Name: culture and imaging of human nasal epithelial organoids
Uploaded: 2021-12-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culture and Imaging of Human Nasal Epithelial Organoids at JoVE.com

Vi anerkjenner takknemlig bidragene fra alle deltakerne som donerte HNE børstebiopsier for å utvikle denne protokollen. Vi takker Latona Kersh og children's Research Unit ansatte for koordinering av studiens frivillige rekruttering og prøvesamlinger. Vi takker Lily Deng, Johnathan Bailey og Stephen Mackay, tidligere praktikanter i laboratoriet vårt, for teknisk assistanse. Vi takker Zhong Liu og Rui Zhao for deres tekniske hjelp. Steven M. Rowe, direktør for CF Research Center ved UAB, gir lederskap og ressurser, uten hvilket dette arbeidet ikke ville være mulig. Vi vil også takke Sarah Guadiana i Biotek for hjelp med instrumentopplæring, Robert Grabski for konfiskert mikroskopihjelp ved UAB High-Resolution Imaging Facility, og Dezhi Wang for histologisk hjelp ved UAB Histology Core. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (NIH.) Grant K23HL143167 (til JSG), Cystic Fibrosis Foundation (CFF) Grant GUIMBE18A0-Q (til JSG), Gregory Fleming James Cystic Fibrosis Center [NIH Grants R35HL135816 og DK072482 og CFF University of Alabama ved Birmingham (UAB) Research and Development Program (Rowe19RO)], og UAB Center for Clinical and Translational Science (NIH Grant UL1TR001417).

HNE-prøver ble samlet inn på Children's of Alabama hospital. Alle prosedyrer og metoder beskrevet her er godkjent av IRB University of Alabama i Birmingham (UAB IRB #151030001). For å lette utvidelsen og forbedre funksjonen til humane neseepitelceller (HNEer), er de nåværende dyrkingsmetodene tilpasset fra den velkjente luftvæskegrensesnitt (ALI) kulturmetoden28,34. HNE ble opprinnelig samlet inn av børstebiopsi som tidligere beskrevet</s...

<ol>
	<li>Brewington, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brushed+nasal+epithelial+cells+are+a+surrogate+for+bronchial+epithelial+CFTR+studies.">Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies.</a> JCI Insight. 3 (13), (2018).</li><li>Brewington, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+nasal+epithelial+cell+spheroids+for+individualized+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+study.">Generation of human nasal epithelial cell spheroids for individualized cystic fibrosis transmembrane conductance regulator study.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57492 (2018).</li><li>Brewington, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+CFTR+function+and+modulation+in+primary+human+nasal+cell+spheroids.">Detection of CFTR function and modulation in primary human nasal cell spheroids.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 17 (1), 26-33 (2017).</li><li>Bridges, M. A., Walker, D. C., Davidson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+and+control+nasal+epithelial+cells+harvested+by+a+brushing+procedure.">Cystic fibrosis and control nasal epithelial cells harvested by a brushing procedure.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. 27 (9), 684-686 (1991).</li><li>Bridges, M. A., Walker, D. C., Harris, R. A., Wilson, B. R., Davidson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultured+human+nasal+epithelial+multicellular+spheroids:+polar+cyst-like+model+tissues.">Cultured human nasal epithelial multicellular spheroids: polar cyst-like model tissues.</a> Biochemistry and Cell Biology. 69 (2-3), 102-108 (1991).</li><li>Collie, G., Buchwald, M., Harper, P., Riordan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+sweat+gland+epithelial+cells+from+normal+individuals+and+patients+with+cystic+fibrosis.">Culture of sweat gland epithelial cells from normal individuals and patients with cystic fibrosis.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. 21 (10), 597-602 (1985).</li><li>Conger, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+(CFTR)+and+ciliary+beat+frequency+activation+by+the+CFTR+Modulators+Genistein,+VRT-532,+and+UCCF-152+in+primary+sinonasal+epithelial+cultures.">Comparison of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) and ciliary beat frequency activation by the CFTR Modulators Genistein, VRT-532, and UCCF-152 in primary sinonasal epithelial cultures.</a> JAMA Otolaryngology-Head &amp; Neck Surgery. 139 (8), 822-827 (2013).</li><li>de Courcey, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+primary+human+nasal+epithelial+cell+cultures+for+the+study+of+cystic+fibrosis+pathophysiology.">Development of primary human nasal epithelial cell cultures for the study of cystic fibrosis pathophysiology.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 303 (11), 1173-1179 (2012).</li><li>Gruenert, D. C., Basbaum, C. B., Widdicombe, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+normal+and+cystic+fibrosis+epithelial+cells+grown+under+serum-free+conditions.">Long-term culture of normal and cystic fibrosis epithelial cells grown under serum-free conditions.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. 26 (4), 411-418 (1990).</li><li>Mosler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feasibility+of+nasal+epithelial+brushing+for+the+study+of+airway+epithelial+functions+in+CF+infants.">Feasibility of nasal epithelial brushing for the study of airway epithelial functions in CF infants.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 7 (1), 44-53 (2008).</li><li>Anderson, J. D., Liu, Z., Odom, L. V., Kersh, L., Guimbellot, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFTR+function+and+clinical+response+to+modulators+parallel+nasal+epithelial+organoid+swelling.">CFTR function and clinical response to modulators parallel nasal epithelial organoid swelling.</a> The American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 321 (1), 119-129 (2021).</li><li>Guimbellot, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasospheroids+permit+measurements+of+CFTR-dependent+fluid+transport.">Nasospheroids permit measurements of CFTR-dependent fluid transport.</a> JCI Insight. 2 (22), (2017).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+nasal+epithelial+organoids+for+therapeutic+development+in+cystic+fibrosis.">Human nasal epithelial organoids for therapeutic development in cystic fibrosis.</a> Genes (Basel). 11 (6), (2020).</li><li>Muller, L., Brighton, L. E., Carson, J. L., Fischer, W. A., Jaspers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+of+human+nasal+epithelial+cells+at+the+air+liquid+interface.">Culturing of human nasal epithelial cells at the air liquid interface.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2013).</li><li>Dekkers, J. F., vander Ent, C. K., Beekman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+opportunities+for+CFTR-targeting+drug+development+using+organoids.">Novel opportunities for CFTR-targeting drug development using organoids.</a> Rare Diseases. 1, 27112 (2013).</li><li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+CFTR+assay+using+primary+cystic+fibrosis+intestinal+organoids.">A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids.</a> Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).</li><li>Okiyoneda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism-based+corrector+combination+restores+DeltaF508-CFTR+folding+and+function.">Mechanism-based corrector combination restores DeltaF508-CFTR folding and function.</a> Nature Chemical Biology. 9 (7), 444-454 (2013).</li><li>Schwank, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+repair+of+CFTR+by+CRISPR/Cas9+in+intestinal+stem+cell+organoids+of+cystic+fibrosis+patients.">Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients.</a> Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).</li><li>Geurts, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-based+adenine+editors+correct+nonsense+mutations+in+a+cystic+fibrosis+organoid+biobank.">CRISPR-based adenine editors correct nonsense mutations in a cystic fibrosis organoid biobank.</a> Cell Stem Cell. 26 (4), 503-510 (2020).</li><li>Bove, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+in+vitro+alveolar+type+II+cell+proliferation+barrier+while+retaining+ion+transport+properties.">Breaking the in vitro alveolar type II cell proliferation barrier while retaining ion transport properties.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (4), 767-776 (2014).</li><li>Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+keratinocytes+are+efficiently+immortalized+by+a+Rho+kinase+inhibitor.">Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor.</a> Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2619-2626 (2010).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK+inhibitor+and+feeder+cells+induce+the+conditional+reprogramming+of+epithelial+cells.">ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells.</a> The American Journal of Pathology. 180 (2), 599-607 (2012).</li><li>Palechor-Ceron, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation+induces+diffusible+feeder+cell+factor(s)+that+cooperate+with+ROCK+inhibitor+to+conditionally+reprogram+and+immortalize+epithelial+cells.">Radiation induces diffusible feeder cell factor(s) that cooperate with ROCK inhibitor to conditionally reprogram and immortalize epithelial cells.</a> The American Journal of Pathology. 183 (6), 1862-1870 (2013).</li><li>Scudieri, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionocytes+and+CFTR+chloride+channel+expression+in+normal+and+cystic+fibrosis+nasal+and+bronchial+epithelial+cells.">Ionocytes and CFTR chloride channel expression in normal and cystic fibrosis nasal and bronchial epithelial cells.</a> Cells. 9 (9), (2020).</li><li>Marthin, J. K., Stevens, E. M., Larsen, L. A., Christensen, S. T., Nielsen, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+three-dimensional+explant+spheroids+derived+from+human+nasal+airway+epithelium:+a+simple+methodological+approach+for+ex+vivo+studies+of+primary+ciliary+dyskinesia.">Patient-specific three-dimensional explant spheroids derived from human nasal airway epithelium: a simple methodological approach for ex vivo studies of primary ciliary dyskinesia.</a> Cilia. 6, 3 (2017).</li><li>Blouquit, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+and+fluid+transport+properties+of+small+airways+in+cystic+fibrosis.">Ion and fluid transport properties of small airways in cystic fibrosis.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 174 (3), 299-305 (2006).</li><li>Birket, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+therapy+with+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+modulators+augment+the+airway+functional+microanatomy.">Combination therapy with cystic fibrosis transmembrane conductance regulator modulators augment the airway functional microanatomy.</a> The American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 310 (10), 928-939 (2016).</li><li>Birket, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+anatomic+defect+of+the+cystic+fibrosis+airway.">A functional anatomic defect of the cystic fibrosis airway.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 190 (4), 421-432 (2014).</li><li>Chu, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle-tracking+microrheology+using+micro-optical+coherence+tomography.">Particle-tracking microrheology using micro-optical coherence tomography.</a> Biophysical Journal. 111 (5), 1053-1063 (2016).</li><li>Chu, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.+In+vivo+imaging+of+airway+cilia+and+mucus+clearance+with+micro-optical+coherence+tomography.">et al. In vivo imaging of airway cilia and mucus clearance with micro-optical coherence tomography.</a> Biomedical Optics Express. 7 (7), 2494-2505 (2016).</li><li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+quantitative+study+of+airway+functional+microanatomy+using+micro-optical+coherence+tomography.">Method for quantitative study of airway functional microanatomy using micro-optical coherence tomography.</a> PLoS One. 8 (1), 54473 (2013).</li><li>Tuggle, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+defects+in+ion+transport+and+tissue+development+in+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+(CFTR)-knockout+rats.">Characterization of defects in ion transport and tissue development in cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-knockout rats.</a> PLoS One. 9 (3), 91253 (2014).</li><li>McCravy, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalised+medicine+for+non-classic+cystic+fibrosis+resulting+from+rare+CFTR+mutations.">Personalised medicine for non-classic cystic fibrosis resulting from rare CFTR mutations.</a> European Respiratory Journal. 56 (1), 2000062 (2020).</li><li>Mutyam, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+benefit+observed+with+the+CFTR+potentiator,+ivacaftor,+in+a+CF+patient+homozygous+for+the+W1282X+CFTR+nonsense+mutation.">Therapeutic benefit observed with the CFTR potentiator, ivacaftor, in a CF patient homozygous for the W1282X CFTR nonsense mutation.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 16 (1), 24-29 (2017).</li><li>Corning Inc. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> CORNING CELL-TAK CELL AND TISSUE ADHESIVE. , (2013).</li><li>Anderson, J. D., Liu, Z., Odom, L. V., Kersh, L., Guimbellot, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFTR+function+and+clinical+response+to+modulators+parallel+nasal+epithelial+organoid+swelling.">CFTR function and clinical response to modulators parallel nasal epithelial organoid swelling.</a> The American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 321 (1), 119-129 (2021).</li><li>Biotek Instruments, Incorporated. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Lionheart FX Live Cell Imager Operator's Manual. , (2016).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Simmonds, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+it+cystic+fibrosis?+The+challenges+of+diagnosing+cystic+fibrosis.">Is it cystic fibrosis? The challenges of diagnosing cystic fibrosis.</a> Paediatric Respiratory Reviews. 31, 6-8 (2019).</li><li>McGarry, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+and+in+vitro+ivacaftor+response+in+cystic+fibrosis+patients+with+residual+CFTR+function:+N-of-1+studies.">In vivo and in vitro ivacaftor response in cystic fibrosis patients with residual CFTR function: N-of-1 studies.</a> Pediatric Pulmonology. 52 (4), 472-479 (2017).</li><li>Garratt, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+culture+success+in+an+airway+epithelium+sampling+program+of+young+children+with+cystic+fibrosis.">Determinants of culture success in an airway epithelium sampling program of young children with cystic fibrosis.</a> Experimental Lung Research. 40 (9), 447-459 (2014).</li></ol>

Dette manuskriptet gir detaljerte metoder for omfattende levende og fast avbildning av luftveis epitelorganoider avledet fra HNE børstebiopsi. Den beskriver funksjonelle analyser som kan bestemme CFTR-aktivitet hos en person. HNEer gir et minimalt invasivt, primært vev for en rekke bruksområder. Ekspansjonsteknikkene som tilbys her kan brukes til modellering av luftveissykdom, inkludert organoider. Organoider kan brukes til presisjonsterapeutiske tilnærminger og for å overvåke stabiliteten til gen- eller mRNA-baser...

Introduksjon til teknikken Ex vivo kulturbaserte analyser er et stadig mer brukt verktøy for presisjonsmedisin og studiet av sykdom patofysiologi. Primær human nasal epitel (HNE) cellekultur har blitt brukt i en rekke studier av cystisk fibrose 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 , en autosomal recessiv sykdom som påvirker epitelcellefunksjonen i flere organer. HNE-kulturen gir en fornybar kilde til luftveisepilesi som kan oppnås prospektivt og rekapitulerer elektrofysiologiske og biokjemiske egenskaper for å teste Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator (CFTR) aktivitet. HNE-celler kan prøves med minimale bivirkninger14, som ligner vanlige virale respiratoriske vattpinner. Forskningsarbeid som beskriver en modell for cystisk fibrosestudie avledet fra HNE børstebiopsier har nylig blitt publisert11,13. Mens ligner på andre modeller som bruker primær HNE 2,3 og tarmvev 15,16,17,18,19, er detaljert karakterisering av differensiering og avbildning av denne modellen beskrevet her for bruk i CF-forskning og for å hjelpe til med studier av andre luftveissykdommer13 . Den organoide modellen er ikke ubegrenset som udødelige cellelinjer, men kan utvides ved betinget omprogrammering (ved hjelp av bestrålede og inaktiverte materfibroblaster og Rho-kinase-hemmere) til en mer stamcellelignende tilstand 20,21,22,23. Behandlingen av HNE børstebiopsier ved hjelp av denne metoden gir et stort antall epitelceller for bruk i flere applikasjoner med høyere gjennomstrømning, samtidig som de beholder evnen til å skille seg helt ut. Mens denne protokollen ble utviklet ved hjelp av materceller, kan andre metoder brukes av etterforskere som ønsker å unngå matercelleteknologi14,24.
Teknikkens betydning for lungebiologien En betydelig studie har vært viet til å forstå hvordan fraværet av vanlig, fungerende CFTR i cellemembranen til epitelceller resulterer i dysfunksjon i lungene, bukspyttkjertelen, leveren, tarmen eller andre vev. Dysfunksjonell epitelial iontransport, spesielt klorid og bikarbonat, resulterer i et redusert volum av epitelforingsvæsker og endringer i slimete sekreter, noe som fører til slimete stasis og obstruksjon. Ved andre luftveissykdommer, som primær ciliary dyskinesi, svekker endret ciliary bevegelse mucociliary clearance og fører til slimete stasis og obstruksjon25. Derfor er den nåværende HNE organoid-modellen utviklet for ulike bruksområder, avhengig av undersøkerens eksperimentelle design og ressurser. Dette inkluderer levende cellebilder ved hjelp av levende celleflekker; fiksering og seksjonering for å karakterisere morfologien; immunfluorescensfarging med antistoffer og helmontert konføling for å unngå å forstyrre intraluminale strukturer; og lysfeltavbildning og mikrooptisk koherenstomografi for kvantitative målinger av ciliary beatfrekvens og mucociliary transport13. For å lette ekspansjonen til andre etterforskere ble kommersielt tilgjengelige reagenser og forsyninger brukt til dyrking. En funksjonell analyse ble utviklet som brukte vanlige mikroskopteknikker og mer spesialisert utstyr. Totalt sett, mens den nåværende modellen ble designet for å vurdere CFTR-aktivitet ved baseline eller som svar på terapeutiske behandlinger, kan teknikkene beskrevet i denne protokollen brukes på andre sykdommer som involverer epitelcellefunksjon, spesielt epitelcellevæsketransport.
Sammenligning med andre metoder Nylig ble nytten av denne organoidmodellen utviklet ved å korrelere in vitro CFTR-modulatorresponser fra pasientens organoider med deres kliniske respons11. Spesielt er det også demonstrert at den nåværende modellen parallelt kortslutningsstrømresponser, den nåværende gullstandarden for å vurdere CFTR-funksjon, hos de samme pasientene. Kortslutningsstrømmen skiller seg fra hevelsesanalysen fordi førstnevnte måler CFTR-funksjon via iontransport26. Derimot måler denne analysen en mer nedstrøms effekt med væsketransport, og gir ytterligere informasjon om den generelle funksjonen til CFTR 27,28,29,30,31,32. Kortslutningsstrømmålinger har fortsatt å være en vanlig og pålitelig metode for å bestemme CFTR-kloridkanalaktivitet 1,33. Disse elektrofysiologiske analysene krever spesialisert, dyrt utstyr, krever mange ganger flere celler for hver eksperimentelle replikering enn den organoide analysen, kan ikke enkelt automatiseres, og er ikke egnet til å skalere opp for høyere gjennomstrømningsapplikasjoner. En annen organoid modell avledet fra intestinal epithelia har ytterligere fordeler 15,16,17,18, for eksempel mer utmerket replikeringsevne, men er verken avledet fra et luftveisvev eller er universelt tilgjengelig. HNE-børsting oppnås med billige cytologibørster uten behov for sedasjon og med minimal risiko. Å få pusset krever ikke en kliniker og kan utføres av utdannede forskningskoordinatorer og andre forskningspersonell14. HNE organoid-modellen kan dyrkes av ethvert laboratorium med primære cellekulturfunksjoner, og noen av applikasjonene kan utføres med standard mikroskopiteknikker. Til sammen gir disse fordelene ytterligere tilgang til teknologi for å vurdere epitelfunksjon for luftveier som ellers kunne være utilgjengelig for noen laboratorier. Videre kan HNE organoider brukes til å studere andre sykdomstilstander som påvirker luftveiene, for eksempel primær ciliary dyskinesi25 eller virusinfeksjon, som intestinale organoider ikke kan.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Nasal brush</td>
			<td>Medical Packaging CYB1</td>
			<td>CYB-1</td>
			<td>Length: 8 inches, width approximately 7 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large-Orifice Pipette Tips</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>02-707-141</td>
			<td>Large bore pipette tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>Cell detachment solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% trypsin -EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor from soybean</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6522</td>
			<td>Working solution: 1mg/mL in 1XDPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356255</td>
			<td>Extracellular matrix (EM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide Angiogenesis</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81506</td>
			<td>15-well slide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-Well Transwell</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7200154</td>
			<td>Culture insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chambered Coverglass</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>155409</td>
			<td>8-well glass-bottom chamber slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>354240</td>
			<td>Cell adhesive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>50980487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A16046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucBlue</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>R37605</td>
			<td>DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ts2-FL (Inverted Routine Microscope)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Inverted epi-fluorescence microscope or bright-field microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R-HD25</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements- Basic Research</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>manual imaging analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histogel</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Base Molds</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>41-740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lionheart FX</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BTLFX</td>
			<td>Automated image system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lionheart Cover</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1450009</td>
			<td>Environmental Control Lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity Chamber</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1450006</td>
			<td>Stage insert (environmental chamber)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Controller for CO2 and O2</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1210013</td>
			<td>Gas controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate/Slide Stage Insert</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1450527</td>
			<td>Slide holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5 Imaging Prime Software</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BTGEN5IPRIM</td>
			<td>Automated imaging analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x Phase Contrast Objective</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1320515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Phase Contrast Objective</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1320516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED Cube</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1225007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Cube (DAPI)</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1225100</td>
			<td>DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFTRinh-172</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S7139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBMX</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expansion Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12 Nutrient mix</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;16140-071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;15-140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;C8052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;PHG0314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone (HC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;H0888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;A2786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>&#160;04-0012-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceftazidime</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>&#160;J66460-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tobramycin</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>&#160;J67340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vancomycin</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>&#160;J67251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Differentiation Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 (1:1)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;11330-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultroser-G</td>
			<td>Pall</td>
			<td>&#160;15950-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Clone II</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>&#160;SH30066.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Brain Extract</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>&#160;CC-4098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;I-9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;H-0888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triiodothyronine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;T-6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;T-0665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanolamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;E-0135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epinephrine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-4250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-Phosphorylethanolamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R-2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human CFTR antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB1660</td>
			<td>Dilution: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZO-1 antibody</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>MA3-39100-A647</td>
			<td>Dilution: 1000x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MUC5B antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HPA008246</td>
			<td>Dilution: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-acetylated tubulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7451</td>
			<td>Dilution: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-beta IV Tubulin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab11315</td>
			<td>Dilution: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21202</td>
			<td>Dilution: 2000x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21207</td>
			<td>Dilution: 2000x</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture and imaging of human nasal epithelial organoids

Individualisert behandling for cystisk fibrose (CF) pasienter kan oppnås med en in vitro sykdomsmodell for å forstå baseline Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator (CFTR) aktivitet og restaurering fra små molekylforbindelser. Vår gruppe fokuserte nylig på å etablere en godt differensiert organoidmodell direkte avledet fra primære humane neseepitelceller (HNE). Histologi av seksjonerte organoider, helmontert immunfluorescerende farging og avbildning (ved hjelp av konfomisk mikroskopi, immunfluorescerende mikroskopi og lyst felt) er avgjørende for å karakterisere organoider og bekrefte epiteldifferensiering som forberedelse til funksjonelle analyser. Videre produserer HNE organoider lumen av varierende størrelse som korrelerer med CFTR-aktivitet, som skiller mellom CF og ikke-CF organoider. I dette manuskriptet er metodikken for å dyrke HNE-organoider beskrevet i detalj, med fokus på vurdering av differensiering ved hjelp av avbildningsmodaliteter, inkludert måling av baseline lumenområde (en metode for CFTR-aktivitetsmåling i organoider som ethvert laboratorium med et mikroskop kan bruke) samt den utviklede automatiserte tilnærmingen til en funksjonell analyse (som krever mer spesialisert utstyr).

HNEs ekspansjon er avgjørende for en blomstrende organoidkultur. HNEer fra en vellykket utvalgssamling bør utvides til over 70% samløp rundt 10 dager. Et eksempel på vellykkede og mislykkede prøver vises i henholdsvis figur 1A og figur 1B. Cellene må kastes hvis de ikke kan nå 70% samløp med 14 dager etter samkultur med bestrålede 3T3 celler. Eventuelle forurensede celler skal umiddelbart kastes hvis de ikke kan reddes med ytterligere a...

Watch this Scientific Journal Video about Culture and Imaging of Human Nasal Epithelial Organoids at JoVE.com

Culture and Imaging of Human Nasal Epithelial Organoids

En detaljert protokoll presenteres her for å beskrive en in vitro organoid modell fra menneskelige nese epitelceller. Protokollen har muligheter for målinger som krever standard laboratorieutstyr, med tilleggsmuligheter for spesialutstyr og programvare.

Kultur og bildebehandling av humane neseepitelorganoider

Individualized therapy for cystic fibrosis (CF) patients can be achieved with an in vitro disease model to understand baseline Cystic Fibrosis ...

Individualisert behandling for cystiske fibrosepasienter kan oppnås ved en in vitro sykdomsmodell for å forstå CFTR-aktiviteten ved baseline. Humane neseepitele organoider, eller HNE-organoider, produserer lumen av varierende størrelse som korrelerer med CFTR-aktiviteten, som skiller mellom CF og ikke-CF organoider. Her har vi beskrevet en metodikk for dyrking og avbildning av disse HNE-organoidene i detalj.Dysfunksjonell epitelial iontransport, spesielt klorid og bikarbonat, resulterer i et redusert volum av epitelforingsvæskene. Dette påvirker også slimsekretjonene som fører til slimstasis og obstruksjon. Derfor er vår HNE-modell utviklet for ulike bruksområder, avhengig av undersøkerens eksperimentelle design og ressurser.Bortsett fra å vurdere CFTR-aktivitet ved baseline eller som svar på terapeutiske behandlinger, kan denne teknikken også brukes på andre sykdommer som involverer epitelcellefunksjon, spesielt epitelcellevæsketransport. Disse metodene ble utviklet primært for bruk i cystiske fibrosestudier. Andre studier som evaluerer luftveisepilelia, som primær ciliary dyskinesi, kan også finne disse metodene nyttige.Disse teknikkene krever oppmerksomhet på detaljer og presisjon. De krever også nøye observasjon for å sikre at den første utvidelsen av celler er hensiktsmessig. Overvåk alle kulturer hver dag, og suksessen vil være mer sannsynlig.Til å begynne med, dissosier nesebørstebiopsien til 8 milliters RPMI-medier i et 15 milliliter konisk rør ved å passere cytologibørsten flere ganger gjennom en milliliter storboret pipettespiss. Sentrifuger cellene ved 500 ganger g i fem minutter ved fire grader Celsius. Kast supernatanten og sett deretter cellepelleten på nytt i tre milliliter celleavløsningsløsning.Inkuber ved romtemperatur i 16 minutter for å fordøye. Bruk fem milliliter av ekspansjonsmediet til å vaske cellene to ganger. Legg dem deretter til en T75-kolbe, pre-seed med bestrålede, inaktiverte og 50 til 60% sammenfallende 3T3 fibroblaster.La cellene samkultur og utvide i ekspansjonsmediene i 7 til 14 dager. Hvis antibiotika ble introdusert for celler avledet fra pasienter med cystisk fibrose, bør media erstattes med antibiotikafrie ekspansjonsmedier etter de første tre dagene av kulturen, og kan fortsette å endre medier annenhver dag til 80% sammenløp. Vask cellene med 1x DPBS.Deretter legger du til 1,5 milliliter 0,05% trypsin-EDTA i T75-kolben og inkuberer i fire minutter ved 37 grader Celsius for å fjerne den bestrålede og inaktiverte 3T3 fibroblast fra kulturen. Skyll T75-kolben med 1x DPBS to ganger for å vaske bort eventuelle gjenværende 3T3 fibroblaster grundig. Tilsett 1,5 milliliter 0,05% trypsin-EDTA i T75-kolben og inkuber i 10 minutter ved 37 grader Celsius for å løsne HNEer.Nøytraliser trypsin med soyabønne trypsinhemmer med et en-til-en-forhold. Sentrifuger cellene til 500 ganger gi i fem minutter. Kast deretter supernatanten og vask cellene med fem milliliter ekspansjonsmedier en gang.Cellene er nå klare for såing for å vokse organoider. Tine den organoide kulturen ekstracellulær matrise eller ECM over natten ved fire grader Celsius. Avkjøl 15-brønns angiogenese glir over natten ved samme temperatur.Deretter avkjøler du pipettespissene til fire grader Celsius. Belegge lysbildene med fem mikroliter kald 100% ECM på is. Plasser dem i en cellekulturinkubator ved 37 grader Celsius i minst 30 minutter for konsolidering.Tell HNEene som høstes fra samkulturen ved hjelp av et hemocytometer. Fortynn deretter cellene til 500 celler per mikroliter i totalt antall, med 20% ECM fortynnet av differensieringsmedier på is. Ta ECM-belagte lysbilder ut av inkubatoren og frø fem mikroliter av den kalde celle ECM-blandingen inn i hver av brønnene.Overfør lysbildene umiddelbart inn i en kulturinkubator ved 37 grader Celsius i en time for å konsolidere celle ECM-blandingen. Deretter tar du lysbildene ut av inkubatoren og mater cellene inn i hver brønn av de 15-brønns angiogenese lysbildene med 50 mikroliter av differensieringsmediet. Returner lysbildet inn i kulturinkubatoren ved 37 grader Celsius, endre media annenhver dag til organoidene er klare for videre eksperimenter.Forbehandle 8-brønns glassbunnkammersklier med cellelim i 30 minutter. Kast oppløsningen og lufttørk brønnene i ytterligere 30 minutter. Deretter kaster du mediet fra toppen av ECM og tilsetter deretter 50 mikroliter av den kalde 1x PBS i hver brønn av 15-brønns lysbildene på is.Pipette opp og ned tre til fem ganger ved hjelp av 200 mikroliter av den store pipettespissen. Dispenser løsningen på midten av en brønn av 8-brønns kammersklier. Fjern overflødig væske umiddelbart fra brønnene med en finspisspipette.Plasser deretter kammersklie inn i en 37 grader Celsius inkubator i 40 minutter for å forbedre organoiden som holder seg til glassbunnen. Etter 40 minutter, vask organoidene forsiktig med 1x PBS to ganger og fest dem med 300 mikroliter 4% paraformaldehyd i hver brønn i 30 minutter stille romtemperatur. Vask to ganger med 1x PBS og oppbevar organoidene i 1x PBS satt fire grader Celsius for immunstaining i opptil to uker.For å høste organoidene for histologiske studier, fjern media fra kulturen og tilsett 50 mikroliter kaldt en 1x PBS i hver brønn av lysbildene på is. Pipette opp og ned tre til fem ganger ved hjelp av en 200 mikroliter storboret pipettespiss. Kombiner alle løsningene fra 15-brønns skyve- eller kulturinnleggene i et 15 milliliter konisk rør på is.Juster det totale løsningsvolumet i røret til 10 milliliter ved å tilsette kald 1x PBS. Sentrifuger røret ved fire grader Celsius, 300 ganger g i fem minutter. Deretter aspirerer du supernatanten og tilsett 60 mikroliter varm histogel for å blande med den organoide pelletsen ved hjelp av en 200 mikroliter storboret pipettespiss.Overfør suspensjonen umiddelbart til en histologiform. Etter å ha konsolidert histogelen ved romtemperatur, legg muggblokken i 4% paraformaldehyd for fiksering over natten ved fire grader Celsius. Åpne programvaren og høyreklikk nederst på skjermen.Velg deretter Analysekontroller etterfulgt av Automatiserte måleresultater. Åpne det organoide bildet og velg 5 til 10 organoider med synlige lumen. Hold høyreklikk på bildet for å åpne menyen og velg Polygonal avkastning for å skissere hele organoiden for å oppnå organoidens totale overflateareal.Deretter skisserer lumen for å oppnå lumenområdet. Gjenta dette for de resterende organoidene i brønnen, og alle brønnene i analysen. Til slutt eksporterer du dataene til Excel.Del lumenområdet etter det totale overflatearealet og gjennomsnittlig alle organoidene fra prøven for å få Baseline Lumen Ratio. Bildene med lyse felt representerer HNEer fra en vellykket og mislykket utvalgssamling. HNEene vokser godt i en stor klynge.Derimot vokser HNEene dårlig i to små klynger rundt de bestrålede 3T3-cellene. Organoider i 15-brønns lysbildet har mer presise og skarpere bilder enn de i kulturinnlegget. Foruten dette ble det ikke observert noen signifikant morfologisk forskjell i disse to kulturmetodene.Ikke-CF organoider har vanligvis en større lumen og mer væske enn CF organoider. HNE-farging i organoider fra et ikke-CF-, F508del/F508del-emne, og immunfluorescerende farging av cilia i en organoid er vist på disse bildene. Cilia farget med acetylert-tubulin, FITC merket sekundært antistoff, og kjernene merket med DAPI er vist her.Maksimale projeksjonsbilder av de to representative organoidene ved helmontert immunfluorescerende farging og deres tilsvarende tredimensjonale rekonstruksjonsbilder vises her. Slim og cilia i lumen av organoidene er vist. De grafiske bildene representerer den forskolininduserte hevelsesanalysen for å teste CFTR-funksjonen på de primære neseepitelcellene.Et representativt forskolin dose-respons eksperiment av ikke-CF frivillige vises her. FSK dose-respons sammenlignes med gjennomsnittlig brøkdelsendring på en time, versus på åtte timer, noe som tyder på at åtte timers analyse kan gi en mer signifikant hevelsesforskjell mellom forskjellige FSK-doser enn de på en time. Området under kurven kan vise en liten forskjell i hevelse sammenlignet med gjennomsnittlig brøkdelsendring på åtte timer.Mens du prøver denne prosedyren, husk at organoider vil gå tapt under innsamling, fiksering og fargingsprosess. Så omhyggelig forsiktighet må tas under hvert trinn, og tilstrekkelige startnumre må oppnås for å sikre suksess. Voksende organoider i kulturinnlegg kan hjelpe i denne forbindelse, da disse teknikkene utvikles.Her har vi brukt kommersielt tilgjengelige reagenser og forsyninger for å lette ekspansjonen til andre etterforskere. En funksjonell analyse ble også utviklet som brukte vanlige mikroskopteknikker og mer spesialisert utstyr.

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

Isolasjon, Kultur, og Imaging of Human Fetal Bukspyttkjertelen Cell Clusters

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

Primary Culture of Human Vestibular Schwannomas

Primær Culture of Human Vestibulær schwannomas

Vestibular schwannomas (VSs) represent Schwann cell (SC) tumors of the vestibular nerve, compromising 10% of all intracranial neoplasms. VSs occur in ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Isolasjon, Kryopreservering og kultur menneskerettighets amnion Epitelceller for kliniske anvendelser

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Establishment of Human Epithelial Enteroids and Colonoids from Whole Tissue and Biopsy

Etablering av Menneskelig Epithelial Enteroids og Colonoids fra Whole Tissue og Biopsi

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem ...

Absorption of Nasal and Bronchial Fluids: Precision Sampling of the Human Respiratory Mucosa and Laboratory Processing of Samples

Absorpsjon av nese og bronkial væsker: Precision prøvetaking av menneskelig luftveiene Mucosa og laboratoriet behandling av prøver

The methods of nasal absorption (NA) and bronchial absorption (BA) use synthetic absorptive matrices (SAM) to absorb the mucosal lining fluid (MLF) of the ...

Standardized Measurement of Nasal Membrane Transepithelial Potential Difference (NPD)

Standardized Measurement of Nasal Membrane Transepithelial Potential Difference NPD

Standardisert måling av nese membran Transepithelial potensielle forskjellen (OD)

We describe a standardized measurement of nasal potential difference (NPD). In this technique, cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) ...

Generation of Human Nasal Epithelial Cell Spheroids for Individualized Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Study

Generering av menneskelig nese tarmepitelet Spheroids for individualisert cystisk fibrose Transmembrane konduktans Regulator studie

While the introduction of Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) modulator drugs has revolutionized care in Cystic Fibrosis (CF), the ...

Muscle Imbalances: Testing and Training Functional Eccentric Hamstring Strength in Athletic Populations

Muskelen ubalansene: Testing og opplæring funksjonelle eksentriske Hamstring styrke atletisk bestander

Many hamstring injuries that occur during physical activity occur while the muscles are lengthening, during eccentric hamstring muscle actions. Opposite ...

Quantitative Mapping of Specific Ventilation in the Human Lung using Proton Magnetic Resonance Imaging and Oxygen as a Contrast Agent

Kvantitativ kartlegging av spesifikk ventilasjon i Human Lung bruker Proton magnetisk resonans imaging og oksygen som kontrast agent

Specific ventilation imaging (SVI) is a functional magnetic resonance imaging technique capable of quantifying specific ventilation &#8213; the ratio of ...