Name: culture and imaging of human nasal epithelial organoids
Uploaded: 2021-12-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culture and Imaging of Human Nasal Epithelial Organoids at JoVE.com

Vi erkänner tacksamt bidragen från alla deltagare som donerade HNE-borstbiopsier för att utveckla detta protokoll. Vi tackar Latona Kersh och children's Research Unit personal för att samordna rekrytering av studievolontärer och provsamlingar. Vi tackar Lily Deng, Johnathan Bailey och Stephen Mackay, tidigare praktikanter i vårt laboratorium, för teknisk hjälp. Vi tackar Zhong Liu och Rui Zhao för deras tekniska hjälp. Steven M. Rowe, chef för CF Research Center vid UAB, tillhandahåller ledarskap och resurser, utan vilka detta arbete inte skulle vara möjligt. Vi vill också tacka Sarah Guadiana på Biotek för hjälp med instrumentutbildning, Robert Grabski för konfokalmikroskopihjälp vid UAB High-Resolution Imaging Facility och Dezhi Wang för histologisk hjälp vid UAB Histology Core. Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (NIH.) Grant K23HL143167 (till JSG), Cystic Fibrosis Foundation (CFF) Grant GUIMBE18A0-Q (till JSG), Gregory Fleming James Cystic Fibrosis Center [NIH Grants R35HL135816 och DK072482 och CFF University of Alabama i Birmingham (UAB) Research and Development Program (Rowe19RO)] och UAB Center for Clinical and Translational Science (NIH Grant UL1TR001417).

HNE-prover samlades in på Children's of Alabama-sjukhuset. Alla procedurer och metoder som beskrivs här har godkänts av IRB University of Alabama i Birmingham (UAB IRB #151030001). För att underlätta expansionen och förbättra funktionen hos humana nasala epitelceller (HNET) anpassas de nuvarande odlingsmetoderna från den välkända odlingsmetoden för luft-vätskegränssnitt (ALI) 28,34. HRE samlades ursprungligen in genom borstbiopsi som tidigare beskriv...

<ol>
	<li>Brewington, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brushed+nasal+epithelial+cells+are+a+surrogate+for+bronchial+epithelial+CFTR+studies.">Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies.</a> JCI Insight. 3 (13), (2018).</li><li>Brewington, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+nasal+epithelial+cell+spheroids+for+individualized+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+study.">Generation of human nasal epithelial cell spheroids for individualized cystic fibrosis transmembrane conductance regulator study.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57492 (2018).</li><li>Brewington, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+CFTR+function+and+modulation+in+primary+human+nasal+cell+spheroids.">Detection of CFTR function and modulation in primary human nasal cell spheroids.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 17 (1), 26-33 (2017).</li><li>Bridges, M. A., Walker, D. C., Davidson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+and+control+nasal+epithelial+cells+harvested+by+a+brushing+procedure.">Cystic fibrosis and control nasal epithelial cells harvested by a brushing procedure.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. 27 (9), 684-686 (1991).</li><li>Bridges, M. A., Walker, D. C., Harris, R. A., Wilson, B. R., Davidson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultured+human+nasal+epithelial+multicellular+spheroids:+polar+cyst-like+model+tissues.">Cultured human nasal epithelial multicellular spheroids: polar cyst-like model tissues.</a> Biochemistry and Cell Biology. 69 (2-3), 102-108 (1991).</li><li>Collie, G., Buchwald, M., Harper, P., Riordan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+sweat+gland+epithelial+cells+from+normal+individuals+and+patients+with+cystic+fibrosis.">Culture of sweat gland epithelial cells from normal individuals and patients with cystic fibrosis.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. 21 (10), 597-602 (1985).</li><li>Conger, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+(CFTR)+and+ciliary+beat+frequency+activation+by+the+CFTR+Modulators+Genistein,+VRT-532,+and+UCCF-152+in+primary+sinonasal+epithelial+cultures.">Comparison of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) and ciliary beat frequency activation by the CFTR Modulators Genistein, VRT-532, and UCCF-152 in primary sinonasal epithelial cultures.</a> JAMA Otolaryngology-Head &amp; Neck Surgery. 139 (8), 822-827 (2013).</li><li>de Courcey, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+primary+human+nasal+epithelial+cell+cultures+for+the+study+of+cystic+fibrosis+pathophysiology.">Development of primary human nasal epithelial cell cultures for the study of cystic fibrosis pathophysiology.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 303 (11), 1173-1179 (2012).</li><li>Gruenert, D. C., Basbaum, C. B., Widdicombe, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+normal+and+cystic+fibrosis+epithelial+cells+grown+under+serum-free+conditions.">Long-term culture of normal and cystic fibrosis epithelial cells grown under serum-free conditions.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. 26 (4), 411-418 (1990).</li><li>Mosler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feasibility+of+nasal+epithelial+brushing+for+the+study+of+airway+epithelial+functions+in+CF+infants.">Feasibility of nasal epithelial brushing for the study of airway epithelial functions in CF infants.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 7 (1), 44-53 (2008).</li><li>Anderson, J. D., Liu, Z., Odom, L. V., Kersh, L., Guimbellot, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFTR+function+and+clinical+response+to+modulators+parallel+nasal+epithelial+organoid+swelling.">CFTR function and clinical response to modulators parallel nasal epithelial organoid swelling.</a> The American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 321 (1), 119-129 (2021).</li><li>Guimbellot, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasospheroids+permit+measurements+of+CFTR-dependent+fluid+transport.">Nasospheroids permit measurements of CFTR-dependent fluid transport.</a> JCI Insight. 2 (22), (2017).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+nasal+epithelial+organoids+for+therapeutic+development+in+cystic+fibrosis.">Human nasal epithelial organoids for therapeutic development in cystic fibrosis.</a> Genes (Basel). 11 (6), (2020).</li><li>Muller, L., Brighton, L. E., Carson, J. L., Fischer, W. A., Jaspers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+of+human+nasal+epithelial+cells+at+the+air+liquid+interface.">Culturing of human nasal epithelial cells at the air liquid interface.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2013).</li><li>Dekkers, J. F., vander Ent, C. K., Beekman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+opportunities+for+CFTR-targeting+drug+development+using+organoids.">Novel opportunities for CFTR-targeting drug development using organoids.</a> Rare Diseases. 1, 27112 (2013).</li><li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+CFTR+assay+using+primary+cystic+fibrosis+intestinal+organoids.">A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids.</a> Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).</li><li>Okiyoneda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism-based+corrector+combination+restores+DeltaF508-CFTR+folding+and+function.">Mechanism-based corrector combination restores DeltaF508-CFTR folding and function.</a> Nature Chemical Biology. 9 (7), 444-454 (2013).</li><li>Schwank, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+repair+of+CFTR+by+CRISPR/Cas9+in+intestinal+stem+cell+organoids+of+cystic+fibrosis+patients.">Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients.</a> Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).</li><li>Geurts, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-based+adenine+editors+correct+nonsense+mutations+in+a+cystic+fibrosis+organoid+biobank.">CRISPR-based adenine editors correct nonsense mutations in a cystic fibrosis organoid biobank.</a> Cell Stem Cell. 26 (4), 503-510 (2020).</li><li>Bove, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+in+vitro+alveolar+type+II+cell+proliferation+barrier+while+retaining+ion+transport+properties.">Breaking the in vitro alveolar type II cell proliferation barrier while retaining ion transport properties.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (4), 767-776 (2014).</li><li>Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+keratinocytes+are+efficiently+immortalized+by+a+Rho+kinase+inhibitor.">Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor.</a> Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2619-2626 (2010).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK+inhibitor+and+feeder+cells+induce+the+conditional+reprogramming+of+epithelial+cells.">ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells.</a> The American Journal of Pathology. 180 (2), 599-607 (2012).</li><li>Palechor-Ceron, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation+induces+diffusible+feeder+cell+factor(s)+that+cooperate+with+ROCK+inhibitor+to+conditionally+reprogram+and+immortalize+epithelial+cells.">Radiation induces diffusible feeder cell factor(s) that cooperate with ROCK inhibitor to conditionally reprogram and immortalize epithelial cells.</a> The American Journal of Pathology. 183 (6), 1862-1870 (2013).</li><li>Scudieri, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionocytes+and+CFTR+chloride+channel+expression+in+normal+and+cystic+fibrosis+nasal+and+bronchial+epithelial+cells.">Ionocytes and CFTR chloride channel expression in normal and cystic fibrosis nasal and bronchial epithelial cells.</a> Cells. 9 (9), (2020).</li><li>Marthin, J. K., Stevens, E. M., Larsen, L. A., Christensen, S. T., Nielsen, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+three-dimensional+explant+spheroids+derived+from+human+nasal+airway+epithelium:+a+simple+methodological+approach+for+ex+vivo+studies+of+primary+ciliary+dyskinesia.">Patient-specific three-dimensional explant spheroids derived from human nasal airway epithelium: a simple methodological approach for ex vivo studies of primary ciliary dyskinesia.</a> Cilia. 6, 3 (2017).</li><li>Blouquit, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+and+fluid+transport+properties+of+small+airways+in+cystic+fibrosis.">Ion and fluid transport properties of small airways in cystic fibrosis.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 174 (3), 299-305 (2006).</li><li>Birket, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+therapy+with+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+modulators+augment+the+airway+functional+microanatomy.">Combination therapy with cystic fibrosis transmembrane conductance regulator modulators augment the airway functional microanatomy.</a> The American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 310 (10), 928-939 (2016).</li><li>Birket, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+anatomic+defect+of+the+cystic+fibrosis+airway.">A functional anatomic defect of the cystic fibrosis airway.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 190 (4), 421-432 (2014).</li><li>Chu, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle-tracking+microrheology+using+micro-optical+coherence+tomography.">Particle-tracking microrheology using micro-optical coherence tomography.</a> Biophysical Journal. 111 (5), 1053-1063 (2016).</li><li>Chu, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.+In+vivo+imaging+of+airway+cilia+and+mucus+clearance+with+micro-optical+coherence+tomography.">et al. In vivo imaging of airway cilia and mucus clearance with micro-optical coherence tomography.</a> Biomedical Optics Express. 7 (7), 2494-2505 (2016).</li><li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+quantitative+study+of+airway+functional+microanatomy+using+micro-optical+coherence+tomography.">Method for quantitative study of airway functional microanatomy using micro-optical coherence tomography.</a> PLoS One. 8 (1), 54473 (2013).</li><li>Tuggle, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+defects+in+ion+transport+and+tissue+development+in+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+(CFTR)-knockout+rats.">Characterization of defects in ion transport and tissue development in cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-knockout rats.</a> PLoS One. 9 (3), 91253 (2014).</li><li>McCravy, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalised+medicine+for+non-classic+cystic+fibrosis+resulting+from+rare+CFTR+mutations.">Personalised medicine for non-classic cystic fibrosis resulting from rare CFTR mutations.</a> European Respiratory Journal. 56 (1), 2000062 (2020).</li><li>Mutyam, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+benefit+observed+with+the+CFTR+potentiator,+ivacaftor,+in+a+CF+patient+homozygous+for+the+W1282X+CFTR+nonsense+mutation.">Therapeutic benefit observed with the CFTR potentiator, ivacaftor, in a CF patient homozygous for the W1282X CFTR nonsense mutation.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 16 (1), 24-29 (2017).</li><li>Corning Inc. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> CORNING CELL-TAK CELL AND TISSUE ADHESIVE. , (2013).</li><li>Anderson, J. D., Liu, Z., Odom, L. V., Kersh, L., Guimbellot, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFTR+function+and+clinical+response+to+modulators+parallel+nasal+epithelial+organoid+swelling.">CFTR function and clinical response to modulators parallel nasal epithelial organoid swelling.</a> The American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 321 (1), 119-129 (2021).</li><li>Biotek Instruments, Incorporated. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Lionheart FX Live Cell Imager Operator's Manual. , (2016).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Simmonds, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+it+cystic+fibrosis?+The+challenges+of+diagnosing+cystic+fibrosis.">Is it cystic fibrosis? The challenges of diagnosing cystic fibrosis.</a> Paediatric Respiratory Reviews. 31, 6-8 (2019).</li><li>McGarry, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+and+in+vitro+ivacaftor+response+in+cystic+fibrosis+patients+with+residual+CFTR+function:+N-of-1+studies.">In vivo and in vitro ivacaftor response in cystic fibrosis patients with residual CFTR function: N-of-1 studies.</a> Pediatric Pulmonology. 52 (4), 472-479 (2017).</li><li>Garratt, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+culture+success+in+an+airway+epithelium+sampling+program+of+young+children+with+cystic+fibrosis.">Determinants of culture success in an airway epithelium sampling program of young children with cystic fibrosis.</a> Experimental Lung Research. 40 (9), 447-459 (2014).</li></ol>

Detta manuskript ger detaljerade metoder för omfattande levande och fast avbildning av luftvägsepitelorganoiderna härledda från HNE-borstbiopsi. Den beskriver funktionella analyser som kan bestämma CFTR-aktivitet hos en individ. HRE ger en minimalt invasiv, primär vävnad för en mängd olika applikationer. Expansionsteknikerna som erbjuds här kan användas för modellering av luftvägssjukdomar, inklusive organoider. Organoider kan användas för precisionsterapeutiska metoder och för att övervaka stabiliteten ...

Introduktion till tekniken Ex vivo kulturbaserade analyser är ett alltmer använt verktyg för precisionsmedicin och studier av sjukdomsattofysiologi. Primär human nasal epitelial (HNE) cellodling har använts i många studier av cystisk fibros 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 , en autosomal recessiv sjukdom som påverkar epitelcellsfunktionen i flera organ. HNE-kultur ger en förnybar källa till luftvägsepitel som kan erhållas prospektivt och rekapitulerar elektrofysiologiska och biokemiska egenskaper för att testa Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator (CFTR) aktivitet. HNE-celler kan provtas med minimala biverkningar14, liknande vanliga virala andningspinnar. Forskningsarbete som beskriver en modell för cystisk fibrosstudie härledd från HNE-borstbiopsier har nyligen publicerats 11,13. I likhet med andra modeller som använder primär HNE 2,3 och tarmvävnad 15,16,17,18,19 beskrivs här detaljerad karakterisering av differentieringen och avbildningen av denna modell för användning i CF-forskning och för att hjälpa till i studier av andra luftvägssjukdomar 13 . Organoidmodellen är inte obegränsad som odödliga cellinjer utan kan utökas genom villkorlig omprogrammering (med användning av bestrålade och inaktiverade matarfibroblaster och Rho-kinashämmare) till ett mer stamcellsliknande tillstånd 20,21,22,23. Bearbetningen av HNE-borstbiopsier med denna metod ger ett stort antal epitelceller för användning i flera applikationer med högre genomströmning samtidigt som förmågan att differentiera sig helt bibehålls. Medan detta protokoll utvecklades med hjälp av matarceller kan andra metoder användas av utredare som vill undvika matarcellsteknik14,24.
Teknikens betydelse för lungbiologi En betydande studie har ägnats åt att förstå hur frånvaron av regelbunden, fungerande CFTR i cellmembranet i epitelceller resulterar i dysfunktion i lungorna, bukspottkörteln, levern, tarmen eller andra vävnader. Dysfunktionell epitelial jontransport, särskilt den för klorid och bikarbonat, resulterar i en minskad volym av epitelfodervätskorna och förändringar i slemhinnor, vilket leder till slemhinnor och obstruktion. Vid andra luftvägssjukdomar, såsom primär ciliär dyskinesi, försämrar förändrad ciliär rörelse mukociliär clearance och leder till slemhinnor och obstruktion25. Därför har den nuvarande HNE-organoidmodellen utvecklats för olika tillämpningar, beroende på prövarens experimentella design och resurser. Detta inkluderar live-cell-avbildning med hjälp av levande cellfläckar; fixering och sektionering för att karakterisera morfologin; immunofluorescensfärgning med antikroppar och helmonterad konfokalavbildning för att undvika att störa intraluminala strukturer; och ljusfältsavbildning och mikrooptisk koherenstomografi för kvantitativa mätningar av ciliär slagfrekvens och mukociliär transport13. För att underlätta expansionen till andra utredare användes kommersiellt tillgängliga reagenser och förnödenheter för odling. En funktionell analys utvecklades som använde vanliga mikroskoptekniker och mer specialiserad utrustning. Sammantaget, medan den nuvarande modellen utformades för att bedöma CFTR-aktivitet vid baslinjen eller som svar på terapier, kan de tekniker som beskrivs i detta protokoll tillämpas på andra sjukdomar som involverar epitelcellsfunktion, särskilt epitelcellsvätsketransport.
Jämförelse med andra metoder Nyligen utvecklades nyttan av denna organoidmodell genom att korrelera CFTR-modulatorsvar in vitro hos patienternas organoider med deras kliniska svar11. I synnerhet visas det också att den nuvarande modellen parallella kortslutningsströmsvar, den nuvarande guldstandarden för bedömning av CFTR-funktionen, hos samma patienter. Kortslutningsström skiljer sig från svullnadsanalysen eftersom den förra mäter CFTR-funktionen via jontransport26. Däremot mäter denna analys en mer nedströms effekt med vätsketransport, vilket ger ytterligare information om den övergripande funktionen av CFTR 27,28,29,30,31,32. Kortslutningsströmmätningar har fortsatt att vara en vanlig och tillförlitlig metod för att bestämma CFTR-kloridkanalaktivitet 1,33. Dessa elektrofysiologiska analyser kräver specialiserad, dyr utrustning, kräver många gånger fler celler för varje experimentell replikat än organoidanalysen, kan inte enkelt automatiseras och är inte mottagliga för uppskalning för applikationer med högre genomströmning. En annan organoidmodell härledd från tarmepitel har ytterligare fördelar 15,16,17,18, såsom mer utmärkt replikativ förmåga, men härrör varken från en luftvägsvävnad eller är allmänt tillgänglig. HNE-borstningar erhålls med billiga cytologiborstar utan behov av sedering och med minimal risk. Att få borstningen kräver ingen kliniker och kan utföras av utbildade forskningskoordinatorer och annan forskningspersonal14. HNE-organoidmodellen kan odlas av alla laboratorier med primär cellodlingskapacitet, och några av applikationerna kan utföras med standardmikroskopitekniker. Sammantaget ger dessa fördelar ytterligare tillgång till teknik för att bedöma luftvägsepitelfunktionen som annars inte skulle vara tillgänglig för vissa laboratorier. Vidare kan HNE-organoider användas för att studera andra sjukdomstillstånd som påverkar luftvägarna, såsom primär ciliär dyskinesi25 eller virusinfektion, vilket tarmorganoider inte kan.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Nasal brush</td>
			<td>Medical Packaging CYB1</td>
			<td>CYB-1</td>
			<td>Length: 8 inches, width approximately 7 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large-Orifice Pipette Tips</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>02-707-141</td>
			<td>Large bore pipette tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>Cell detachment solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% trypsin -EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor from soybean</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6522</td>
			<td>Working solution: 1mg/mL in 1XDPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356255</td>
			<td>Extracellular matrix (EM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide Angiogenesis</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81506</td>
			<td>15-well slide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-Well Transwell</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7200154</td>
			<td>Culture insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chambered Coverglass</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>155409</td>
			<td>8-well glass-bottom chamber slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>354240</td>
			<td>Cell adhesive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>50980487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A16046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucBlue</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>R37605</td>
			<td>DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ts2-FL (Inverted Routine Microscope)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Inverted epi-fluorescence microscope or bright-field microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R-HD25</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements- Basic Research</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>manual imaging analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histogel</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Base Molds</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>41-740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lionheart FX</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BTLFX</td>
			<td>Automated image system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lionheart Cover</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1450009</td>
			<td>Environmental Control Lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity Chamber</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1450006</td>
			<td>Stage insert (environmental chamber)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Controller for CO2 and O2</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1210013</td>
			<td>Gas controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate/Slide Stage Insert</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1450527</td>
			<td>Slide holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5 Imaging Prime Software</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BTGEN5IPRIM</td>
			<td>Automated imaging analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x Phase Contrast Objective</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1320515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Phase Contrast Objective</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1320516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED Cube</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1225007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Cube (DAPI)</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1225100</td>
			<td>DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFTRinh-172</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S7139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBMX</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expansion Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12 Nutrient mix</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;16140-071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;15-140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;C8052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;PHG0314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone (HC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;H0888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;A2786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>&#160;04-0012-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceftazidime</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>&#160;J66460-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tobramycin</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>&#160;J67340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vancomycin</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>&#160;J67251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Differentiation Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 (1:1)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;11330-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultroser-G</td>
			<td>Pall</td>
			<td>&#160;15950-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Clone II</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>&#160;SH30066.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Brain Extract</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>&#160;CC-4098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;I-9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;H-0888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triiodothyronine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;T-6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;T-0665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanolamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;E-0135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epinephrine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-4250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-Phosphorylethanolamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R-2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human CFTR antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB1660</td>
			<td>Dilution: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZO-1 antibody</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>MA3-39100-A647</td>
			<td>Dilution: 1000x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MUC5B antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HPA008246</td>
			<td>Dilution: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-acetylated tubulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7451</td>
			<td>Dilution: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-beta IV Tubulin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab11315</td>
			<td>Dilution: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21202</td>
			<td>Dilution: 2000x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21207</td>
			<td>Dilution: 2000x</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture and imaging of human nasal epithelial organoids

Individualiserad behandling för patienter med cystisk fibros (CF) kan uppnås med en in vitro-sjukdomsmodell för att förstå baseline Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) aktivitet och återställande från småmolekylära föreningar. Vår grupp fokuserade nyligen på att etablera en väl differentierad organoidmodell direkt härledd från primära humana nasala epitelceller (HNE). Histologi av sektionerade organoider, helmonterad immunofluorescerande färgning och avbildning (med användning av konfokalmikroskopi, immunofluorescerande mikroskopi och ljusfält) är väsentliga för att karakterisera organoider och bekräfta epiteldifferentiering som förberedelse för funktionella analyser. Dessutom producerar HNE-organoider lumen av varierande storlek som korrelerar med CFTR-aktivitet, vilket skiljer mellan CF- och icke-CF-organoider. I detta manuskript beskrivs metoden för odling av HNE-organoider i detalj, med fokus på bedömningen av differentiering med hjälp av bildmetoderna, inklusive mätning av baslinjens lumenområde (en metod för CFTR-aktivitetsmätning i organoider som alla laboratorier med mikroskop kan använda) samt det utvecklade automatiserade tillvägagångssättet för en funktionell analys (som kräver mer specialiserad utrustning).

HNEs expansion är avgörande för en blomstrande organoidkultur. HRE från en framgångsrik provinsamling bör expandera till över 70% sammanflöde runt 10 dagar. Ett exempel på lyckade och misslyckade prover visas i figur 1A respektive figur 1B. Cellerna måste kasseras om de inte kan nå 70% sammanflöde senast 14 dagar efter samodling med bestrålade 3T3-celler. Alla förorenade celler ska omedelbart kasseras om de inte snabbt kan rädda m...

Watch this Scientific Journal Video about Culture and Imaging of Human Nasal Epithelial Organoids at JoVE.com

Culture and Imaging of Human Nasal Epithelial Organoids

Ett detaljerat protokoll presenteras här för att beskriva en in vitro-organoidmodell från humana nasala epitelceller. Protokollet har alternativ för mätningar som kräver standard laboratorieutrustning, med ytterligare möjligheter till specialutrustning och programvara.

Kultur och avbildning av humana nasala epitelorganoider

Individualized therapy for cystic fibrosis (CF) patients can be achieved with an in vitro disease model to understand baseline Cystic Fibrosis ...

Individualiserad behandling för patienter med cystisk fibros kan uppnås med en in vitro-sjukdomsmodell för att förstå CFTR-aktiviteten vid baslinjen. Humana nasala epitelorganoider, eller HNE-organoider, producerar lumen av varierande storlek som korrelerar med CFTR-aktiviteten, vilket skiljer mellan CF och icke-CF-organoider. Här har vi beskrivit en metod för odling och avbildning av dessa HNE-organoider i detalj.Dysfunktionell epitelial jontransport, särskilt den för klorid och bikarbonat, resulterar i en minskad volym av epitelfodervätskorna. Detta påverkar också slemsekretionerna som leder till mukoskost och obstruktion. Därför har vår HNE-modell utvecklats för olika tillämpningar, beroende på utredarens experimentella design och resurser.Förutom att bedöma CFTR-aktivitet vid baslinjen eller som svar på terapier, kan denna teknik också tillämpas på andra sjukdomar som involverar epitelcellsfunktion, särskilt epitelcellsvätsketransport. Dessa metoder utvecklades främst för användning i studier av cystisk fibros. Andra studier som utvärderar luftvägsepitelin, såsom primär ciliär dyskinesi, kan också hitta dessa metoder till hjälp.Dessa tekniker kräver uppmärksamhet på detaljer och precision. De kräver också noggrann observation för att säkerställa att den initiala expansionen av celler är lämplig. Övervaka alla kulturer varje dag, och framgången blir mer sannolik.Till att börja med, dissociera näsborstbiopsin i 8 milliters RPMI-media i ett 15 ml koniskt rör genom att passera cytologiborsten flera gånger genom en en milliliter storborrad pipettspets. Centrifugera cellerna vid 500 gånger g i fem minuter vid fyra grader Celsius. Kassera supernatanten och suspendera sedan cellpelleten igen i tre milliliter cellavskiljningslösning.Inkubera vid rumstemperatur i 16 minuter för att smälta. Använd fem milliliter av expansionsmediet för att tvätta cellerna två gånger. Lägg sedan till dem i en T75-kolv, försådd med bestrålade, inaktiverade och 50 till 60% sammanflytande 3T3-fibroblaster.Låt cellerna samkulturera och expandera i expansionsmediet i 7 till 14 dagar. Om antibiotika infördes för celler som härrör från patienter med cystisk fibros, bör mediet ersättas med antibiotikafritt expansionsmedier efter de första tre dagarna av odlingen och kan fortsätta att byta media varannan dag tills 80% sammanflytande. Tvätta cellerna med 1x DPBS.Tillsätt sedan 1,5 ml 0,05% trypsin-EDTA i T75-kolven och inkubera i fyra minuter vid 37 grader Celsius för att avlägsna den bestrålade och inaktiverade 3T3-fibroblasten från kulturen. Skölj T75-kolven med 1x DPBS två gånger för att noggrant tvätta bort eventuella kvarvarande 3T3-fibroblaster. Tillsätt 1,5 ml 0,05% trypsin-EDTA i T75-kolven och inkubera i 10 minuter vid 37 grader Celsius för att lossa HRE.Neutralisera trypsin med sojabönstrypsinhämmare i ett ett-till-ett-förhållande. Centrifugera cellerna vid 500 gånger gi i fem minuter. Kassera sedan supernatanten och tvätta cellerna med fem milliliter expansionsmedia en gång.Cellerna är nu redo för sådd för att odla organoider. Tina organoidkulturen extracellulär matris eller ECM över natten vid fyra grader Celsius. Kyl 15-brunns angiogenesbilderna över natten vid samma temperatur.Kyl sedan pipettspetsarna till fyra grader Celsius. Täck rutschkanorna med fem mikroliter kall 100% ECM på is. Placera dem i en cellodlingsinkubator vid 37 grader Celsius i minst 30 minuter för konsolidering.Räkna de HNE som skördats från samodling med hjälp av en hemocytometer. Späd sedan cellerna till 500 celler per mikroliter i totalt antal, med 20% ECM utspätt med differentieringsmedia på is. Ta de ECM-belagda bilderna ur inkubatorn och frö fem mikroliter av den kalla cellen ECM-blandningen i var och en av brunnarna.Överför bilderna omedelbart till en kulturinkubator vid 37 grader Celsius i en timme för att konsolidera cellens ECM-blandning. Ta sedan bilderna ur inkubatorn och mata cellerna i varje brunn av 15-brunnsangiogenesbilderna med 50 mikroliter av differentieringsmediet. Sätt tillbaka bilden i kulturinkubatorn vid 37 grader Celsius, byt media varannan dag tills organoiderna är redo för ytterligare experiment.Förbehandla de 8-brunns glasbottenkammarglidorna med celllim i 30 minuter. Kassera lösningen och lufttorka brunnarna i ytterligare 30 minuter. Kasta sedan mediet från toppen av ECM och tillsätt sedan 50 mikroliter av den kalla 1x PBS i varje brunn av de 15-brunnsrutschbanorna på is.Pipettera upp och ner tre till fem gånger med 200 mikroliter av pipettspetsen med stor borrning. Fördela lösningen på mitten av en brunn i 8-brunnskammarens bilder. Ta bort överskottsvätskan omedelbart från brunnarna med en finspetspipett.Placera sedan kammarbilden i en 37 grader Celsius inkubator i 40 minuter för att förbättra organoiden som fäster vid glasbotten. Tvätta organoiderna försiktigt med 1x PBS två gånger efter 40 minuter och fixera dem med 300 mikroliter 4% paraformaldehyd i varje brunn i 30 minuter ställ in rumstemperaturen. Tvätta två gånger med 1x PBS och förvara organoiderna i 1x PBS-uppsättning fyra grader Celsius för immunfärgning i upp till två veckor.För att skörda organoiderna för histologiska studier, ta bort media från kulturen och tillsätt 50 mikroliter kall en 1x PBS i varje brunn av bilderna på is. Pipettera upp och ner tre till fem gånger med en 200 mikroliter storborrad pipettspets. Kombinera alla lösningar från 15-brunnsrutschkanan eller kulturinsatserna i ett 15 ml koniskt rör på is.Justera den totala lösningsvolymen i röret till 10 ml genom att tillsätta kall 1x PBS. Centrifugera röret vid fyra grader Celsius, 300 gånger g i fem minuter. Aspirera sedan ut supernatanten och tillsätt 60 mikroliter varm histogel för att blanda med organoidpelleten med en 200 mikroliter storborrad pipettspets.Överför suspensionen omedelbart till en histologiform. Efter konsolidering av histogelen vid rumstemperatur, sätt formblocket i 4% paraformaldehyd för fixering över natten vid fyra grader Celsius. Öppna programvaran och högerklicka längst ner på skärmen.Välj sedan Analyskontroller följt av Automatiserade mätresultat. Öppna organoidbilden och välj 5 till 10 organoider med synliga lumen. Håll högerklicka på bilden för att öppna menyn och välj Polygonal ROI för att beskriva hela organoiden för att få organoidens totala yta.Skissera sedan lumen för att få lumenområdet. Upprepa detta för de återstående organoiderna i brunnen och alla brunnar i analysen. Slutligen exportera data till Excel.Dela lumenområdet med den totala ytan och genomsnittligt alla organoider från provet för att få Baseline Lumen Ratio. De ljusa fältbilderna representerar HRE:er från en lyckad och misslyckad provsamling. HNES växer bra i ett stort kluster.Däremot växer HNE: erna dåligt i två små kluster som omger de bestrålade 3T3-cellerna. Organoider i 15-brunnsbilden har mer exakta och skarpare bilder än de i kulturinsatsen. Förutom detta observerades ingen signifikant morfologisk skillnad i dessa två odlingsmetoder.Icke-CF-organoider har vanligtvis en större lumen och mer vätska än CF-organoider. HNE-färgningen i organoider från en icke-CF, F508del / F508del-ämne, och immunofluorescerande färgning av cilia i en organoid visas i dessa bilder. Cilia färgade med acetylerat tubulin, FITC-märkt sekundär antikropp och kärnorna märkta med DAPI visas här.Maximala projektionsbilder av de två representativa organoiderna genom helmonterad immunofluorescerande färgning och deras motsvarande tredimensionella rekonstruktionsbilder visas här. Slem och cilia i organoidernas lumen visas. De grafiska bilderna representerar forskolin-inducerad svullnad analys för att testa CFTR funktion på de primära nasala epitelcellerna.En representativ forskolin dos-respons experiment av icke-CF frivilliga visas här. FSK-dosresponsen jämförs med den genomsnittliga fraktionella förändringen vid en timme, jämfört med åtta timmar, vilket tyder på att åttatimmarsanalysen kan ge en mer signifikant svullnadsskillnad mellan olika FSK-doser än de vid en timme. Området under kurvan kan visa en mindre skillnad i svullnad jämfört med genomsnittlig fraktionerad förändring vid åtta timmar.När du försöker denna procedur, kom ihåg att organoider kommer att gå vilse under insamlings-, fixerings- och färgningsprocessen. Så noggrann försiktighet måste vidtas under varje steg och tillräckliga startnummer måste erhållas för att säkerställa framgång. Växande organoider i kulturinsatser kan hjälpa till i detta avseende, eftersom dessa tekniker utvecklas.Här har vi använt kommersiellt tillgängliga reagenser och förnödenheter för att underlätta expansion till andra utredare. En funktionell analys utvecklades också som använde vanliga mikroskoptekniker och mer specialiserad utrustning.

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

Isolering, kultur, och avbildning av Human Fetal Pankreas cell kluster

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

Primary Culture of Human Vestibular Schwannomas

Primär kultur av Human Vestibular Schwannomas

Vestibular schwannomas (VSs) represent Schwann cell (SC) tumors of the vestibular nerve, compromising 10% of all intracranial neoplasms. VSs occur in ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Isolering, Frysförvaring och kultur för mänskliga amnion epitelceller för kliniska tillämpningar

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Establishment of Human Epithelial Enteroids and Colonoids from Whole Tissue and Biopsy

Etablering av Human Epithelial Enteroids och Colonoids från Whole Tissue och biopsi

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem ...

Absorption of Nasal and Bronchial Fluids: Precision Sampling of the Human Respiratory Mucosa and Laboratory Processing of Samples

Absorptionen av Nasal och bronkiell vätskor: Precision provtagning i mänskliga andningsorganen slemhinnor och laboratorium bearbetning av prover

The methods of nasal absorption (NA) and bronchial absorption (BA) use synthetic absorptive matrices (SAM) to absorb the mucosal lining fluid (MLF) of the ...

Standardized Measurement of Nasal Membrane Transepithelial Potential Difference (NPD)

Standardized Measurement of Nasal Membrane Transepithelial Potential Difference NPD

Standardiserad mätning av näsans membran Transepithelial Potential skillnad (NPD)

We describe a standardized measurement of nasal potential difference (NPD). In this technique, cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) ...

Generation of Human Nasal Epithelial Cell Spheroids for Individualized Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Study

Generation av mänsklig Nasal epitelial Cell Spheroids för individualiserad cystisk fibros Transmembrane Conductance Regulator studie

While the introduction of Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) modulator drugs has revolutionized care in Cystic Fibrosis (CF), the ...

Muscle Imbalances: Testing and Training Functional Eccentric Hamstring Strength in Athletic Populations

Muskel obalans: Testning och utbildning funktionell excentrisk Hamstring styrka i atletisk populationer

Many hamstring injuries that occur during physical activity occur while the muscles are lengthening, during eccentric hamstring muscle actions. Opposite ...

Quantitative Mapping of Specific Ventilation in the Human Lung using Proton Magnetic Resonance Imaging and Oxygen as a Contrast Agent

Kvantitativ kart läggning av specifik ventilation i Human lung med Proton Magnetic resonanstomografi och syre som kontrast medel

Specific ventilation imaging (SVI) is a functional magnetic resonance imaging technique capable of quantifying specific ventilation &#8213; the ratio of ...