Name: culture and imaging of human nasal epithelial organoids
Uploaded: 2021-12-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culture and Imaging of Human Nasal Epithelial Organoids at JoVE.com

Agradecemos as contribuições de todos os participantes que doaram biópsias de escovas de HNE para desenvolver este protocolo. Agradecemos à latona Kersh e à equipe da Unidade de Pesquisa Infantil por coordenar o recrutamento voluntário de estudos e coleções de amostras. Agradecemos a Lily Deng, Johnathan Bailey e Stephen Mackay, ex-estagiários do laboratório, por assistência técnica. Agradecemos a Zhong Liu e Rui Zhao por sua ajuda técnica. Steven M. Rowe, diretor do Centro de Pesquisa cf da UAB, fornece liderança e recursos, sem os quais este trabalho não seria possível. Também gostaríamos de agradecer a Sarah Guadiana da Biotek pela assistência com o treinamento de instrumentos, Robert Grabski pela assistência de microscopia confocal no Centro de Imagem de Alta Resolução da UAB, e Dezhi Wang por assistência histológica no Núcleo de Histologia da UAB. Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (NIH.) Grant K23HL143167 (para JSG), Cystic Fibrosis Foundation (CFF) Grant GUIMBE18A0-Q (para JSG), Gregory Fleming James Cystic Fibrosis Center [NIH Grants R35HL135816 e DK072482 e o CFF University of Alabama at Birmingham (UAB) Research and Development Program (Rowe19RO)], e o UAB Center for Clinical and Translational Science (NIH Grant UL1TR001417).

Amostras de HNE foram coletadas no hospital Infantil do Alabama. Todos os procedimentos e métodos descritos aqui foram aprovados pela Universidade IRB do Alabama em Birmingham (UAB IRB #151030001). Para facilitar a expansão e melhorar a função das células epiteliais nasais humanas (HNEs), os métodos atuais de cultivo são adaptados do conhecido método de cultura de interface ar-líquido (ALI) 28,34. As HNEs foram inicialmente coletadas por biópsia de esco...

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	<li>Brewington, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brushed+nasal+epithelial+cells+are+a+surrogate+for+bronchial+epithelial+CFTR+studies.">Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies.</a> JCI Insight. 3 (13), (2018).</li><li>Brewington, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+nasal+epithelial+cell+spheroids+for+individualized+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+study.">Generation of human nasal epithelial cell spheroids for individualized cystic fibrosis transmembrane conductance regulator study.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57492 (2018).</li><li>Brewington, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+CFTR+function+and+modulation+in+primary+human+nasal+cell+spheroids.">Detection of CFTR function and modulation in primary human nasal cell spheroids.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 17 (1), 26-33 (2017).</li><li>Bridges, M. A., Walker, D. C., Davidson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+and+control+nasal+epithelial+cells+harvested+by+a+brushing+procedure.">Cystic fibrosis and control nasal epithelial cells harvested by a brushing procedure.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. 27 (9), 684-686 (1991).</li><li>Bridges, M. A., Walker, D. C., Harris, R. A., Wilson, B. R., Davidson, A. 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In vivo imaging of airway cilia and mucus clearance with micro-optical coherence tomography.</a> Biomedical Optics Express. 7 (7), 2494-2505 (2016).</li><li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+quantitative+study+of+airway+functional+microanatomy+using+micro-optical+coherence+tomography.">Method for quantitative study of airway functional microanatomy using micro-optical coherence tomography.</a> PLoS One. 8 (1), 54473 (2013).</li><li>Tuggle, K. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+and+in+vitro+ivacaftor+response+in+cystic+fibrosis+patients+with+residual+CFTR+function:+N-of-1+studies.">In vivo and in vitro ivacaftor response in cystic fibrosis patients with residual CFTR function: N-of-1 studies.</a> Pediatric Pulmonology. 52 (4), 472-479 (2017).</li><li>Garratt, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+culture+success+in+an+airway+epithelium+sampling+program+of+young+children+with+cystic+fibrosis.">Determinants of culture success in an airway epithelium sampling program of young children with cystic fibrosis.</a> Experimental Lung Research. 40 (9), 447-459 (2014).</li></ol>

Este manuscrito fornece metodologias detalhadas para imagens abrangentes ao vivo e fixas dos organoides epiteliais das vias aéreas derivados da biópsia da escova HNE. Descreve ensaios funcionais que podem determinar a atividade do CFTR em um indivíduo. Os HNEs fornecem um tecido primário minimamente invasivo para uma variedade de aplicações. As técnicas de expansão aqui oferecidas podem ser utilizadas para modelar doenças das vias aéreas, incluindo organoides. Organoides podem ser usados para abordagens terapê...

Introdução à técnica Os ensaios ex-vivos baseados na cultura são uma ferramenta cada vez mais utilizada para a medicina de precisão e o estudo da fisiopatologia da doença. A cultura celular epitelial humana primária (HNE) tem sido utilizada em inúmeros estudos de fibrose cística 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 , uma doença recessiva autossômica que afeta a função celular epitelial em múltiplos órgãos. A cultura HNE fornece uma fonte renovável de epitélia das vias aéreas que pode ser obtida prospectivamente e recapitula qualidades eletrofísicas e bioquímicas para testar a atividade do Regulador de Condutância Transmembrana de Fibrose Cística (CFTR). As células HNE podem ser amostradas com efeitos colaterais mínimos14, semelhantes aos cotonetes respiratórios virais comuns. Um trabalho de pesquisa descrevendo um modelo para estudo de fibrose cística derivado de biópsias de escova de HNE foi publicado recentemente11,13. Enquanto semelhante a outros modelos que utilizam hneprimário 2,3 e tecido intestinal 15,16,17,18,19, caracterização detalhada da diferenciação e imagem deste modelo são descritos aqui para uso em pesquisa cf e para auxiliar nos estudos de outras doenças das vias aéreas13 . O modelo organoide não é ilimitado como linhas celulares imortalizadas, mas pode ser expandido por reprogramação condicional (usando fibroblastos alimentadores irradiados e inativados e inibidores de Rho-kinase) para um estado mais parecido com células-tronco 20,21,22,23. O processamento de biópsias de escova de HNE usando este método produz um grande número de células epiteliais para uso em múltiplas aplicações a maior rendimento, mantendo ainda a capacidade de diferenciar totalmente. Embora este protocolo tenha sido desenvolvido usando células alimentadoras, outras metodologias podem ser usadas por pesquisadores que desejam evitar a tecnologia de célulasalimentadoras 14,24.
Importância da técnica para a biologia pulmonar Um estudo significativo tem sido dedicado a entender como a ausência de CFTR regular e funcional na membrana celular das células epiteliais resulta em disfunção nos pulmões, pâncreas, fígado, intestino ou outros tecidos. O transporte de íons epiteliais disfuncionais, particularmente o de cloreto e bicarbonato, resulta em um volume reduzido dos fluidos de revestimento epitelial e mudanças nas secreções mucosas, levando à estase mucosa e obstrução. Em outras doenças das vias aéreas, como a diskinesia ciliar primária, o movimento ciliar alterado prejudica o desembaraço mucociliar e leva à mucosa estase e obstrução25. Portanto, o atual modelo organoide do HNE foi desenvolvido para várias aplicações, dependendo do projeto experimental e recursos do pesquisador. Isso inclui imagens de células vivas usando manchas de células vivas; fixação e secção para caracterizar a morfologia; coloração de imunofluorescência com anticorpos e imagens confocal de montagem inteira para evitar a interrupção das estruturas intraluminais; e imagem de campo brilhante e tomografia de coerência micro-óptica para medições quantitativas de frequência de batida ciliar e transporte mucociliary13. Para facilitar a expansão para outros investigadores, foram utilizados reagentes e suprimentos disponíveis comercialmente para cultivo. Foi desenvolvido um ensaio funcional que utilizou técnicas comuns de microscópio e equipamentos mais especializados. No geral, enquanto o modelo atual foi projetado para avaliar a atividade do CFTR na linha de base ou em resposta à terapêutica, as técnicas descritas neste protocolo podem ser aplicadas a outras doenças que envolvam função celular epitelial, especialmente o transporte de fluidos celulares epiteliais.
Comparação com outras metodologias Recentemente, a utilidade deste modelo organoide foi desenvolvida correlacionando respostas moduladoras in vitro CFTR dos organoides dos pacientes com sua resposta clínica11. Notavelmente, também é demonstrado que o modelo atual paralelamente às respostas de corrente de curto-circuito, o padrão-ouro atual para avaliar a função CFTR, nos mesmos pacientes. A corrente de curto-circuito difere do ensaio de inchaço porque o primeiro mede a função CFTR via transporte deíons 26. Em contrapartida, este ensaio mede um efeito mais a jusante com o transporte de fluidos, fornecendo informações adicionais sobre a função global da CFTR 27,28,29,30,31,32. As medições de corrente de curto-circuito continuaram a ser um método comum e confiável para determinar a atividadedo canal de cloreto de CFTR 1,33. Esses ensaios eletrofisiológicos exigem equipamentos especializados e caros, requerem muitas vezes mais células para cada replicação experimental do que o ensaio organoide, não podem ser facilmente automatizados, e não são capazes de escalar para aplicações de maior rendimento. Outro modelo organoide derivado da epitélia intestinal tem vantagens adicionais 15,16,17,18, como uma excelente capacidade replicativa, mas não é derivado de um tecido das vias aéreas nem está universalmente disponível. As escovações de HNE são obtidas com escovas de citologia baratas sem a necessidade de sedação e com risco mínimo. A escovação não requer um médico e pode ser realizada por coordenadores de pesquisa treinados e outras equipesde pesquisa 14. O modelo organoide do HNE pode ser cultivado por qualquer laboratório com capacidades primárias de cultura celular, e algumas das aplicações podem ser realizadas com técnicas padrão de microscopia. Ao todo, essas vantagens fornecem acesso adicional à tecnologia para avaliação da função epitelial das vias aéreas que, de outra forma, poderiam estar indisponíveis para alguns laboratórios. Além disso, os organoides de HNE podem ser utilizados para estudar outros estados da doença que afetam as vias aéreas, como a diskinesia ciliar primária25 ou infecção viral, que os organoides intestinais não podem.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Nasal brush</td>
			<td>Medical Packaging CYB1</td>
			<td>CYB-1</td>
			<td>Length: 8 inches, width approximately 7 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large-Orifice Pipette Tips</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>02-707-141</td>
			<td>Large bore pipette tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>Cell detachment solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% trypsin -EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor from soybean</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6522</td>
			<td>Working solution: 1mg/mL in 1XDPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356255</td>
			<td>Extracellular matrix (EM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide Angiogenesis</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81506</td>
			<td>15-well slide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-Well Transwell</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7200154</td>
			<td>Culture insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chambered Coverglass</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>155409</td>
			<td>8-well glass-bottom chamber slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>354240</td>
			<td>Cell adhesive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>50980487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A16046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucBlue</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>R37605</td>
			<td>DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ts2-FL (Inverted Routine Microscope)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Inverted epi-fluorescence microscope or bright-field microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R-HD25</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements- Basic Research</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>manual imaging analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histogel</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Base Molds</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>41-740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lionheart FX</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BTLFX</td>
			<td>Automated image system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lionheart Cover</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1450009</td>
			<td>Environmental Control Lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity Chamber</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1450006</td>
			<td>Stage insert (environmental chamber)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Controller for CO2 and O2</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1210013</td>
			<td>Gas controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate/Slide Stage Insert</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1450527</td>
			<td>Slide holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5 Imaging Prime Software</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BTGEN5IPRIM</td>
			<td>Automated imaging analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x Phase Contrast Objective</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1320515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Phase Contrast Objective</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1320516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED Cube</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1225007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Cube (DAPI)</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1225100</td>
			<td>DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFTRinh-172</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S7139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBMX</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expansion Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12 Nutrient mix</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;16140-071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;15-140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;C8052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;PHG0314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone (HC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;H0888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;A2786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>&#160;04-0012-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceftazidime</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>&#160;J66460-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tobramycin</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>&#160;J67340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vancomycin</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>&#160;J67251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Differentiation Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 (1:1)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;11330-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultroser-G</td>
			<td>Pall</td>
			<td>&#160;15950-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Clone II</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>&#160;SH30066.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Brain Extract</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>&#160;CC-4098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;I-9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;H-0888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triiodothyronine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;T-6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;T-0665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanolamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;E-0135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epinephrine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-4250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-Phosphorylethanolamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R-2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human CFTR antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB1660</td>
			<td>Dilution: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZO-1 antibody</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>MA3-39100-A647</td>
			<td>Dilution: 1000x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MUC5B antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HPA008246</td>
			<td>Dilution: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-acetylated tubulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7451</td>
			<td>Dilution: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-beta IV Tubulin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab11315</td>
			<td>Dilution: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21202</td>
			<td>Dilution: 2000x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21207</td>
			<td>Dilution: 2000x</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture and imaging of human nasal epithelial organoids

A terapia individualizada para pacientes com fibrose cística (CF) pode ser alcançada com um modelo de doença in vitro para entender a atividade e restauração do Regulador de Condutância de Fibrose Cística De base (CFTR) atividade e restauração de compostos de pequenas moléculas. Nosso grupo recentemente se concentrou em estabelecer um modelo organoide bem diferenciado diretamente derivado das células epiteliais nasais primárias (HNE). A histologia de organoides seccionados, coloração imunofluorescente de montagem total e imagem (utilizando microscopia confocal, microscopia imunofluorescente e campo brilhante) são essenciais para caracterizar organoides e confirmar a diferenciação epitelial na preparação para ensaios funcionais. Além disso, os organoides HNE produzem lúmens de tamanhos variados que se correlacionam com a atividade do CFTR, distinguindo entre organoides CF e não-CF. Neste manuscrito, a metodologia para a cultura de organoides de HNE é descrita em detalhes, com foco na avaliação da diferenciação utilizando as modalidades de imagem, incluindo a medição da área de lúmen de linha de base (método de medição da atividade cftr em organoides que qualquer laboratório com microscópio pode empregar) bem como a abordagem automatizada desenvolvida para um ensaio funcional (que requer equipamentos mais especializados).

A expansão dos HNEs é essencial para uma cultura organoide próspera. Os HNEs de uma coleção de amostras bem sucedida devem expandir-se para mais de 70% de confluência em torno de 10 dias. Um exemplo de amostras bem sucedidas e mal sucedidas é mostrado na Figura 1A e Figura 1B, respectivamente. As células devem ser descartadas se não puderem atingir 70% de confluência até 14 dias após a cocultura com células 3T3 irradiadas. Quaisquer...

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Culture and Imaging of Human Nasal Epithelial Organoids

Um protocolo detalhado é apresentado aqui para descrever um modelo organoide in vitro de células epiteliais nasais humanas. O protocolo tem opções de medições que requerem equipamentos de laboratório padrão, com possibilidades adicionais de equipamentos e softwares especializados.

Cultura e Imagem de Organoides Epiteliais Nasais Humanos

Individualized therapy for cystic fibrosis (CF) patients can be achieved with an in vitro disease model to understand baseline Cystic Fibrosis ...

A terapia individualizada para pacientes com fibrose cística pode ser alcançada por um modelo de doença in vitro para entender a atividade de CFTR na linha de base. Organoides epiteliais nasais humanos, ou organoides HNE, produzem lúmens de tamanhos variados que se correlacionam com a atividade cftr, distinguindo entre organoides CF e não-CF. Aqui, descrevemos em detalhes uma metodologia para acultura e imagem desses organoides do HNE.O transporte de íons epiteliais disfuncionais, particularmente o de cloreto e bicarbonato, resulta em um volume reduzido dos fluidos de revestimento epitelial. Isso também afeta as secreções de muco que levam à mucostase e obstrução. Portanto, nosso modelo HNE foi desenvolvido para várias aplicações, dependendo do projeto experimental e recursos do pesquisador.Além de avaliar a atividade da CFTR na linha de base ou em resposta à terapêutica, essa técnica também pode ser aplicada a outras doenças que envolvam função celular epitelial, especialmente o transporte de fluidos celulares epiteliais. Esses métodos foram desenvolvidos principalmente para uso em estudos de fibrose cística. Outros estudos que avaliam a epitélio das vias aéreas, como a diskinesia ciliar primária, também podem achar esses métodos úteis.Essas técnicas requerem atenção aos detalhes e precisão. Eles também requerem uma observação cuidadosa para garantir que a expansão inicial das células seja apropriada. Monitore todas as culturas todos os dias, e o sucesso será mais provável.Para começar, dissociar a biópsia da escova nasal em 8 militers de mídia RPMI em um tubo cônico de 15 mililitros passando a escova de citologia várias vezes através de uma ponta de pipeta de um mililitro grande. Centrifugar as células a 500 vezes g por cinco minutos a quatro graus Celsius. Descarte o supernatante e suspenda novamente a pelota celular em três mililitros da solução de descolamento celular.Incubar em temperatura ambiente por 16 minutos para digerir. Use cinco mililitros da mídia de expansão para lavar as células duas vezes. Em seguida, adicione-os a um frasco T75, pré-semeado com fibroblastos irradiados, inativados e 50 a 60% confluentes 3T3.Permitir que as células co-cultura e expandir na mídia de expansão por 7 a 14 dias. Se antibióticos foram introduzidos para células derivadas de pacientes com fibrose cística, a mídia deve ser substituída por mídia de expansão livre de antibióticos após os três dias iniciais de cultura, e pode continuar mudando a mídia a cada dois dias até 80% confluente. Lave as células com 1x DPBS.Em seguida, adicione 1,5 mililitros de 0,05% trypsin-EDTA no frasco T75 e incubar por quatro minutos a 37 graus Celsius para remover o fibroblasto 3T3 irradiado e inativado da cultura. Enxágüe o frasco T75 com 1x DPBS duas vezes para lavar completamente todos os fibroblastos 3T3 restantes. Adicione 1,5 mililitros de 0,05% trypsin-EDTA no frasco T75 e incubar por 10 minutos a 37 graus Celsius para desacopar HNEs.Neutralizar a trippsina com inibidor de trippsina de soja em uma proporção de um para um. Centrifugar as células a 500 vezes gi por cinco minutos. Em seguida, descarte o supernatante e lave as células com cinco mililitros de mídia de expansão uma vez.As células estão prontas para semeadura para cultivar organoides. Descongele a cultura organoide matriz extracelular ou ECM durante a noite a quatro graus Celsius. Esfrie os slides de angiogênese de 15 poços durante a noite na mesma temperatura.Em seguida, esfrie as pontas da pipeta a quatro graus Celsius. Cubra os slides com cinco microliters de frio 100% ECM no gelo. Coloque-os em uma incubadora de cultura celular a 37 graus Celsius por pelo menos 30 minutos para consolidação.Conte os HNEs colhidos da cocultura usando um hemótmetro. Em seguida, diluir as células para 500 células por microlitres no número total, com 20% de ECM diluído por meios de diferenciação no gelo. Leve os slides revestidos de ECM para fora da incubadora e sementes cinco microliters da mistura ECM de célula fria em cada um dos poços.Transfira os slides imediatamente para uma incubadora de cultura a 37 graus Celsius por uma hora para consolidar a mistura de ECM celular. Depois disso, tire os slides da incubadora e alimente as células em cada poço dos slides de angiogênese de 15 poços com 50 microliters da mídia de diferenciação. Devolva o slide para a incubadora de cultura a 37 graus Celsius, mudando a mídia a cada dois dias até que os organoides estejam prontos para novas experiências.Pré-trate os slides de câmara de 8 poços com adesivo de célula por 30 minutos. Descarte a solução e seque os poços por mais 30 minutos. Em seguida, descarte a mídia do topo do ECM e, em seguida, adicione 50 microliters do PBS 1x frio em cada poço dos slides de 15 poços no gelo.Pipeta para cima e para baixo três a cinco vezes usando 200 microliters da ponta de pipeta de grande furo. Distribua a solução no centro de um poço dos slides de câmara de 8 poços. Remova o excesso de líquido imediatamente dos poços por uma pipeta de ponta fina.Em seguida, coloque a câmara deslizando em uma incubadora Celsius de 37 graus por 40 minutos para melhorar o organoide aderindo ao fundo do vidro. Após 40 minutos, lave suavemente os organoides com 1x PBS duas vezes e fixe-os com 300 microlitres de 4% de paraformaldeído em cada poço por 30 minutos definir a temperatura ambiente. Lave duas vezes com 1x PBS e armazene os organoides em 1x PBS definir quatro graus Celsius para imunostaining por até duas semanas.Para colher os organoides para estudos histológicos, remova a mídia da cultura e adicione 50 microliters de frio de um 1x PBS em cada poço dos slides no gelo. Pipeta para cima e para baixo três a cinco vezes usando uma ponta de pipeta de 200 microliter de furo grande. Combine todas as soluções do slide de 15 poços ou inserções de cultura em um tubo cônico de 15 mililitros no gelo.Ajuste o volume total da solução no tubo para 10 mililitros adicionando PBS frio de 1x. Centrifugar o tubo a quatro graus Celsius, 300 vezes g por cinco minutos. Em seguida, aspire o supernascer e adicione 60 microliters de histogel quente para misturar com a pelota organoide usando uma ponta de pipeta de 200 microliteres de grande furo.Transfira a suspensão imediatamente para um molde de histologia. Depois de consolidar o histogel à temperatura ambiente, coloque o bloco de molde em 4% de paraformaldeído para fixação durante a noite a quatro graus Celsius. Abra o software e clique com o botão direito do mouse na parte inferior da tela.Em seguida, selecione Controles de Análise, seguido por Resultados de Medição Automatizados. Abra a imagem organoide e selecione 5 a 10 organoides com lúmens visíveis. Mantenha o clique direito na imagem para abrir o menu e selecione ROI Poligonal para delinear o organoide completo para obter a área total da superfície do organoide.Em seguida, delineie o lúmen para obter a área do lúmen. Repita isso para os organoides restantes no poço, e todos os poços do ensaio. Por fim, exporte os dados para o Excel.Divida a área de lúmen pela área total da superfície e, em média, todos os organoides da amostra para obter a Razão de Lumen de Linha de Base. As imagens de campo brilhante representam HNEs de uma coleção de amostras bem sucedidas e mal sucedidas. Os HNEs crescem bem em um grande aglomerado.Em contraste, os HNEs crescem mal em dois pequenos aglomerados ao redor das células 3T3 irradiadas. Organoides no slide de 15 poços têm imagens mais precisas e nítidas do que as da inserção cultural. Além disso, não foi observada diferença morfológica significativa nesses dois métodos culturais.Organoides não CF normalmente têm um lúmen maior e mais fluido do que os organoides CF. As manchas de HNE em organoides de um sujeito não CF, F508del/F508del, e a coloração imunofluorescente de cílios em um organoide são mostradas nestas imagens. Os cílios manchados com acetilada-tubulina, anticorpo secundário fitc rotulado e os núcleos rotulados com DAPI são mostrados aqui.Imagens máximas de projeção dos dois organoides representativos por coloração imunofluorescente de montagem total e suas imagens de reconstrução tridimensionais correspondentes são mostradas aqui. Muco e cílios dentro do lúmen dos organoides são mostrados. As imagens gráficas representam o ensaio de inchaço induzido por forskolina para testar a função CFTR nas células epiteliais primárias.Um experimento representativo de dose-resposta de forskolin de voluntários não CF é mostrado aqui. A dose-resposta fsk é comparada com a variação fracionária média em uma hora, em comparação com oito horas, o que sugere que o ensaio de oito horas pode produzir uma diferença de inchaço mais significativa entre diferentes doses de FSK do que aquelas em uma hora. A área sob a curva pode apresentar uma pequena diferença no inchaço em comparação com a variação fracionária média em oito horas.Ao tentar este procedimento, tenha em mente que os organoides serão perdidos durante o processo de coleta, fixação e coloração. Assim, deve-se tomar cuidado meticuloso durante cada etapa e números iniciais suficientes devem ser obtidos para garantir o sucesso. O crescimento de organoides nas pastilhas culturais pode ajudar nesse sentido, pois essas técnicas são desenvolvidas.Aqui, usamos reagentes e suprimentos disponíveis comercialmente para facilitar a expansão para outros investigadores. Também foi desenvolvido um ensaio funcional que utilizava técnicas comuns de microscópio e equipamentos mais especializados.

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