Name: culture and imaging of human nasal epithelial organoids
Uploaded: 2021-12-17T14:00:00
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Agradecemos las contribuciones de todos los participantes que donaron biopsias con cepillo HNE para desarrollar este protocolo. Agradecemos a Latona Kersh y al personal de la Unidad de Investigación Infantil por coordinar el reclutamiento de voluntarios del estudio y la recolección de muestras. Agradecemos a Lily Deng, Johnathan Bailey y Stephen Mackay, ex aprendices en nuestro laboratorio, por su asistencia técnica. Agradecemos a Zhong Liu y Rui Zhao por su ayuda técnica. Steven M. Rowe, director del Centro de Investigación de CF de la UAB, aporta liderazgo y recursos, sin los cuales este trabajo no sería posible. También nos gustaría agradecer a Sarah Guadiana de Biotek por su ayuda con la formación de instrumentos, a Robert Grabski por la asistencia en microscopía confocal en el Centro de Imágenes de Alta Resolución de la UAB y a Dezhi Wang por la asistencia histológica en el Núcleo de Histología de la UAB. Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (NIH). Subvención K23HL143167 (a JSG), Subvención de la Fundación de Fibrosis Quística (CFF) GUIMBE18A0-Q (a JSG), el Centro de Fibrosis Quística Gregory Fleming James [NIH Grants R35HL135816 y DK072482 y el Programa de Investigación y Desarrollo de la Universidad CFF de Alabama en Birmingham (UAB) (Rowe19RO)], y el Centro de Ciencias Clínicas y Traslacionales de la UAB (NIH Grant UL1TR001417).

Las muestras de HNE se recolectaron en el hospital Children's of Alabama. Todos los procedimientos y métodos descritos aquí han sido aprobados por la Universidad IRB de Alabama en Birmingham (UAB IRB #151030001). Para facilitar la expansión y mejorar la función de las células epiteliales nasales humanas (HNE), los métodos de cultivo actuales se adaptan del conocido método de cultivo de interfaz aire-líquido (ALI)28,34. Los HNE se recogieron inicialmente m...

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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+CFTR+function+and+modulation+in+primary+human+nasal+cell+spheroids.">Detection of CFTR function and modulation in primary human nasal cell spheroids.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 17 (1), 26-33 (2017).</li><li>Bridges, M. A., Walker, D. C., Davidson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+and+control+nasal+epithelial+cells+harvested+by+a+brushing+procedure.">Cystic fibrosis and control nasal epithelial cells harvested by a brushing procedure.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. 27 (9), 684-686 (1991).</li><li>Bridges, M. A., Walker, D. C., Harris, R. A., Wilson, B. R., Davidson, A. 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Este manuscrito proporciona metodologías detalladas para imágenes completas en vivo y fijas de los organoides epiteliales de las vías respiratorias derivados de la biopsia con cepillo HNE. Describe ensayos funcionales que pueden determinar la actividad de CFTR en un individuo. Los HNE proporcionan un tejido primario mínimamente invasivo para una variedad de aplicaciones. Las técnicas de expansión ofrecidas aquí se pueden utilizar para modelar la enfermedad de las vías respiratorias, incluidos los organoides. Los ...

Introducción a la técnica Los ensayos basados en cultivos ex vivo son una herramienta cada vez más utilizada para la medicina de precisión y el estudio de la fisiopatología de enfermedades. El cultivo primario de células epiteliales nasales humanas (HNE) se ha utilizado en numerosos estudios de fibrosis quística 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 , una enfermedad autosómica recesiva que afecta la función de las células epiteliales en múltiples órganos. El cultivo de HNE proporciona una fuente renovable de epitelios de las vías respiratorias que se pueden obtener prospectivamente y recapitula las cualidades electrofisiológicas y bioquímicas para probar la actividad del regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR). Las células HNE se pueden muestrear con efectos secundarios mínimos14, similar a los hisopos respiratorios virales comunes. Recientemente se ha publicado un trabajo de investigación que describe un modelo para el estudio de la fibrosis quística derivado de biopsias con cepillo HNE11,13. Si bien es similar a otros modelos que utilizan HNEprimaria 2,3 y tejido intestinal 15,16,17,18,19, la caracterización detallada de la diferenciación y la obtención de imágenes de este modelo se describen aquí para su uso en la investigación de la FQ y para ayudar en los estudios de otras enfermedades de las vías respiratorias 13 . El modelo organoide no es ilimitado como las líneas celulares inmortalizadas, sino que puede ampliarse mediante reprogramación condicional (utilizando fibroblastos alimentadores irradiados e inactivados e inhibidores de la Rho-quinasa) a un estado más similar al de las células madre 20,21,22,23. El procesamiento de biopsias con cepillo HNE utilizando este método produce un gran número de células epiteliales para su uso en múltiples aplicaciones con un mayor rendimiento, al tiempo que conserva la capacidad de diferenciarse completamente. Si bien este protocolo se desarrolló utilizando células alimentadoras, otros investigadores que deseen evitar la tecnología de células alimentadoraspueden utilizar otras metodologías 14,24.
Importancia de la técnica para la biología pulmonar Se ha dedicado un estudio significativo a comprender cómo la ausencia de CFTR regular y funcional en la membrana celular de las células epiteliales resulta en una disfunción en los pulmones, el páncreas, el hígado, el intestino u otros tejidos. El transporte disfuncional de iones epiteliales, particularmente el de cloruro y bicarbonato, da como resultado una disminución del volumen de los fluidos del revestimiento epitelial y cambios en las secreciones mucosas, lo que lleva a la estasis mucosa y la obstrucción. En otras enfermedades de las vías respiratorias, como la discinesia ciliar primaria, el movimiento ciliar alterado afecta el aclaramiento mucociliar y conduce a estasis mucosa y obstrucción25. Por lo tanto, el modelo organoide HNE actual se ha desarrollado para diversas aplicaciones, dependiendo del diseño experimental y los recursos del investigador. Esto incluye imágenes de células vivas utilizando tinciones de células vivas; fijación y seccionamiento para caracterizar la morfología; tinción de inmunofluorescencia con anticuerpos e imágenes confocales de montaje completo para evitar la interrupción de las estructuras intraluminales; y imágenes de campo brillante y tomografía de coherencia microóptica para mediciones cuantitativas de la frecuencia de latido ciliar y el transporte mucociliar13. Para facilitar la expansión a otros investigadores, se utilizaron reactivos y suministros disponibles comercialmente para el cultivo. Se desarrolló un ensayo funcional que utilizó técnicas comunes de microscopio y equipos más especializados. En general, si bien el presente modelo fue diseñado para evaluar la actividad de CFTR al inicio o en respuesta a la terapéutica, las técnicas descritas en este protocolo se pueden aplicar a otras enfermedades que involucran la función de las células epiteliales, especialmente el transporte de líquido celular epitelial.
Comparación con otras metodologías Recientemente se desarrolló la utilidad de este modelo organoide correlacionando in vitro las respuestas moduladoras CFTR de los organoides de los pacientes con su respuesta clínica11. En particular, también se demuestra que el modelo actual era paralelo a las respuestas de corriente de cortocircuito, el estándar de oro actual para evaluar la función CFTR, en los mismos pacientes. La corriente de cortocircuito difiere del ensayo de hinchazón porque el primero mide la función CFTR a través del transporte iónico26. En contraste, este ensayo mide un efecto más aguas abajo con el transporte de fluidos, proporcionando información adicional sobre la función general de CFTR 27,28,29,30,31,32. Las mediciones de corriente de cortocircuito han seguido siendo un método común y fiable para determinar la actividad del canal de cloruro CFTR 1,33. Estos ensayos electrofisiológicos requieren equipos especializados y costosos, requieren muchas veces más células para cada réplica experimental que el ensayo organoide, no se pueden automatizar fácilmente y no son susceptibles de escalar para aplicaciones de mayor rendimiento. Otro modelo organoide derivado de epitelios intestinales tiene ventajas adicionales 15,16,17,18, como una capacidad replicativa más excelente, pero no se deriva de un tejido de las vías respiratorias ni está disponible universalmente. Los cepillados HNE se obtienen con cepillos de citología de bajo costo sin necesidad de sedación y con un riesgo mínimo. Obtener el cepillado no requiere un médico y puede ser realizado por coordinadores de investigación capacitados y otro personal de investigación14. El modelo organoide HNE puede ser cultivado por cualquier laboratorio con capacidades de cultivo celular primario, y algunas de las aplicaciones se pueden realizar con técnicas de microscopía estándar. En conjunto, estas ventajas proporcionan acceso adicional a la tecnología para evaluar la función epitelial de las vías respiratorias que de otro modo podría no estar disponible para algunos laboratorios. Además, los organoides HNE se pueden utilizar para estudiar otros estados de enfermedad que afectan a las vías respiratorias, como la discinesia ciliar primaria25 o la infección viral, que los organoides intestinales no pueden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Nasal brush</td>
			<td>Medical Packaging CYB1</td>
			<td>CYB-1</td>
			<td>Length: 8 inches, width approximately 7 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large-Orifice Pipette Tips</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>02-707-141</td>
			<td>Large bore pipette tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>Cell detachment solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% trypsin -EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor from soybean</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6522</td>
			<td>Working solution: 1mg/mL in 1XDPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356255</td>
			<td>Extracellular matrix (EM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide Angiogenesis</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81506</td>
			<td>15-well slide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-Well Transwell</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7200154</td>
			<td>Culture insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chambered Coverglass</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>155409</td>
			<td>8-well glass-bottom chamber slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>354240</td>
			<td>Cell adhesive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>50980487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A16046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucBlue</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>R37605</td>
			<td>DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ts2-FL (Inverted Routine Microscope)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Inverted epi-fluorescence microscope or bright-field microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R-HD25</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements- Basic Research</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>manual imaging analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histogel</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Base Molds</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>41-740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lionheart FX</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BTLFX</td>
			<td>Automated image system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lionheart Cover</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1450009</td>
			<td>Environmental Control Lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity Chamber</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1450006</td>
			<td>Stage insert (environmental chamber)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Controller for CO2 and O2</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1210013</td>
			<td>Gas controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate/Slide Stage Insert</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1450527</td>
			<td>Slide holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5 Imaging Prime Software</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BTGEN5IPRIM</td>
			<td>Automated imaging analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x Phase Contrast Objective</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1320515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Phase Contrast Objective</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1320516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED Cube</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1225007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Cube (DAPI)</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1225100</td>
			<td>DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFTRinh-172</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S7139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBMX</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expansion Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12 Nutrient mix</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;16140-071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;15-140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;C8052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;PHG0314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone (HC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;H0888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;A2786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>&#160;04-0012-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceftazidime</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>&#160;J66460-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tobramycin</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>&#160;J67340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vancomycin</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>&#160;J67251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Differentiation Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 (1:1)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;11330-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultroser-G</td>
			<td>Pall</td>
			<td>&#160;15950-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Clone II</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>&#160;SH30066.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Brain Extract</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>&#160;CC-4098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;I-9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;H-0888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triiodothyronine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;T-6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;T-0665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanolamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;E-0135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epinephrine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-4250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-Phosphorylethanolamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R-2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human CFTR antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB1660</td>
			<td>Dilution: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZO-1 antibody</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>MA3-39100-A647</td>
			<td>Dilution: 1000x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MUC5B antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HPA008246</td>
			<td>Dilution: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-acetylated tubulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7451</td>
			<td>Dilution: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-beta IV Tubulin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab11315</td>
			<td>Dilution: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21202</td>
			<td>Dilution: 2000x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21207</td>
			<td>Dilution: 2000x</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture and imaging of human nasal epithelial organoids

La terapia individualizada para pacientes con fibrosis quística (FQ) se puede lograr con un modelo de enfermedad in vitro para comprender la actividad basal del regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR) y la restauración a partir de compuestos de moléculas pequeñas. Nuestro grupo se centró recientemente en establecer un modelo organoide bien diferenciado derivado directamente de las células epiteliales nasales humanas primarias (HNE). La histología de organoides seccionados, la tinción inmunofluorescente de montaje completo y las imágenes (utilizando microscopía confocal, microscopía inmunofluorescente y campo brillante) son esenciales para caracterizar organoides y confirmar la diferenciación epitelial en preparación para ensayos funcionales. Además, los organoides HNE producen lúmenes de diferentes tamaños que se correlacionan con la actividad de CFTR, distinguiendo entre organoides CF y no CF. En este manuscrito, se describe en detalle la metodología para el cultivo de organoides HNE, centrándose en la evaluación de la diferenciación utilizando las modalidades de imagen, incluida la medición del área de lúmenes basales (un método de medición de la actividad CFTR en organoides que cualquier laboratorio con un microscopio puede emplear), así como el enfoque automatizado desarrollado para un ensayo funcional (que requiere equipos más especializados).

La expansión de los HNE es esencial para un cultivo de organoides próspero. Las HNE de una recolección de muestra exitosa deben expandirse a más del 70% de confluencia alrededor de 10 días. Un ejemplo de muestras exitosas y no exitosas se muestra en la Figura 1A y la Figura 1B, respectivamente. Las células deben descartarse si no pueden alcanzar el 70% de confluencia a los 14 días después del cocultivo con células 3T3 irradiadas. Cualqu...

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Culture and Imaging of Human Nasal Epithelial Organoids

Aquí se presenta un protocolo detallado para describir un modelo organoide in vitro de células epiteliales nasales humanas. El protocolo tiene opciones para mediciones que requieren equipos de laboratorio estándar, con posibilidades adicionales para equipos y software especializados.

Cultivo e imágenes de organoides epiteliales nasales humanos

Individualized therapy for cystic fibrosis (CF) patients can be achieved with an in vitro disease model to understand baseline Cystic Fibrosis ...

La terapia individualizada para pacientes con fibrosis quística se puede lograr mediante un modelo de enfermedad in vitro para comprender la actividad de CFTR al inicio del estudio. Los organoides epiteliales nasales humanos, o organoides HNE, producen lúmenes de diferentes tamaños que se correlacionan con la actividad CFTR, distinguiendo entre organoides CF y no CF. Aquí, hemos descrito una metodología para cultivar e imágenes de estos organoides HNE en detalle.El transporte disfuncional de iones epiteliales, particularmente el de cloruro y bicarbonato, resulta en una disminución del volumen de los fluidos de revestimiento epitelial. Esto también afecta las secreciones de moco que conducen a la mucostasis y la obstrucción. Por lo tanto, nuestro modelo HNE ha sido desarrollado para diversas aplicaciones, dependiendo del diseño experimental y los recursos del investigador.Además de evaluar la actividad de CFTR al inicio o en respuesta a la terapéutica, esta técnica también se puede aplicar a otras enfermedades que involucran la función de las células epiteliales, especialmente el transporte de líquido celular epitelial. Estos métodos se desarrollaron principalmente para su uso en estudios de fibrosis quística. Otros estudios que evalúan los epitelios de las vías respiratorias, como la discinesia ciliar primaria, también pueden encontrar útiles estos métodos.Estas técnicas requieren atención al detalle y precisión. También requieren una observación cuidadosa para garantizar que la expansión inicial de las células sea apropiada. Monitoree todas las culturas todos los días, y el éxito será más probable.Para comenzar, disocie la biopsia del cepillo nasal en 8 miligramos de medios RPMI en un tubo cónico de 15 mililitros pasando el cepillo de citología varias veces a través de una punta de pipeta de gran diámetro de un mililitro. Centrifugar las células a 500 veces g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Deseche el sobrenadante y luego vuelva a suspender el gránulo celular en tres mililitros de solución de desprendimiento celular.Incubar a temperatura ambiente durante 16 minutos para digerir. Use cinco mililitros del medio de expansión para lavar las células dos veces. Luego, agréguelos a un matraz T75, presiembrado con fibroblastos 3T3 irradiados, inactivados y de 50 a 60% confluentes.Permita que las células coculten y se expandan en el medio de expansión durante 7 a 14 días. Si se introdujeron antibióticos para las células derivadas de pacientes con fibrosis quística, los medios deben reemplazarse con medios de expansión libres de antibióticos después de los tres días iniciales de cultivo, y pueden continuar cambiando los medios cada dos días hasta que el 80% se confluyen. Lave las células con 1x DPBS.Luego, agregue 1.5 mililitros de tripsina-EDTA al 0.05% en el matraz T75 e incube durante cuatro minutos a 37 grados Celsius para eliminar el fibroblasto 3T3 irradiado e inactivado del cultivo. Enjuague el matraz T75 con 1x DPBS dos veces para lavar bien los fibroblastos 3T3 restantes. Agregue 1.5 mililitros de tripsina-EDTA al 0.05% en el matraz T75 e incube durante 10 minutos a 37 grados Celsius para separar los HNE.Neutralice la tripsina con el inhibidor de tripsina de soja en una proporción de uno a uno. Centrifugar las células a 500 veces gi durante cinco minutos. Luego, deseche el sobrenadante y lave las células con cinco mililitros de medios de expansión una vez.Las células ahora están listas para la siembra para cultivar organoides. Descongelar la matriz extracelular de cultivo de organoides o ECM durante la noche a cuatro grados centígrados. Enfríe los portaobjetos de angiogénesis de 15 pocillos durante la noche a la misma temperatura.A continuación, enfríe las puntas de la pipeta a cuatro grados centígrados. Cubra los portaobjetos con cinco microlitros de frío 100% ECM sobre hielo. Colóquelos en una incubadora de cultivo celular a 37 grados centígrados durante al menos 30 minutos para su consolidación.Contar las HNE cosechadas del cocultivo utilizando un hemocitómetro. Luego, diluya las células a 500 células por microlitros en número total, con un 20% de ECM diluido por medios de diferenciación en hielo. Saque los portaobjetos recubiertos de ECM de la incubadora y siembre cinco microlitros de la mezcla de ECM de células frías en cada uno de los pozos.Transfiera los portaobjetos inmediatamente a una incubadora de cultivo a 37 grados Celsius durante una hora para consolidar la mezcla de ECM celular. Después de eso, saque las diapositivas de la incubadora y alimente las células en cada pozo de las diapositivas de angiogénesis de 15 pocillos con 50 microlitros de los medios de diferenciación. Devuelva el tobogán a la incubadora de cultivos a 37 grados centígrados, cambiando los medios cada dos días hasta que los organoides estén listos para más experimentos.Pretrate las diapositivas de la cámara con fondo de vidrio de 8 pocillos con adhesivo celular durante 30 minutos. Deseche la solución y seque al aire los pocillos durante otros 30 minutos. A continuación, deseche los medios de la parte superior del ECM y luego agregue 50 microlitros del 1x PBS frío en cada pozo de los toboganes de 15 pocillos en hielo.Pipete hacia arriba y hacia abajo de tres a cinco veces usando 200 microlitros de la punta de pipeta de gran diámetro. Dispense la solución en el centro de un pozo de los portaobjetos de la cámara de 8 pocillos. Retire el exceso de líquido inmediatamente de los pocillos con una pipeta de punta fina.Luego, coloque el deslizamiento de la cámara en una incubadora de 37 grados Celsius durante 40 minutos para mejorar el organoide que se adhiere al fondo de vidrio. Después de 40 minutos, lave suavemente los organoides con 1x PBS dos veces y fíjelos con 300 microlitros de paraformaldehído al 4% en cada pozo durante 30 minutos a temperatura ambiente. Lave dos veces con 1x PBS y almacene los organoides en 1x PBS establecido a cuatro grados Celsius para inmunotinción durante un máximo de dos semanas.Para cosechar los organoides para estudios histológicos, retire los medios del cultivo y agregue 50 microlitros de frío un 1x PBS en cada pozo de los portaobjetos en hielo. Pipete hacia arriba y hacia abajo de tres a cinco veces usando una punta de pipeta de gran diámetro de 200 microlitros. Combine todas las soluciones de los insertos de deslizamiento o cultivo de 15 pocillos en un tubo cónico de 15 mililitros sobre hielo.Ajuste el volumen total de solución en el tubo a 10 mililitros agregando 1x PBS frío. Centrifuga el tubo a cuatro grados centígrados, 300 veces g durante cinco minutos. Luego, aspire el sobrenadante y agregue 60 microlitros de histótico caliente para mezclar con el gránulo organoide usando una punta de pipeta de gran diámetro de 200 microlitros.Transfiera la suspensión inmediatamente a un molde histológico. Después de consolidar el histogel a temperatura ambiente, coloque el bloque de molde en paraformaldehído al 4% para su fijación durante la noche a cuatro grados centígrados. Abra el software y haga clic derecho en la parte inferior de la pantalla.A continuación, seleccione Controles de análisis, seguido de Resultados de medición automatizada. Abra la imagen organoide y seleccione de 5 a 10 organoides con lúmenes visibles. Mantenga presionado el botón derecho del ratón en la imagen para abrir el menú y seleccione ROI poligonal para delinear el organoide completo y obtener el área de superficie total del organoide.Luego, delinea el lumen para obtener el área de lumen. Repita esto para los organoides restantes en el pozo y todos los pozos en el ensayo. Finalmente, exporte los datos a Excel.Divida el área de lúmenes por el área de superficie total y promedie todos los organoides de la muestra para obtener la relación de lúmenes de referencia. Las imágenes de campo brillante representan HNE de una colección de muestras exitosa y no exitosa. Las HNE crecen bien en un gran grupo.En contraste, los HNE crecen mal en dos pequeños grupos que rodean las células 3T3 irradiadas. Los organoides en la diapositiva de 15 pocillos tienen imágenes más precisas y nítidas que las del inserto de cultivo. Además de esto, no se observaron diferencias morfológicas significativas en estos dos métodos de cultivo.Los organoides sin FQ suelen tener una luz más grande y más líquido que los organoides de FQ. La tinción de HNE en organoides de un sujeto sin FQ, F508del/F508del, y la tinción inmunofluorescente de cilios en un organoide se muestran en estas imágenes. Los cilios teñidos con acetilado-tubulina, el anticuerpo secundario marcado con FITC y los núcleos marcados con DAPI se muestran aquí.Aquí se muestran imágenes de máxima proyección de los dos organoides representativos por tinción inmunofluorescente de montaje completo y sus correspondientes imágenes de reconstrucción tridimensional. Se muestran moco y cilios dentro de la luz de los organoides. Las imágenes gráficas representan el ensayo de hinchazón inducido por forskolina para probar la función CFTR en las células epiteliales nasales primarias.Aquí se muestra un experimento representativo de dosis-respuesta de forskolina de voluntarios sin FQ. La dosis-respuesta de FSK se compara con el cambio fraccional promedio a una hora, versus a las ocho horas, lo que sugiere que el ensayo de ocho horas puede producir una diferencia de hinchazón más significativa entre las diferentes dosis de FSK que las de una hora. El área debajo de la curva puede mostrar una diferencia menor en la hinchazón en comparación con el cambio fraccional promedio a las ocho horas.Al intentar este procedimiento, tenga en cuenta que los organoides se perderán durante el proceso de recolección, fijación y tinción. Por lo tanto, se debe tener un cuidado meticuloso durante cada paso y se deben obtener suficientes números iniciales para garantizar el éxito. El cultivo de organoides en insertos de cultivo puede ayudar en este sentido, ya que se desarrollan estas técnicas.Aquí, hemos utilizado reactivos y suministros disponibles comercialmente para facilitar la expansión a otros investigadores. También se desarrolló un ensayo funcional que utilizó técnicas comunes de microscopio y equipos más especializados.

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