-liquido (ALI)28,34. Gli HNE sono stati inizialmente raccolti...

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Questo manoscritto fornisce metodologie dettagliate per l'imaging completo vivo e fisso degli organoidi epiteliali delle vie aeree derivati dalla biopsia del pennello HNE. Descrive saggi funzionali che possono determinare l'attività CFTR in un individuo. Gli HNE forniscono un tessuto primario minimamente invasivo per una varietà di applicazioni. Le tecniche di espansione qui offerte possono essere utilizzate per modellare la malattia delle vie aeree, compresi gli organoidi. Gli organoidi possono essere utilizzati per a...

Introduzione alla tecnica I saggi basati su colture ex vivo sono uno strumento sempre più utilizzato per la medicina di precisione e lo studio della fisiopatologia della malattia. La coltura cellulare primaria dell'epitelio nasale umano (HNE) è stata utilizzata in numerosi studi sulla fibrosi cistica 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 , una malattia autosomica recessiva che colpisce la funzione delle cellule epiteliali in più organi. La coltura HNE fornisce una fonte rinnovabile di epiteli delle vie aeree che possono essere ottenuti in modo prospettico e ricapitola le qualità elettrofisiologiche e biochimiche per testare l'attività del regolatore di conduttanza transmembrana della fibrosi cistica (CFTR). Le cellule HNE possono essere campionate con effetti collaterali minimi14, simili ai comuni tamponi respiratori virali. Il lavoro di ricerca che descrive un modello per lo studio della fibrosi cistica derivato da biopsie del pennello HNE è stato recentemente pubblicato11,13. Mentre simile ad altri modelli che utilizzano HNEprimario 2,3 e tessuto intestinale 15,16,17,18,19, la caratterizzazione dettagliata della differenziazione e dell'imaging di questo modello sono descritte qui per l'uso nella ricerca CF e per aiutare negli studi di altre malattie delle vie aeree13 . Il modello organoide non è illimitato come le linee cellulari immortalizzate, ma può essere espanso mediante riprogrammazione condizionale (utilizzando fibroblasti di alimentazione irradiati e inattivati e inibitori della Rho-chinasi) a uno stato più simile alle cellule staminali 20,21,22,23. L'elaborazione di biopsie a pennello HNE utilizzando questo metodo produce un gran numero di cellule epiteliali da utilizzare in più applicazioni a un throughput più elevato, pur mantenendo la capacità di differenziarsi completamente. Mentre questo protocollo è stato sviluppato utilizzando cellule di alimentazione, altre metodologie possono essere utilizzate dagli investigatori che desiderano evitare la tecnologia delle cellule di alimentazione14,24.
Importanza della tecnica per la biologia polmonare Uno studio significativo è stato dedicato alla comprensione di come l'assenza di CFTR regolare e funzionante nella membrana cellulare delle cellule epiteliali provoca disfunzioni nei polmoni, nel pancreas, nel fegato, nell'intestino o in altri tessuti. Il trasporto ionico epiteliale disfunzionale, in particolare quello di cloruro e bicarbonato, provoca una diminuzione del volume dei fluidi di rivestimento epiteliale e cambiamenti nelle secrezioni mucose, portando a stasi e ostruzione mucosa. In altre malattie delle vie aeree, come la discinesia ciliare primaria, il movimento ciliare alterato compromette la clearance mucociliare e porta alla stasi mucosa e all'ostruzione25. Pertanto, l'attuale modello di organoide HNE è stato sviluppato per varie applicazioni, a seconda del design sperimentale e delle risorse dello sperimentatore. Ciò include l'imaging di cellule vive utilizzando macchie di cellule vive; fissazione e sezionamento per caratterizzare la morfologia; colorazione immunofluorescenza con anticorpi e imaging confocale a montaggio intero per evitare di interrompere le strutture intraluminali; e imaging a campo luminoso e tomografia a coerenza micro-ottica per misure quantitative della frequenza del battito ciliare e del trasporto mucociliare13. Per facilitare l'espansione ad altri ricercatori, sono stati utilizzati reagenti e forniture disponibili in commercio per la coltivazione. È stato sviluppato un test funzionale che utilizzava tecniche di microscopio comuni e attrezzature più specializzate. Nel complesso, mentre il presente modello è stato progettato per valutare l'attività della CFTR al basale o in risposta alle terapie, le tecniche descritte in questo protocollo possono essere applicate ad altre malattie che coinvolgono la funzione delle cellule epiteliali, in particolare il trasporto di fluido cellulare epiteliale.
Confronto con altre metodologie Recentemente l'utilità di questo modello organoide è stata sviluppata correlando le risposte in vitro del modulatore CFTR degli organoidi dei pazienti con la loro risposta clinica11. In particolare, è anche dimostrato che il modello attuale è parallelo alle risposte di corrente di cortocircuito, l'attuale gold standard per la valutazione della funzione CFTR, negli stessi pazienti. La corrente di cortocircuito differisce dal saggio di rigonfiamento perché il primo misura la funzione CFTR tramite il trasportoionico 26. Al contrario, questo test misura un effetto più a valle con il trasporto del fluido, fornendo ulteriori informazioni sulla funzione complessiva di CFTR 27,28,29,30,31,32. Le misurazioni della corrente di cortocircuito hanno continuato ad essere un metodo comune e affidabile per determinare l'attivitàdel canale del cloruro CFTR 1,33. Questi saggi elettrofisiologici richiedono attrezzature specializzate e costose, richiedono molte volte più celle per ogni replica sperimentale rispetto al saggio organoide, non possono essere facilmente automatizzati e non sono suscettibili di scalabilità per applicazioni a produttività più elevata. Un altro modello organoide derivato dagli epiteli intestinali ha ulteriori vantaggi 15,16,17,18, come una più eccellente capacità replicativa, ma non è né derivato da un tessuto delle vie aeree né è universalmente disponibile. Le spazzolature HNE sono ottenute con spazzole citologiche economiche senza la necessità di sedazione e con un rischio minimo. Ottenere la spazzolatura non richiede un medico e può essere eseguita da coordinatori di ricerca addestrati e altro personale di ricerca14. Il modello organoide HNE può essere coltivato da qualsiasi laboratorio con capacità di coltura cellulare primaria e alcune delle applicazioni possono essere eseguite con tecniche di microscopia standard. Complessivamente, questi vantaggi forniscono un ulteriore accesso alla tecnologia per valutare la funzione epiteliale delle vie aeree che altrimenti potrebbe non essere disponibile per alcuni laboratori. Inoltre, gli organoidi HNE possono essere utilizzati per studiare altri stati patologici che colpiscono le vie aeree, come la discinesia ciliare primaria25 o l'infezione virale, che gli organoidi intestinali non possono.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Nasal brush</td>
			<td>Medical Packaging CYB1</td>
			<td>CYB-1</td>
			<td>Length: 8 inches, width approximately 7 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large-Orifice Pipette Tips</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>02-707-141</td>
			<td>Large bore pipette tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>Cell detachment solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% trypsin -EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor from soybean</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6522</td>
			<td>Working solution: 1mg/mL in 1XDPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356255</td>
			<td>Extracellular matrix (EM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide Angiogenesis</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81506</td>
			<td>15-well slide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-Well Transwell</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7200154</td>
			<td>Culture insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chambered Coverglass</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>155409</td>
			<td>8-well glass-bottom chamber slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>354240</td>
			<td>Cell adhesive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>50980487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A16046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucBlue</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>R37605</td>
			<td>DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ts2-FL (Inverted Routine Microscope)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Inverted epi-fluorescence microscope or bright-field microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R-HD25</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements- Basic Research</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>manual imaging analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histogel</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Base Molds</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>41-740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lionheart FX</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BTLFX</td>
			<td>Automated image system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lionheart Cover</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1450009</td>
			<td>Environmental Control Lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity Chamber</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1450006</td>
			<td>Stage insert (environmental chamber)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Controller for CO2 and O2</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1210013</td>
			<td>Gas controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate/Slide Stage Insert</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1450527</td>
			<td>Slide holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5 Imaging Prime Software</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BTGEN5IPRIM</td>
			<td>Automated imaging analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x Phase Contrast Objective</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1320515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Phase Contrast Objective</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1320516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED Cube</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1225007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Cube (DAPI)</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1225100</td>
			<td>DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFTRinh-172</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S7139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBMX</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expansion Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12 Nutrient mix</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;16140-071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;15-140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;C8052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;PHG0314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone (HC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;H0888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;A2786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>&#160;04-0012-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceftazidime</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>&#160;J66460-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tobramycin</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>&#160;J67340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vancomycin</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>&#160;J67251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Differentiation Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 (1:1)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;11330-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultroser-G</td>
			<td>Pall</td>
			<td>&#160;15950-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Clone II</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>&#160;SH30066.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Brain Extract</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>&#160;CC-4098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;I-9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;H-0888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triiodothyronine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;T-6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;T-0665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanolamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;E-0135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epinephrine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-4250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-Phosphorylethanolamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R-2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human CFTR antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB1660</td>
			<td>Dilution: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZO-1 antibody</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>MA3-39100-A647</td>
			<td>Dilution: 1000x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MUC5B antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HPA008246</td>
			<td>Dilution: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-acetylated tubulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7451</td>
			<td>Dilution: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-beta IV Tubulin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab11315</td>
			<td>Dilution: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21202</td>
			<td>Dilution: 2000x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21207</td>
			<td>Dilution: 2000x</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture and imaging of human nasal epithelial organoids

La terapia individualizzata per i pazienti con fibrosi cistica (FC) può essere ottenuta con un modello di malattia in vitro per comprendere l'attività basale del regolatore di conduttanza transmembrana della fibrosi cistica (CFTR) e il ripristino da composti di piccole molecole. Il nostro gruppo si è recentemente concentrato sulla creazione di un modello organoide ben differenziato direttamente derivato dalle cellule epiteliali nasali umane primarie (HNE). L'istologia degli organoidi sezionati, la colorazione immunofluorescente a montaggio intero e l'imaging (utilizzando microscopia confocale, microscopia immunofluorescente e campo luminoso) sono essenziali per caratterizzare gli organoidi e confermare la differenziazione epiteliale in preparazione di saggi funzionali. Inoltre, gli organoidi HNE producono lumen di varie dimensioni che si correlano con l'attività CFTR, distinguendo tra organoidi CF e non CF. In questo manoscritto, la metodologia per la coltivazione degli organoidi HNE è descritta in dettaglio, concentrandosi sulla valutazione della differenziazione utilizzando le modalità di imaging, compresa la misurazione dell'area del lume basale (un metodo di misurazione dell'attività CFTR negli organoidi che qualsiasi laboratorio con un microscopio può impiegare) e l'approccio automatizzato sviluppato a un saggio funzionale (che richiede attrezzature più specializzate).

L'espansione delle HNE è essenziale per una fiorente coltura di organoidi. Gli HNE da una raccolta di campioni di successo dovrebbero espandersi a oltre il 70% di confluenza intorno ai 10 giorni. Un esempio di campioni riusciti e non riusciti è mostrato rispettivamente nella Figura 1A e nella Figura 1B. Le cellule devono essere scartate se non possono raggiungere il 70% di confluenza entro 14 giorni dalla co-coltura con cellule 3T3 irradiate. ...

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Culture and Imaging of Human Nasal Epithelial Organoids

Un protocollo dettagliato è presentato qui per descrivere un modello organoide in vitro da cellule epiteliali nasali umane. Il protocollo ha opzioni per le misurazioni che richiedono apparecchiature di laboratorio standard, con possibilità aggiuntive per attrezzature e software specializzati.

Coltura e imaging di organoidi epiteliali nasali umani

Individualized therapy for cystic fibrosis (CF) patients can be achieved with an in vitro disease model to understand baseline Cystic Fibrosis ...

La terapia individualizzata per i pazienti con fibrosi cistica può essere ottenuta da un modello di malattia in vitro per comprendere l'attività cftr al basale. Gli organoidi epiteliali nasali umani, o organoidi HNE, producono lumen di varie dimensioni che si correlano con l'attività CFTR, distinguendo tra organoidi CF e non CF. Qui, abbiamo descritto in dettaglio una metodologia per la coltivazione e l'imaging di questi organoidi HNE.Il trasporto ionico epiteliale disfunzionale, in particolare quello del cloruro e del bicarbonato, si traduce in una diminuzione del volume dei fluidi di rivestimento epiteliale. Ciò influisce anche sulle secrezioni di muco che portano a mucostasi e ostruzione. Pertanto, il nostro modello HNE è stato sviluppato per varie applicazioni, a seconda del design sperimentale e delle risorse dello sperimentatore.Oltre a valutare l'attività della CFTR al basale o in risposta alle terapie, questa tecnica può essere applicata anche ad altre malattie che coinvolgono la funzione delle cellule epiteliali, in particolare il trasporto di fluido cellulare epiteliale. Questi metodi sono stati sviluppati principalmente per l'uso negli studi sulla fibrosi cistica. Altri studi che valutano gli epiteli delle vie aeree, come la discinesia ciliare primaria, possono anche trovare utili questi metodi.Queste tecniche richiedono attenzione ai dettagli e precisione. Richiedono anche un'attenta osservazione per garantire che l'espansione iniziale delle cellule sia appropriata. Monitora tutte le culture ogni giorno e il successo sarà più probabile.Per iniziare, dissociare la biopsia del pennello nasale in 8 milliters di mezzi RPMI in un tubo conico da 15 millilitri facendo passare il pennello citologico più volte attraverso una punta di pipetta di un millilitro di grande diametro. Centrifugare le cellule a 500 volte g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Scartare il surnatante e quindi sospendere nuovamente il pellet cellulare in tre millilitri di soluzione di distacco cellulare.Incubare a temperatura ambiente per 16 minuti per digerire. Utilizzare cinque millilitri del mezzo di espansione per lavare le celle due volte. Quindi, aggiungili a un pallone T75, pre-seminato con fibroblasti 3T3 irradiati, inattivati e dal 50 al 60% confluenti.Consentire alle cellule di co-coltivare ed espandersi nel mezzo di espansione per 7-14 giorni. Se gli antibiotici sono stati introdotti per le cellule derivate da pazienti con fibrosi cistica, i mezzi devono essere sostituiti con mezzi di espansione privi di antibiotici dopo i primi tre giorni di coltura e possono continuare a cambiare i mezzi ogni due giorni fino all'80% di confluenti. Lavare le celle con 1x DPBS.Quindi, aggiungere 1,5 millilitri di 0,05% di tripsina-EDTA nel pallone T75 e incubare per quattro minuti a 37 gradi Celsius per rimuovere il fibroblasto 3T3 irradiato e inattivato dalla coltura. Risciacquare il pallone T75 con 1x DPBS due volte per lavare accuratamente via eventuali fibroblasti 3T3 rimanenti. Aggiungere 1,5 millilitri di 0,05% di tripsina-EDTA nel matraccio T75 e incubare per 10 minuti a 37 gradi Celsius per staccare gli HNE.Neutralizzare la tripsina con inibitore della tripsina di soia in un rapporto uno-a-uno. Centrifugare le cellule a 500 volte gi per cinque minuti. Quindi, scartare il surnatante e lavare le cellule con cinque millilitri di mezzi di espansione una volta.Le cellule sono ora pronte per la semina per far crescere gli organoidi. Scongelare la matrice extracellulare della coltura organoide o ECM durante la notte a quattro gradi Celsius. Raffreddare le diapositive di angiogenesi a 15 pozzetti durante la notte alla stessa temperatura.Quindi, raffreddare le punte della pipetta a quattro gradi Celsius. Rivestire i vetrini con cinque microlitri di freddo 100% ECM su ghiaccio. Metterli in un incubatore di colture cellulari a 37 gradi Celsius per almeno 30 minuti per il consolidamento.Contare gli HNE raccolti dalla co-coltura usando un emocitometro. Quindi, diluire le cellule a 500 cellule per microlitri in numero totale, con il 20% di ECM diluito dai mezzi di differenziazione sul ghiaccio. Estrarre i vetrini rivestiti in ECM dall'incubatore e seminare cinque microlitri della miscela ECM a celle fredde in ciascuno dei pozzetti.Trasferire immediatamente i vetrini in un incubatore di coltura a 37 gradi Celsius per un'ora per consolidare la miscela ECM cellulare. Successivamente, estrarre i vetrini dall'incubatore e alimentare le cellule in ciascun pozzetto dei vetrini di angiogenesi a 15 pozzetti con 50 microlitri del mezzo di differenziazione. Restituire la diapositiva nell'incubatore di colture a 37 gradi Celsius, cambiando il supporto a giorni alterni fino a quando gli organoidi sono pronti per ulteriori esperimenti.Pre-trattare le diapositive della camera con fondo di vetro a 8 pozzetti con adesivo cellulare per 30 minuti. Scartare la soluzione e asciugare all'aria i pozzetti per altri 30 minuti. Quindi, scartare il supporto dalla parte superiore dell'ECM e quindi aggiungere 50 microlitri del PBS 1x freddo in ciascun pozzetto delle diapositive a 15 pozzetti sul ghiaccio.Pipetta su e giù da tre a cinque volte utilizzando 200 microlitri della punta della pipetta di grande diametro. Erogare la soluzione al centro di un pozzo delle diapositive a camera a 8 pozzetti. Rimuovere immediatamente il liquido in eccesso dai pozzetti con una pipetta a punta fine.Quindi, posizionare lo scorrimento della camera in un incubatore a 37 gradi Celsius per 40 minuti per migliorare l'organoide aderente al fondo di vetro. Dopo 40 minuti, lavare delicatamente gli organoidi con 1x PBS due volte e fissarli con 300 microlitri di paraformaldeide al 4% in ciascun pozzetto per 30 minuti impostare la temperatura ambiente. Lavare due volte con 1x PBS e conservare gli organoidi in 1x PBS impostare quattro gradi Celsius per immunocolorare per un massimo di due settimane.Per raccogliere gli organoidi per gli studi istologici, rimuovere il supporto dalla coltura e aggiungere 50 microlitri di freddo uno 1x PBS in ogni pozzetto dei vetrini sul ghiaccio. Pipetta su e giù da tre a cinque volte utilizzando una punta della pipetta a foro grande da 200 microlitri. Combina tutte le soluzioni degli inserti di scorrimento o coltura a 15 pozzetti in un tubo conico da 15 millilitri su ghiaccio.Regolare il volume totale della soluzione nel tubo a 10 millilitri aggiungendo 1 PBS freddo. Centrifugare il tubo a quattro gradi Celsius, 300 volte g per cinque minuti. Quindi, aspirare il surnatante e aggiungere 60 microlitri di histogel caldo da mescolare con il pellet organoide usando una punta di pipetta di grande diametro da 200 microlitri.Trasferire immediatamente la sospensione in uno stampo istologico. Dopo aver consolidato l'istogel a temperatura ambiente, mettere il blocco dello stampo in paraformaldeide al 4% per la fissazione durante la notte a quattro gradi Celsius. Apri il software e fai clic con il pulsante destro del mouse nella parte inferiore dello schermo.Quindi, selezionare Controlli di analisi, quindi Risultati misurazione automatizzati. Aprire l'immagine organoide e selezionare da 5 a 10 organoidi con lumen visibili. Tenere premuto il tasto destro del mouse sull'immagine per aprire il menu e selezionare ROI poligonale per delineare l'organoide completo per ottenere la superficie totale dell'organoide.Quindi, delineare il lumen per ottenere l'area del lumen. Ripeti questo per gli organoidi rimanenti nel pozzo e tutti i pozzetti nel test. Infine, esporta i dati in Excel.Dividere l'area del lumen per la superficie totale e calcolare la media di tutti gli organoidi del campione per ottenere il baseline lumen Ratio. Le immagini di campo luminose rappresentano gli HNE di una raccolta di campioni riuscita e non riuscita. Gli HNE crescono bene in un grande cluster.Al contrario, gli HNE crescono male in due piccoli cluster che circondano le cellule 3T3 irradiate. Gli organoidi nella diapositiva a 15 pozzetti hanno immagini più precise e nitide di quelle nell'inserto della coltura. Oltre a questo, non è stata osservata alcuna differenza morfologica significativa in questi due metodi di coltura.Gli organoidi non CF hanno in genere un lume più grande e più fluido rispetto agli organoidi CF. La colorazione HNE negli organoidi di un soggetto non-CF, F508del/F508del, e la colorazione immunofluorescente delle ciglia in un organoide sono mostrate in queste immagini. Le ciglia colorate con tubulina acetilata, anticorpo secondario marcato FITC e i nuclei etichettati con DAPI sono mostrati qui.Le immagini di proiezione massima dei due organoidi rappresentativi mediante colorazione immunofluorescente a montaggio intero e le corrispondenti immagini di ricostruzione tridimensionale sono mostrate qui. Vengono mostrati muco e ciglia all'interno del lume degli organoidi. Le immagini grafiche rappresentano il test del gonfiore indotto da forskolina per testare la funzione CFTR sulle cellule epiteliali nasali primarie.Un esperimento rappresentativo di forskolina dose-risposta di volontari non CF è mostrato qui. La dose-risposta FSK viene confrontata con la variazione frazionaria media a un'ora, rispetto a otto ore, il che suggerisce che il test di otto ore può produrre una differenza di gonfiore più significativa tra diverse dosi di FSK rispetto a quelle a un'ora. L'area sotto la curva può mostrare una piccola differenza di gonfiore rispetto alla variazione frazionaria media a otto ore.Durante il tentativo di questa procedura, tieni presente che gli organoidi andranno persi durante il processo di raccolta, fissazione e colorazione. Quindi, è necessario prestare molta attenzione durante ogni fase e ottenere numeri di partenza sufficienti per garantire il successo. La crescita di organoidi in inserti di coltura può aiutare in questo senso, poiché queste tecniche sono sviluppate.Qui, abbiamo utilizzato reagenti e forniture disponibili in commercio per facilitare l'espansione ad altri investigatori. È stato inoltre sviluppato un test funzionale che utilizzava tecniche di microscopio comuni e attrezzature più specializzate.

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