Name: culture and imaging of human nasal epithelial organoids
Uploaded: 2021-12-17T14:00:00
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우리는이 프로토콜을 개발하기 위해 HNE 브러시 생검을 기증 한 모든 참가자의 기여에 감사드립니다. 연구 자원 봉사자 모집 및 샘플 수집을 조정해 주신 Latona Kersh와 Children's Research Unit 직원에게 감사드립니다. 릴리 덩, 조나단 베일리, 그리고 우리 실험실의 전 연수생이었던 스티븐 맥케이에게 기술 지원에 감사드립니다. 우리는 Zhong Liu와 Rui Zhao에게 기술적 인 도움을 주셔서 감사합니다. UAB의 CF 연구 센터 책임자 인 Steven M. Rowe는 리더십과 자원을 제공하며,이 없이는 이러한 작업이 불가능합니다. 또한 Biotek의 Sarah Guadiana에게 계측기 훈련 지원을 해준 Sarah Guadiana, UAB 고해상도 이미징 시설에서 공초점 현미경 검사 지원을 해준 Robert Grabski, UAB Histology Core에서 조직학적 지원을 해준 Dezhi Wang에게 감사드립니다. 이 연구는 국립 보건원 (NIH)의 지원을 받았습니다. 그랜트 K23HL143167 (JSG에), 낭포성 섬유증 재단 (CFF) 그랜트 GUIMBE18A0-Q (JSG에), 그레고리 플레밍 제임스 낭포성 섬유증 센터 [NIH 그랜트 R35HL135816 및 DK072482 및 버밍엄 앨라배마 CFF 대학 (UAB) 연구 개발 프로그램 (Rowe19RO)], UAB 임상 및 번역 과학 센터 (NIH 그랜트 UL1TR001417).

HNE 샘플은 앨라배마 어린이 병원에서 수집되었습니다. 여기에 설명 된 모든 절차와 방법은 버밍엄의 IRB 앨라배마 대학교 (UAB IRB # 151030001)의 승인을 받았습니다. 인간 비강 상피 세포 (HNEs)의 확장을 촉진하고 기능을 향상시키기 위해, 본 배양 방법은 잘 알려진 공기-액체 계면 (ALI) 배양 방법28,34로부터 적응된다. HNEs는 이전에 기술된 바와 같이 브러시 생...

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이 원고는 HNE 브러시 생검에서 유래 된기도 상피 오가노이드의 포괄적 인 라이브 및 고정 이미징을위한 상세한 방법론을 제공합니다. 그것은 개체에서 CFTR 활성을 결정할 수있는 기능적 분석을 설명합니다. HNE는 다양한 용도를 위한 최소 침습성 일차 조직을 제공합니다. 여기에 제공된 확장 기술은 오가노이드를 포함한 기도 질환을 모델링하는 데 사용될 수 있습니다. 오가노이드는 정밀한 치료 ?...

기술 소개 Ex vivo 배양 기반 분석은 정밀 의학 및 질병 병리 생리학 연구에 점점 더 많이 활용되는 도구입니다. 일차 인간 비강 상피 (HNE) 세포 배양은 낭포성 섬유증의 수많은 연구에 사용되어 왔으며 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 , 여러 장기에서 상피 세포 기능에 영향을 미치는 상염색체 열성 질환. HNE 배양은 전향적으로 얻을 수 있는 기도 상피의 재생 가능한 공급원을 제공하고 낭포성 섬유증 막횡단 전도도 조절기(CFTR) 활성을 시험하기 위해 전기생리학적 및 생화학적 특성을 되풀이합니다. HNE 세포는 일반적인 바이러스성 호흡기 면봉과 유사한 최소한의 부작용(14)으로 샘플링될 수 있다. HNE 브러쉬 생검으로부터 유래된 낭포성 섬유증 연구에 대한 모델을 기술하는 연구 작업은 최근11,13에 발표되었다. 일차 HNE2,3 및 장 조직15,16,17,18,19를 사용하는 다른 모델과 유사하지만, CF 연구에 사용하고 다른 기도 질환의 연구를 돕기 위해 이 모델의 분화 및 영상화에 대한 상세한 특성화가 여기에 기술되어 있다 13 . 오가노이드 모델은 불멸화된 세포주처럼 무제한이 아니지만, 조건부 재프로그래밍(조사되고 불활성화된 피더 섬유아세포 및 Rho-kinase 억제제 사용)에 의해 보다 줄기 세포 유사 상태20,21,22,23으로 확장될 수 있다. 이 방법을 사용하여 HNE 브러쉬 생검을 처리하면 완전히 분화 할 수있는 능력을 유지하면서 더 높은 처리량으로 여러 응용 분야에서 사용할 수있는 많은 수의 상피 세포가 생성됩니다. 이 프로토콜이 피더 세포를 사용하여 개발되었지만, 피더 세포 기술(14,24)을 피하고자 하는 조사자들에 의해 다른 방법론들이 사용될 수 있다.
폐 생물학에 대한 기술의 중요성 중요한 연구는 상피 세포의 세포막에 규칙적이고 기능하는 CFTR이 없으면 폐, 췌장, 간, 장 또는 기타 조직에서 어떻게 기능 장애를 초래하는지 이해하는 데 전념했습니다. 기능 장애가있는 상피 이온 수송, 특히 염화물과 중탄산염의 상피 이온 수송은 상피 라이닝 유체의 부피가 감소하고 점액 분비물의 변화를 일으켜 점액 정체 및 폐색으로 이어집니다. 원발성 섬모 운동 이상증과 같은 다른 기도 질환에서, 변경된 섬모 운동은 점액 클리어런스를 손상시키고 점액 정체 및 폐색(25)을 초래한다. 따라서, 현재의 HNE 오가노이드 모델은 조사자의 실험 설계 및 자원에 따라 다양한 응용을 위해 개발되고 있다. 여기에는 살아있는 세포 얼룩을 이용한 살아있는 세포 이미징이 포함됩니다. 형태학을 특성화하기 위한 고정 및 단면화; 항체로 면역 형광 염색 및 발광 내 구조를 파괴하는 것을 피하기 위해 전체 마운트 공초점 이미징; 및 섬모 비트 빈도 및 점액 수송의 정량적 측정을 위한 밝은 장 이미징 및 마이크로 광학 간섭 단층 촬영(13). 다른 조사자로의 확장을 용이하게 하기 위해, 상업적으로 이용가능한 시약 및 공급물을 배양에 사용하였다. 일반적인 현미경 기술과 더 전문화 된 장비를 사용하는 기능적 분석이 개발되었습니다. 전반적으로, 본 모델은 기준선에서 또는 치료제에 반응하여 CFTR 활성을 평가하도록 설계된 반면, 이 프로토콜에 기술된 기술은 상피 세포 기능, 특히 상피 세포 유체 수송을 수반하는 다른 질환에 적용될 수 있다.
다른 방법론과의 비교 최근에 이 오가노이드 모델의 유용성은 환자의 오가노이드의 시험관내 CFTR 조절제 반응을 그들의 임상 반응(11)과 상관관계에 의해 개발되었다. 특히, 본 모델이 동일한 환자에서 CFTR 기능을 평가하기 위한 현재의 황금 표준인 단락 전류 반응을 병렬화했다는 것도 입증되었다. 단락 전류는 전자가 이온 수송(26)을 통해 CFTR 기능을 측정하기 때문에 팽윤 분석과 다르다. 대조적으로, 이 분석은 유체 수송을 통한 더 많은 다운스트림 효과를 측정하여, CFTR 27,28,29,30,31,32의 전체 기능에 대한 추가 정보를 제공한다. 단락 전류 측정은 CFTR 염화물 채널 활성 1,33을 결정하기 위한 일반적이고 신뢰할 수 있는 방법임이 계속되고 있다. 이러한 전기생리학적 분석은 전문화되고 값비싼 장비가 필요하며, 오가노이드 분석법보다 각 실험 복제에 대해 몇 배 더 많은 세포를 필요로 하며, 쉽게 자동화할 수 없으며, 더 높은 처리량 애플리케이션을 위해 확장이 불가능하다. 장 상피로부터 유래된 또 다른 오가노이드 모델은 보다 우수한 복제 능력과 같은 추가적인 이점 15,16,17,18을 갖지만, 기도 조직으로부터 유래되거나 보편적으로 이용가능하지 않다. HNE 칫솔질은 진정 작용이 필요없고 최소한의 위험으로 저렴한 세포학 브러시로 얻을 수 있습니다. 양치질을 얻는 것은 임상의가 필요하지 않으며 훈련 된 연구 코디네이터 및 다른 연구 직원(14)에 의해 수행 될 수있다. HNE 오가노이드 모델은 일차 세포 배양 능력을 가진 모든 실험실에서 배양할 수 있으며, 일부 용도는 표준 현미경 기술로 수행할 수 있습니다. 전체적으로 이러한 장점은 일부 실험실에서 사용할 수없는 기도 상피 기능을 평가하기위한 기술에 대한 추가 액세스를 제공합니다. 또한, HNE 오가노이드는 장내 오가노이드가 할 수 없는 원발성 섬모 운동이상증25 또는 바이러스 감염과 같이 기도에 영향을 미치는 다른 질병 상태를 연구하는데 이용될 수 있다.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Nasal brush</td>
			<td>Medical Packaging CYB1</td>
			<td>CYB-1</td>
			<td>Length: 8 inches, width approximately 7 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large-Orifice Pipette Tips</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>02-707-141</td>
			<td>Large bore pipette tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>Cell detachment solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% trypsin -EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor from soybean</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6522</td>
			<td>Working solution: 1mg/mL in 1XDPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356255</td>
			<td>Extracellular matrix (EM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide Angiogenesis</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81506</td>
			<td>15-well slide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-Well Transwell</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7200154</td>
			<td>Culture insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chambered Coverglass</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>155409</td>
			<td>8-well glass-bottom chamber slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>354240</td>
			<td>Cell adhesive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>50980487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A16046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucBlue</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>R37605</td>
			<td>DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ts2-FL (Inverted Routine Microscope)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Inverted epi-fluorescence microscope or bright-field microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R-HD25</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements- Basic Research</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>manual imaging analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histogel</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Base Molds</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>41-740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lionheart FX</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BTLFX</td>
			<td>Automated image system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lionheart Cover</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1450009</td>
			<td>Environmental Control Lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity Chamber</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1450006</td>
			<td>Stage insert (environmental chamber)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Controller for CO2 and O2</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1210013</td>
			<td>Gas controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate/Slide Stage Insert</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1450527</td>
			<td>Slide holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5 Imaging Prime Software</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BTGEN5IPRIM</td>
			<td>Automated imaging analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x Phase Contrast Objective</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1320515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Phase Contrast Objective</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1320516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED Cube</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1225007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Cube (DAPI)</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1225100</td>
			<td>DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFTRinh-172</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S7139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBMX</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expansion Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12 Nutrient mix</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;16140-071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;15-140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;C8052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;PHG0314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone (HC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;H0888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;A2786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>&#160;04-0012-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceftazidime</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>&#160;J66460-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tobramycin</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>&#160;J67340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vancomycin</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>&#160;J67251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Differentiation Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 (1:1)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;11330-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultroser-G</td>
			<td>Pall</td>
			<td>&#160;15950-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Clone II</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>&#160;SH30066.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Brain Extract</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>&#160;CC-4098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;I-9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;H-0888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triiodothyronine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;T-6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;T-0665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanolamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;E-0135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epinephrine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-4250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-Phosphorylethanolamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R-2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human CFTR antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB1660</td>
			<td>Dilution: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZO-1 antibody</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>MA3-39100-A647</td>
			<td>Dilution: 1000x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MUC5B antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HPA008246</td>
			<td>Dilution: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-acetylated tubulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7451</td>
			<td>Dilution: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-beta IV Tubulin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab11315</td>
			<td>Dilution: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21202</td>
			<td>Dilution: 2000x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21207</td>
			<td>Dilution: 2000x</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture and imaging of human nasal epithelial organoids

낭포성 섬유증 (CF) 환자에 대한 개별화 된 치료는 기준선 낭포성 섬유증 막횡단 전도도 조절기 (CFTR) 활성 및 소분자 화합물로부터의 복원을 이해하기 위해 시험관 내 질병 모델로 달성 될 수 있습니다. 우리 그룹은 최근 일차 인간 비강 상피 세포 (HNE)에서 직접 파생 된 잘 분화 된 오가노이드 모델을 수립하는 데 중점을 두었습니다. 절편된 오가노이드의 조직학, 전체 탑재 면역형광 염색 및 이미징(공초점 현미경, 면역형광 현미경 및 밝은 필드 사용)은 기능적 분석에 대비하여 오가노이드를 특성화하고 상피 분화를 확인하는 데 필수적입니다. 또한, HNE 오가노이드는 CFTR 활성과 상관 관계가 있는 다양한 크기의 루멘을 생성하며, CF와 비-CF 오가노이드를 구별합니다. 이 원고에서는 HNE 오가노이드를 배양하기위한 방법론이 자세히 설명되어 있으며, 기준선 루멘 면적 측정 (현미경을 사용하는 모든 실험실에서 사용할 수있는 오가노이드에서 CFTR 활성 측정 방법)을 포함한 이미징 양식을 사용한 분화 평가뿐만 아니라 기능 분석에 대한 개발 된 자동화 된 접근법 (더 전문화 된 장비가 필요함)에 중점을 둡니다.

HNEs 확장은 번성하는 오가노이드 배양에 필수적입니다. 성공적인 샘플 수집의 HNE는 약 10 일 동안 70 % 이상의 합류로 확장되어야합니다. 성공한 샘플과 실패한 샘플의 예는 각각 그림 1A 및 그림 1B에 나와 있습니다. 조사된 3T3 세포와 공동 배양한 후 14일까지 70% 합류에 도달할 수 없는 경우 세포를 폐기해야 한다. 오염된 모든 세포는 추가적?...

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Culture and Imaging of Human Nasal Epithelial Organoids

상세한 프로토콜이 인간 비강 상피 세포로부터의 시험관내 오가노이드 모델을 기술하기 위해 여기에 제시된다. 이 프로토콜에는 표준 실험실 장비가 필요한 측정 옵션이 있으며 특수 장비 및 소프트웨어에 대한 추가 가능성이 있습니다.

인간 비강 상피 오가노이드의 문화와 이미징

Individualized therapy for cystic fibrosis (CF) patients can be achieved with an in vitro disease model to understand baseline Cystic Fibrosis ...

낭포성 섬유증 환자에 대한 개별화된 요법은 기준선에서 CFTR 활성을 이해하기 위해 시험관내 질환 모델에 의해 달성될 수 있다. 인간 비강 상피 오가노이드 또는 HNE 오가노이드는 CFTR 활성과 상관 관계가 있는 다양한 크기의 루멘을 생성하여 CF와 비-CF 오가노이드를 구별합니다. 여기에서는 이러한 HNE 오가노이드를 배양하고 이미징하는 방법론을 자세히 설명했습니다.기능장애성 상피 이온 수송, 특히 염화물 및 중탄산염의 상피 이온 수송은 상피 라이닝 유체의 부피 감소를 초래한다. 이것은 또한 점액 분비물에 영향을 미치며 점액 분비물과 폐색으로 이어집니다. 따라서 HNE 모델은 조사자의 실험 설계 및 자원에 따라 다양한 응용 분야를 위해 개발되었습니다.기준선에서 또는 치료제에 대한 반응으로 CFTR 활성을 평가하는 것 외에도,이 기술은 상피 세포 기능, 특히 상피 세포 유체 수송을 포함하는 다른 질병에도 적용될 수 있습니다. 이러한 방법은 주로 낭포성 섬유증 연구에 사용하기 위해 개발되었습니다. 원발성 섬모 운동 이상증과 같은기도 상피를 평가하는 다른 연구에서도 이러한 방법이 도움이 될 수 있습니다.이러한 기술은 세부 사항과 정밀도에주의를 기울여야합니다. 그들은 또한 세포의 초기 확장이 적절한지 확인하기 위해주의 깊은 관찰이 필요합니다. 매일 모든 문화를 모니터링하면 성공할 가능성이 더 큽니다.시작하려면 비강 브러시 생검을 15 밀리리터 원뿔형 튜브의 8 밀리터의 RPMI 배지로 해리시켜 세포학 브러시를 1 밀리리터의 대형 보어 피펫 팁을 통해 여러 번 통과시킵니다. 세포를 섭씨 네 도에서 5분 동안 500배 g에서 원심분리한다. 상청액을 버리고, 이어서 세포 펠릿을 세 밀리리터의 세포 분리 용액에 재현탁시킨다.소화시키기 위해 실온에서 16분 동안 인큐베이션한다. 다섯 밀리리터의 팽창 배지를 사용하여 세포를 두 번 세척하십시오. 그런 다음, 이들을 T75 플라스크에 첨가하고, 조사, 불활성화 및 50 내지 60% 합류성 3T3 섬유아세포로 미리 시딩한다.세포를 공동 배양하고 7 내지 14일 동안 팽창 배지에서 팽창시키도록 허용한다. 낭포성 섬유증 환자로부터 유래된 세포에 항생제를 도입한 경우, 배지는 배양 초기 사흘 후에 항생제가 없는 확장 배지로 교체되어야 하며, 80%가 합류할 때까지 이틀에 한 번씩 배지를 계속 바꿀 수 있다. 세포를 1x DPBS로 세척하십시오.이어서, 1.5 밀리리터의 0.05%트립신-EDTA를 T75 플라스크에 첨가하고, 섭씨 37도에서 4분 동안 인큐베이션하여 조사되고 불활성화된 3T3 섬유아세포를 배양물로부터 제거하였다. T75 플라스크를 1x DPBS로 두 번 헹구어 나머지 3T3 섬유아세포를 완전히 씻어냅니다. 1.5밀리리터의 0.05%트립신-EDTA를 T75 플라스크에 넣고 섭씨 37도에서 10분간 배양하여 HNE를 분리한다.트립신을 대두 트립신 억제제로 일대일 비율로 중화시킨다. 세포를 5분 동안 500배 gi에서 원심분리한다. 그런 다음 상청액을 버리고 세포를 다섯 밀리리터의 팽창 배지로 한 번 세척하십시오.세포는 이제 오가노이드를 성장시키기 위해 시딩할 준비가 되었습니다. 오가노이드 배양물을 세포외 매트릭스 또는 ECM을 섭씨 네 도에서 하룻밤 동안 해동시킨다. 15-웰 혈관신생 슬라이드를 동일한 온도에서 하룻밤 동안 식힌다.다음으로 피펫 팁을 섭씨 네 도까지 식히십시오. 얼음 위에 다섯 마이크로 리터의 차가운 100 % ECM으로 슬라이드를 코팅하십시오. 이들을 통합을 위해 적어도 30분 동안 섭씨 37도에서 세포 배양 배양기에 넣는다.혈구세포계를 사용하여 공동 배양물로부터 수확된 HNEs를 계수한다. 이어서, 세포를 총 수에서 마이크로리터 당 500개의 세포로 희석하고, 얼음 상에서 분화 배지에 의해 희석된 20%ECM으로 희석한다. ECM 코팅된 슬라이드를 인큐베이터에서 꺼내어 차가운 세포 ECM 혼합물 다섯 마이크로리터를 각각의 웰에 시드한다.슬라이드를 즉시 섭씨 37도에서 배양 배양기로 한 시간 동안 옮기고 세포 ECM 혼합물을 통합시킨다. 그 후, 슬라이드를 인큐베이터 밖으로 꺼내어 50 마이크로리터의 분화 배지로 15-웰 혈관신생 슬라이드의 각 웰에 세포를 공급한다. 슬라이드를 섭씨 37도에서 배양 배양기로 되돌려 놓고, 오가노이드가 추가 실험을 위해 준비될 때까지 격일로 배지를 바꿉니다.8웰 유리 바닥 챔버 슬라이드를 셀 접착제로 30분 동안 전처리하십시오. 용액을 버리고 웰을 30 분 동안 공기 건조시킵니다. 다음으로, ECM의 상단에서 매체를 버리고 50 마이크로리터의 차가운 1x PBS를 얼음 위의 15-웰 슬라이드의 각 웰에 첨가한다.대형 보어 피펫 팁 200 마이크로 리터를 사용하여 세 번에서 다섯 번 위아래로 피펫하십시오. 용액을 8웰 챔버 슬라이드의 웰 중앙에 분배합니다. 미세한 팁 피펫으로 웰에서 즉시 과도한 액체를 제거하십시오.이어서, 챔버 슬라이드를 섭씨 37도 인큐베이터에 넣고 40분 동안 두어 유리 바닥에 부착되는 오가노이드를 강화시킨다. 40분 후, 오가노이드를 1x PBS로 두 번 부드럽게 세척하고, 30분 동안 각 웰에 4% 파라포름알데히드 300 마이크로리터로 고정하여 실온으로 설정하였다. 1x PBS로 두 번 세척하고, 오르가노이드를 최대 2주 동안 면역염색을 위해 섭씨 4도 설정된 1x PBS에 저장한다.조직학적 연구를 위한 오가노이드를 수확하기 위해, 배양물에서 배지를 제거하고 50 마이크로리터의 차가운 1x PBS를 얼음 위의 슬라이드의 각 웰에 첨가한다. 200 마이크로 리터의 대형 보어 피펫 팁을 사용하여 세 번에서 다섯 번 위아래로 피펫을 만듭니다. 15웰 슬라이드 또는 배양 인서트의 모든 용액을 얼음 위의 15밀리리터 원뿔형 튜브에 결합합니다.차가운 1x PBS를 추가하여 튜브의 총 용액 부피를 10 밀리리터로 조정하십시오. 튜브를 섭씨 네 도, 300 배 g에서 5 분 동안 원심분리하십시오. 그런 다음 상청액을 흡인하고 60 마이크로 리터의 따뜻한 히스토겔을 첨가하여 200 마이크로 리터의 대형 보어 피펫 팁을 사용하여 오가노이드 펠렛과 혼합하십시오.현탁액을 즉시 조직학 주형으로 옮깁니다. 실온에서 히스토겔을 응고시킨 후, 몰드 블록을 4% 파라포름알데히드에 넣어 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 고정시킨다. 소프트웨어를 열고 화면 하단을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하십시오.그런 다음 분석 컨트롤을 선택한 다음 자동 측정 결과를 선택합니다. 오가노이드 이미지를 열고 루멘이 보이는 5~10개의 오가노이드를 선택합니다. 이미지를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 메뉴를 열고 다각형 ROI를 선택하여 전체 오가노이드의 윤곽을 그려 오가노이드의 전체 표면적을 얻습니다.그런 다음 루멘 영역을 얻기 위해 루멘을 윤곽을 그립니다. 웰 내의 나머지 오가노이드 및 분석의 모든 웰에 대해 이것을 반복한다. 마지막으로 데이터를 Excel로 내보냅니다.루멘 면적을 전체 표면적으로 나누고 샘플의 모든 오가노이드를 평균하여 기준선 루멘 비율을 얻습니다. 밝은 필드 이미지는 성공적이고 실패한 샘플 컬렉션의 HNE를 나타냅니다. HNE는 큰 클러스터에서 잘 자랍니다.대조적으로, HNEs는 조사된 3T3 세포를 둘러싸고 있는 두 개의 작은 클러스터에서 잘 성장하지 못한다. 15웰 슬라이드의 오가노이드는 배양 인서트의 오가노이드보다 더 정확하고 선명한 이미지를 가지고 있습니다. 이 외에도 이 두 가지 배양 방법에서 유의한 형태학적 차이는 관찰되지 않았다.비 CF 오가노이드는 전형적으로 CF 오가노이드보다 더 큰 루멘과 더 많은 유체를 갖는다. 비 CF, F508del/F508del 피험자로부터의 오가노이드에서의 HNE 염색 및 오가노이드에서의 섬모의 면역형광 염색이 이들 이미지에 도시되어 있다. 아세틸화-튜불린, FITC 표지된 이차 항체, 및 DAPI로 표지된 핵으로 염색된 섬모를 여기에 나타내었다.전체 탑재 면역형광 염색에 의한 두 개의 대표적인 오가노이드의 최대 프로젝션 이미지 및 이들의 상응하는 입체 재구성 이미지가 여기에 도시되어 있다. 오가노이드의 내강 내의 점액과 섬모가 표시됩니다. 그래픽 이미지는 일차 비강 상피 세포에서 CFTR 기능을 테스트하기 위한 포스콜린-유도 팽윤 검정을 나타낸다.비 CF 자원자의 대표적인 포스콜린 용량-반응 실험이 여기에 제시되어 있다. FSK 용량-반응은 여덟 시간에 비해 한 시간에서의 평균 분획 변화와 비교되며, 이는 여덟 시간 분석이 한 시간에 있는 것보다 상이한 FSK 투여량들 사이에서 더 유의한 팽윤 차이를 생성할 수 있음을 시사한다. 곡선 아래의 영역은 여덟 시간에서의 평균 분수 변화와 비교하여 팽윤에서 약간의 차이를 나타낼 수 있다.이 절차를 시도하는 동안 오가노이드는 수집, 고정 및 염색 과정에서 손실된다는 것을 명심하십시오. 따라서 각 단계에서 세심한주의를 기울여야하며 성공을 보장하기 위해 충분한 시작 번호를 얻어야합니다. 배양 인서트에서 성장하는 오가노이드는 이러한 기술이 개발됨에 따라 이와 관련하여 도움이 될 수 있습니다.여기에서는 다른 조사자로의 확장을 용이하게하기 위해 상업적으로 이용 가능한 시약 및 공급품을 사용했습니다. 일반적인 현미경 기술과 더 전문화 된 장비를 사용하는 기능적 분석도 개발되었습니다.

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

인간의 태아 췌장 세포 클러스터의 분리, 문화, 및 이미징

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

연구

의학

Primary Culture of Human Vestibular Schwannomas

인간의 전정 신경초종의 차 문화

Vestibular schwannomas (VSs) represent Schwann cell (SC) tumors of the vestibular nerve, compromising 10% of all intracranial neoplasms. VSs occur in ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

분리, 냉동 보존 및 문화 임상 응용 프로그램에 대한 인간 양막 상피 세포

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Establishment of Human Epithelial Enteroids and Colonoids from Whole Tissue and Biopsy

전체 조직과 조직 검사에서 인간 상피 Enteroids과 Colonoids 설립

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem ...

Absorption of Nasal and Bronchial Fluids: Precision Sampling of the Human Respiratory Mucosa and Laboratory Processing of Samples

비 강 및 기관지 체액의 흡수: 인간의 호흡기 점 막 및 실험실 처리 샘플의 정밀 샘플링

The methods of nasal absorption (NA) and bronchial absorption (BA) use synthetic absorptive matrices (SAM) to absorb the mucosal lining fluid (MLF) of the ...

Standardized Measurement of Nasal Membrane Transepithelial Potential Difference (NPD)

Standardized Measurement of Nasal Membrane Transepithelial Potential Difference NPD

코 막 Transepithelial 잠재력 차이 (NPD)의 표준화 된 측정

We describe a standardized measurement of nasal potential difference (NPD). In this technique, cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) ...

Generation of Human Nasal Epithelial Cell Spheroids for Individualized Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Study

개별된 낭 성 섬유 증 막 횡단 전도성 레 귤 레이 터 연구에 대 한 인간의 비 강 상피 세포 Spheroids의 생성

While the introduction of Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) modulator drugs has revolutionized care in Cystic Fibrosis (CF), the ...

Muscle Imbalances: Testing and Training Functional Eccentric Hamstring Strength in Athletic Populations

근육의 불균형: 테스트 및 기능 편심 햄 스트링 운동 인구 강도 훈련

Many hamstring injuries that occur during physical activity occur while the muscles are lengthening, during eccentric hamstring muscle actions. Opposite ...

Quantitative Mapping of Specific Ventilation in the Human Lung using Proton Magnetic Resonance Imaging and Oxygen as a Contrast Agent

양성자 자기 공명 영상 및 조 영제로 산소를 사용 하 여 인간의 폐에 특정 통풍의 정량 매핑

Specific ventilation imaging (SVI) is a functional magnetic resonance imaging technique capable of quantifying specific ventilation &#8213; the ratio of ...