Name: culture and imaging of human nasal epithelial organoids
Uploaded: 2021-12-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culture and Imaging of Human Nasal Epithelial Organoids at JoVE.com

Bu protokolü geliştirmek için HNE fırça biyopsileri bağışlayan tüm katılımcıların katkılarını minnetle kabul ediyoruz. Latona Kersh ve Çocuk Araştırma Birimi personeline, çalışma gönüllüsü işe alımını ve örnek koleksiyonlarını koordine ettikleri için teşekkür ederiz. Teknik yardım için laboratuvarımızdaki eski stajyerler olan Lily Deng, Johnathan Bailey ve Stephen Mackay'a teşekkür ederiz. Zhong Liu ve Rui Zhao'ya teknik yardımları için teşekkür ederiz. UAB'deki CF Araştırma Merkezi Direktörü Steven M. Rowe, bu çalışmanın mümkün olmayacağı liderlik ve kaynaklar sağlar. Ayrıca, enstrüman eğitimi konusundaki yardımı için Biotek'ten Sarah Guadiana'ya, UAB Yüksek Çözünürlüklü Görüntüleme Tesisi'nde konfokal mikroskopi yardımı için Robert Grabski'ye ve UAB Histoloji Çekirdeği'nde histolojik yardım için Dezhi Wang'a teşekkür etmek istiyoruz. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) tarafından desteklenmiştir. Hibe K23HL143167 (JSG'ye), Kistik Fibroz Vakfı (CFF) Hibe GUIMBE18A0-Q (JSG'ye), Gregory Fleming James Kistik Fibrozis Merkezi [NIH Grants R35HL135816 ve DK072482 ve CFF Birmingham'daki Alabama Üniversitesi (UAB) Araştırma ve Geliştirme Programı (Rowe19RO)] ve UAB Klinik ve Translasyonel Bilimler Merkezi (NIH Grant UL1TR001417).

HNE örnekleri Alabama Çocuk Hastanesi'nde toplandı. Burada açıklanan tüm prosedürler ve yöntemler Birmingham'daki IRB Alabama Üniversitesi tarafından onaylanmıştır (UAB IRB #151030001). İnsan burun epitel hücrelerinin (HNE) genişlemesini kolaylaştırmak ve işlevini iyileştirmek için, mevcut kültürleme yöntemleri, iyi bilinen hava-sıvı arayüzü (ALI) kültür yöntemi 28,34'ten uyarlanmıştır. HNE'ler başlangıçta daha önce tarif edi...

<ol>
	<li>Brewington, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brushed+nasal+epithelial+cells+are+a+surrogate+for+bronchial+epithelial+CFTR+studies.">Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies.</a> JCI Insight. 3 (13), (2018).</li><li>Brewington, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+nasal+epithelial+cell+spheroids+for+individualized+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+study.">Generation of human nasal epithelial cell spheroids for individualized cystic fibrosis transmembrane conductance regulator study.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57492 (2018).</li><li>Brewington, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+CFTR+function+and+modulation+in+primary+human+nasal+cell+spheroids.">Detection of CFTR function and modulation in primary human nasal cell spheroids.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 17 (1), 26-33 (2017).</li><li>Bridges, M. A., Walker, D. C., Davidson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+and+control+nasal+epithelial+cells+harvested+by+a+brushing+procedure.">Cystic fibrosis and control nasal epithelial cells harvested by a brushing procedure.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. 27 (9), 684-686 (1991).</li><li>Bridges, M. A., Walker, D. C., Harris, R. A., Wilson, B. R., Davidson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultured+human+nasal+epithelial+multicellular+spheroids:+polar+cyst-like+model+tissues.">Cultured human nasal epithelial multicellular spheroids: polar cyst-like model tissues.</a> Biochemistry and Cell Biology. 69 (2-3), 102-108 (1991).</li><li>Collie, G., Buchwald, M., Harper, P., Riordan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+sweat+gland+epithelial+cells+from+normal+individuals+and+patients+with+cystic+fibrosis.">Culture of sweat gland epithelial cells from normal individuals and patients with cystic fibrosis.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. 21 (10), 597-602 (1985).</li><li>Conger, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+(CFTR)+and+ciliary+beat+frequency+activation+by+the+CFTR+Modulators+Genistein,+VRT-532,+and+UCCF-152+in+primary+sinonasal+epithelial+cultures.">Comparison of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) and ciliary beat frequency activation by the CFTR Modulators Genistein, VRT-532, and UCCF-152 in primary sinonasal epithelial cultures.</a> JAMA Otolaryngology-Head &amp; Neck Surgery. 139 (8), 822-827 (2013).</li><li>de Courcey, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+primary+human+nasal+epithelial+cell+cultures+for+the+study+of+cystic+fibrosis+pathophysiology.">Development of primary human nasal epithelial cell cultures for the study of cystic fibrosis pathophysiology.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 303 (11), 1173-1179 (2012).</li><li>Gruenert, D. C., Basbaum, C. B., Widdicombe, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+normal+and+cystic+fibrosis+epithelial+cells+grown+under+serum-free+conditions.">Long-term culture of normal and cystic fibrosis epithelial cells grown under serum-free conditions.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. 26 (4), 411-418 (1990).</li><li>Mosler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feasibility+of+nasal+epithelial+brushing+for+the+study+of+airway+epithelial+functions+in+CF+infants.">Feasibility of nasal epithelial brushing for the study of airway epithelial functions in CF infants.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 7 (1), 44-53 (2008).</li><li>Anderson, J. D., Liu, Z., Odom, L. V., Kersh, L., Guimbellot, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFTR+function+and+clinical+response+to+modulators+parallel+nasal+epithelial+organoid+swelling.">CFTR function and clinical response to modulators parallel nasal epithelial organoid swelling.</a> The American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 321 (1), 119-129 (2021).</li><li>Guimbellot, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasospheroids+permit+measurements+of+CFTR-dependent+fluid+transport.">Nasospheroids permit measurements of CFTR-dependent fluid transport.</a> JCI Insight. 2 (22), (2017).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+nasal+epithelial+organoids+for+therapeutic+development+in+cystic+fibrosis.">Human nasal epithelial organoids for therapeutic development in cystic fibrosis.</a> Genes (Basel). 11 (6), (2020).</li><li>Muller, L., Brighton, L. E., Carson, J. L., Fischer, W. A., Jaspers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+of+human+nasal+epithelial+cells+at+the+air+liquid+interface.">Culturing of human nasal epithelial cells at the air liquid interface.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2013).</li><li>Dekkers, J. F., vander Ent, C. K., Beekman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+opportunities+for+CFTR-targeting+drug+development+using+organoids.">Novel opportunities for CFTR-targeting drug development using organoids.</a> Rare Diseases. 1, 27112 (2013).</li><li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+CFTR+assay+using+primary+cystic+fibrosis+intestinal+organoids.">A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids.</a> Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).</li><li>Okiyoneda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism-based+corrector+combination+restores+DeltaF508-CFTR+folding+and+function.">Mechanism-based corrector combination restores DeltaF508-CFTR folding and function.</a> Nature Chemical Biology. 9 (7), 444-454 (2013).</li><li>Schwank, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+repair+of+CFTR+by+CRISPR/Cas9+in+intestinal+stem+cell+organoids+of+cystic+fibrosis+patients.">Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients.</a> Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).</li><li>Geurts, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-based+adenine+editors+correct+nonsense+mutations+in+a+cystic+fibrosis+organoid+biobank.">CRISPR-based adenine editors correct nonsense mutations in a cystic fibrosis organoid biobank.</a> Cell Stem Cell. 26 (4), 503-510 (2020).</li><li>Bove, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+in+vitro+alveolar+type+II+cell+proliferation+barrier+while+retaining+ion+transport+properties.">Breaking the in vitro alveolar type II cell proliferation barrier while retaining ion transport properties.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (4), 767-776 (2014).</li><li>Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+keratinocytes+are+efficiently+immortalized+by+a+Rho+kinase+inhibitor.">Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor.</a> Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2619-2626 (2010).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK+inhibitor+and+feeder+cells+induce+the+conditional+reprogramming+of+epithelial+cells.">ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells.</a> The American Journal of Pathology. 180 (2), 599-607 (2012).</li><li>Palechor-Ceron, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation+induces+diffusible+feeder+cell+factor(s)+that+cooperate+with+ROCK+inhibitor+to+conditionally+reprogram+and+immortalize+epithelial+cells.">Radiation induces diffusible feeder cell factor(s) that cooperate with ROCK inhibitor to conditionally reprogram and immortalize epithelial cells.</a> The American Journal of Pathology. 183 (6), 1862-1870 (2013).</li><li>Scudieri, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionocytes+and+CFTR+chloride+channel+expression+in+normal+and+cystic+fibrosis+nasal+and+bronchial+epithelial+cells.">Ionocytes and CFTR chloride channel expression in normal and cystic fibrosis nasal and bronchial epithelial cells.</a> Cells. 9 (9), (2020).</li><li>Marthin, J. K., Stevens, E. M., Larsen, L. A., Christensen, S. T., Nielsen, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+three-dimensional+explant+spheroids+derived+from+human+nasal+airway+epithelium:+a+simple+methodological+approach+for+ex+vivo+studies+of+primary+ciliary+dyskinesia.">Patient-specific three-dimensional explant spheroids derived from human nasal airway epithelium: a simple methodological approach for ex vivo studies of primary ciliary dyskinesia.</a> Cilia. 6, 3 (2017).</li><li>Blouquit, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+and+fluid+transport+properties+of+small+airways+in+cystic+fibrosis.">Ion and fluid transport properties of small airways in cystic fibrosis.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 174 (3), 299-305 (2006).</li><li>Birket, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+therapy+with+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+modulators+augment+the+airway+functional+microanatomy.">Combination therapy with cystic fibrosis transmembrane conductance regulator modulators augment the airway functional microanatomy.</a> The American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 310 (10), 928-939 (2016).</li><li>Birket, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+anatomic+defect+of+the+cystic+fibrosis+airway.">A functional anatomic defect of the cystic fibrosis airway.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 190 (4), 421-432 (2014).</li><li>Chu, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle-tracking+microrheology+using+micro-optical+coherence+tomography.">Particle-tracking microrheology using micro-optical coherence tomography.</a> Biophysical Journal. 111 (5), 1053-1063 (2016).</li><li>Chu, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.+In+vivo+imaging+of+airway+cilia+and+mucus+clearance+with+micro-optical+coherence+tomography.">et al. In vivo imaging of airway cilia and mucus clearance with micro-optical coherence tomography.</a> Biomedical Optics Express. 7 (7), 2494-2505 (2016).</li><li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+quantitative+study+of+airway+functional+microanatomy+using+micro-optical+coherence+tomography.">Method for quantitative study of airway functional microanatomy using micro-optical coherence tomography.</a> PLoS One. 8 (1), 54473 (2013).</li><li>Tuggle, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+defects+in+ion+transport+and+tissue+development+in+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+(CFTR)-knockout+rats.">Characterization of defects in ion transport and tissue development in cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-knockout rats.</a> PLoS One. 9 (3), 91253 (2014).</li><li>McCravy, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalised+medicine+for+non-classic+cystic+fibrosis+resulting+from+rare+CFTR+mutations.">Personalised medicine for non-classic cystic fibrosis resulting from rare CFTR mutations.</a> European Respiratory Journal. 56 (1), 2000062 (2020).</li><li>Mutyam, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+benefit+observed+with+the+CFTR+potentiator,+ivacaftor,+in+a+CF+patient+homozygous+for+the+W1282X+CFTR+nonsense+mutation.">Therapeutic benefit observed with the CFTR potentiator, ivacaftor, in a CF patient homozygous for the W1282X CFTR nonsense mutation.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 16 (1), 24-29 (2017).</li><li>Corning Inc. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> CORNING CELL-TAK CELL AND TISSUE ADHESIVE. , (2013).</li><li>Anderson, J. D., Liu, Z., Odom, L. V., Kersh, L., Guimbellot, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFTR+function+and+clinical+response+to+modulators+parallel+nasal+epithelial+organoid+swelling.">CFTR function and clinical response to modulators parallel nasal epithelial organoid swelling.</a> The American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 321 (1), 119-129 (2021).</li><li>Biotek Instruments, Incorporated. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Lionheart FX Live Cell Imager Operator's Manual. , (2016).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Simmonds, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+it+cystic+fibrosis?+The+challenges+of+diagnosing+cystic+fibrosis.">Is it cystic fibrosis? The challenges of diagnosing cystic fibrosis.</a> Paediatric Respiratory Reviews. 31, 6-8 (2019).</li><li>McGarry, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+and+in+vitro+ivacaftor+response+in+cystic+fibrosis+patients+with+residual+CFTR+function:+N-of-1+studies.">In vivo and in vitro ivacaftor response in cystic fibrosis patients with residual CFTR function: N-of-1 studies.</a> Pediatric Pulmonology. 52 (4), 472-479 (2017).</li><li>Garratt, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+culture+success+in+an+airway+epithelium+sampling+program+of+young+children+with+cystic+fibrosis.">Determinants of culture success in an airway epithelium sampling program of young children with cystic fibrosis.</a> Experimental Lung Research. 40 (9), 447-459 (2014).</li></ol>

Bu yazıda, HNE fırça biyopsisinden türetilen hava yolu epitel organoidlerinin kapsamlı canlı ve sabit görüntülenmesi için ayrıntılı metodolojiler sunulmaktadır. Bir bireyde CFTR aktivitesini belirleyebilen fonksiyonel testleri tanımlar. HNE'ler, çeşitli uygulamalar için minimal invaziv, birincil doku sağlar. Burada sunulan genişleme teknikleri, organoidler de dahil olmak üzere hava yolu hastalıklarını modellemek için kullanılabilir. Organoidler, hassas terapötik yaklaşımlar için ve zaman iç...

Tekniğe giriş Ex vivo kültür temelli tahliller, hassas tıp ve hastalık patofizyolojisinin incelenmesi için giderek daha fazla kullanılan bir araçtır. Primer insan nazal epitel (HNE) hücre kültürü, kistik fibroz 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 ile ilgili çok sayıda çalışmada kullanılmıştır. , birden fazla organda epitel hücre fonksiyonunu etkileyen otozomal resesif geçişli bir hastalıktır. HNE kültürü, prospektif olarak elde edilebilen yenilenebilir bir hava yolu epitelisi kaynağı sağlar ve Kistik Fibroz Transmembran iletkenlik Regülatörü (CFTR) aktivitesini test etmek için elektrofizyolojik ve biyokimyasal nitelikleri özetler. HNE hücreleri, yaygın viral solunum yolu çubuklarına benzer şekilde minimal yan etki14 ile örneklenebilir. HNE fırça biyopsilerinden türetilen kistik fibroz çalışması için bir model tanımlayan araştırma çalışması yakın zamanda yayınlanmıştır11,13. Primer HNE 2,3 ve bağırsak dokusu 15,16,17,18,19 kullanan diğer modellere benzer olmakla birlikte, bu modelin farklılaşmasının ve görüntülenmesinin ayrıntılı karakterizasyonu, KF araştırmalarında kullanılmak ve diğer hava yolu hastalıklarının çalışmalarına yardımcı olmak için burada açıklanmıştır 13 . Organoid model, ölümsüzleştirilmiş hücre hatları gibi sınırsız değildir, ancak koşullu yeniden programlama (ışınlanmış ve inaktive edilmiş besleyici fibroblastlar ve Rho-kinaz inhibitörleri kullanılarak) ile daha kök hücre benzeri bir durumagenişletilebilir 20,21,22,23. HNE fırça biyopsilerinin bu yöntem kullanılarak işlenmesi, birden fazla uygulamada kullanılmak üzere çok sayıda epitel hücresinin daha yüksek verimde olmasını sağlarken, yine de tam olarak ayırt etme yeteneğini korur. Bu protokol besleyici hücreler kullanılarak geliştirilmiş olsa da, besleyici hücre teknolojisinden kaçınmak isteyen araştırmacılar tarafından başka metodolojiler de kullanılabilir14,24.
Tekniğin pulmoner biyolojideki önemi Epitel hücrelerinin hücre zarında düzenli, işleyen CFTR'nin yokluğunun akciğerlerde, pankreasta, karaciğerde, bağırsakta veya diğer dokularda nasıl işlev bozukluğuna neden olduğunu anlamak için önemli bir çalışma yapılmıştır. Disfonksiyonel epitel iyon transportu, özellikle klorür ve bikarbonat, epitel astar sıvılarının hacminin azalmasına ve mukoza sekresyonlarında değişikliklere neden olarak mukoza stazı ve tıkanıklığına neden olur. Primer siliyer diskinezi gibi diğer hava yolu hastalıklarında, değişmiş siliyer hareket mukosiliyer klirensi bozar ve mukoza stazı ve obstrüksiyona yol açar25. Bu nedenle, mevcut HNE organoid modeli, araştırmacının deneysel tasarımına ve kaynaklarına bağlı olarak çeşitli uygulamalar için geliştirilmiştir. Bu, canlı hücre boyaları kullanarak canlı hücre görüntülemeyi içerir; morfolojiyi karakterize etmek için sabitleme ve bölümleme; intraluminal yapıların bozulmasını önlemek için antikorlarla immünofloresan boyama ve tam montajlı konfokal görüntüleme; siliyer atım sıklığı ve mukosiliyer transportun kantitatif ölçümleri için parlak alan görüntüleme ve mikro-optik koherens tomografi13. Diğer araştırmacılara genişlemeyi kolaylaştırmak için, ticari olarak temin edilebilen reaktifler ve malzemeler kültürleme için kullanılmıştır. Ortak mikroskop teknikleri ve daha özel ekipman kullanan fonksiyonel bir tahlil geliştirilmiştir. Genel olarak, mevcut model CFTR aktivitesini başlangıçta veya terapötiklere yanıt olarak değerlendirmek için tasarlanmış olsa da, bu protokolde açıklanan teknikler epitel hücre fonksiyonunu içeren diğer hastalıklara, özellikle epitel hücre sıvısı taşınımına uygulanabilir.
Diğer metodolojilerle karşılaştırma Son zamanlarda bu organoid modelin yararlılığı, hastaların organoidlerinin in vitro CFTR modülatör yanıtlarını klinik yanıtlarıyla ilişkilendirerek geliştirilmiştir11. Özellikle, mevcut modelin aynı hastalarda CFTR fonksiyonunu değerlendirmek için mevcut altın standart olan kısa devre akım tepkilerine paralel olduğu da gösterilmiştir. Kısa devre akımı, şişme tahlilinden farklıdır, çünkü birincisi, iyon taşıma26 yoluyla CFTR fonksiyonunu ölçer. Buna karşılık, bu tahlil sıvı taşınması ile daha aşağı yönlü bir etkiyi ölçer ve CFTR27,28,29,30,31,32'nin genel işlevi hakkında ek bilgi sağlar. Kısa devre akım ölçümleri, CFTR klorür kanal aktivitesini belirlemek için yaygın ve güvenilir bir yöntem olmaya devam etmiştir 1,33. Bu elektrofizyolojik analizler özel, pahalı ekipman gerektirir, her deneysel kopya için organoid testten çok daha fazla hücre gerektirir, kolayca otomatikleştirilemez ve daha yüksek verim uygulamaları için ölçeklendirmeye uygun değildir. Bağırsak epitelinden türetilen başka bir organoid model, daha mükemmel replikatif yetenek gibi ek avantajlara sahiptir 15,16,17,18, ancak ne bir hava yolu dokusundan türetilir ne de evrensel olarak mevcuttur. HNE fırçalamaları, ucuz sitoloji fırçaları ile sedasyona gerek kalmadan ve minimum risk altında elde edilir. Fırçalama yaptırmak bir klinisyen gerektirmez ve eğitimli araştırma koordinatörleri ve diğer araştırma personeli tarafından yapılabilir14. HNE organoid modeli, primer hücre kültürü yeteneklerine sahip herhangi bir laboratuvar tarafından kültürlenebilir ve bazı uygulamalar standart mikroskopi teknikleri ile gerçekleştirilebilir. Toplamda, bu avantajlar, aksi takdirde bazı laboratuvarlarda kullanılamayan hava yolu epitel fonksiyonunu değerlendirmek için teknolojiye ek erişim sağlar. Ayrıca, HNE organoidleri, bağırsak organoidlerinin yapamayacağı primer siliyer diskinezi25 veya viral enfeksiyon gibi hava yolunu etkileyen diğer hastalık durumlarını incelemek için kullanılabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Nasal brush</td>
			<td>Medical Packaging CYB1</td>
			<td>CYB-1</td>
			<td>Length: 8 inches, width approximately 7 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large-Orifice Pipette Tips</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>02-707-141</td>
			<td>Large bore pipette tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>Cell detachment solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% trypsin -EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor from soybean</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6522</td>
			<td>Working solution: 1mg/mL in 1XDPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356255</td>
			<td>Extracellular matrix (EM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide Angiogenesis</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81506</td>
			<td>15-well slide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-Well Transwell</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7200154</td>
			<td>Culture insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chambered Coverglass</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>155409</td>
			<td>8-well glass-bottom chamber slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>354240</td>
			<td>Cell adhesive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>50980487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A16046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucBlue</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>R37605</td>
			<td>DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ts2-FL (Inverted Routine Microscope)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Inverted epi-fluorescence microscope or bright-field microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R-HD25</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements- Basic Research</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>manual imaging analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histogel</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Base Molds</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>41-740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lionheart FX</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BTLFX</td>
			<td>Automated image system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lionheart Cover</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1450009</td>
			<td>Environmental Control Lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity Chamber</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1450006</td>
			<td>Stage insert (environmental chamber)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Controller for CO2 and O2</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1210013</td>
			<td>Gas controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate/Slide Stage Insert</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1450527</td>
			<td>Slide holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5 Imaging Prime Software</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BTGEN5IPRIM</td>
			<td>Automated imaging analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x Phase Contrast Objective</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1320515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Phase Contrast Objective</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1320516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED Cube</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1225007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Cube (DAPI)</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BT1225100</td>
			<td>DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFTRinh-172</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S7139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBMX</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expansion Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12 Nutrient mix</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;16140-071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;15-140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;C8052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;PHG0314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone (HC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;H0888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;A2786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>&#160;04-0012-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceftazidime</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>&#160;J66460-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tobramycin</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>&#160;J67340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vancomycin</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>&#160;J67251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Differentiation Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 (1:1)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;11330-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultroser-G</td>
			<td>Pall</td>
			<td>&#160;15950-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Clone II</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>&#160;SH30066.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Brain Extract</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>&#160;CC-4098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;I-9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;H-0888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triiodothyronine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;T-6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;T-0665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanolamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;E-0135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epinephrine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-4250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-Phosphorylethanolamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R-2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human CFTR antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB1660</td>
			<td>Dilution: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZO-1 antibody</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>MA3-39100-A647</td>
			<td>Dilution: 1000x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MUC5B antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HPA008246</td>
			<td>Dilution: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-acetylated tubulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7451</td>
			<td>Dilution: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-beta IV Tubulin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab11315</td>
			<td>Dilution: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21202</td>
			<td>Dilution: 2000x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21207</td>
			<td>Dilution: 2000x</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture and imaging of human nasal epithelial organoids

Kistik fibrozis (KF) hastaları için bireyselleştirilmiş tedavi, küçük moleküllü bileşiklerden temel Kistik Fibrozis Transmembran iletkenlik Regülatörü (CFTR) aktivitesini ve restorasyonunu anlamak için in vitro bir hastalık modeli ile sağlanabilir. Grubumuz son zamanlarda doğrudan birincil insan burun epitel hücrelerinden (HNE) türetilen iyi diferansiye bir organoid model oluşturmaya odaklandı. Kesitli organoidlerin histolojisi, tam montajlı immünofloresan boyama ve görüntüleme (konfokal mikroskopi, immünofloresan mikroskopi ve parlak alan kullanılarak), organoidleri karakterize etmek ve fonksiyonel testlere hazırlanırken epitel farklılaşmasını doğrulamak için gereklidir. Ayrıca, HNE organoidleri, CF ve CF olmayan organoidler arasında ayrım yaparak, CFTR aktivitesi ile ilişkili farklı boyutlarda lümenler üretir. Bu makalede, HNE organoidlerinin kültürlenmesi için metodoloji, bazal lümen alanının ölçümü (mikroskoplu herhangi bir laboratuvarın kullanabileceği organoidlerde CFTR aktivitesi ölçümü yöntemi) ve fonksiyonel bir tahlil için geliştirilmiş otomatik yaklaşım (daha özel ekipman gerektiren) dahil olmak üzere görüntüleme modaliteleri kullanılarak farklılaşmanın değerlendirilmesine odaklanarak ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.

HNE'lerin genişlemesi, gelişen bir organoid kültür için gereklidir. Başarılı bir numune koleksiyonundan elde edilen HNE'ler, 10 gün içinde %70'in üzerinde bir birleşime kadar genişlemelidir. Başarılı ve başarısız örneklere bir örnek sırasıyla Şekil 1A ve Şekil 1B'de gösterilmiştir. Hücreler, ışınlanmış 3T3 hücrelerle ko-kültürden 14 gün sonra% 70 birleşmeye ulaşamazlarsa atılmalıdır. Kirlenmiş herhangi ...

Watch this Scientific Journal Video about Culture and Imaging of Human Nasal Epithelial Organoids at JoVE.com

Culture and Imaging of Human Nasal Epithelial Organoids

Burada insan burun epitel hücrelerinden in vitro organoid modeli tanımlamak için ayrıntılı bir protokol sunulmuştur. Protokol, standart laboratuvar ekipmanı gerektiren ölçümler için seçeneklere ve özel ekipman ve yazılımlar için ek olanaklara sahiptir.

İnsan Nazal Epitel Organoidlerinin Kültürü ve Görüntülenmesi

Individualized therapy for cystic fibrosis (CF) patients can be achieved with an in vitro disease model to understand baseline Cystic Fibrosis ...

Kistik fibrozis hastaları için bireyselleştirilmiş tedavi, CFTR aktivitesini başlangıçta anlamak için in vitro hastalık modeli ile sağlanabilir. İnsan nazal epitelyal organoidleri veya HNE organoidleri, CFTR aktivitesi ile ilişkili çeşitli boyutlarda lümenler üretir ve CF ve CF olmayan organoidleri ayırt eder. Burada, bu HNE organoidlerinin kültürlenmesi ve görüntülenmesi için bir metodolojiyi ayrıntılı olarak tanımladık.İşlevsel olmayan epitel iyon taşınması, özellikle klorür ve bikarbonat, epitel astar sıvılarının hacminin azalmasına neden olur. Bu aynı zamanda mukostaz ve obstrüksiyona yol açan mukus sekresyonlarını da etkiler. Bu nedenle, HNE modelimiz, araştırmacının deneysel tasarımına ve kaynaklarına bağlı olarak çeşitli uygulamalar için geliştirilmiştir.CFTR aktivitesini başlangıçta veya terapötiklere yanıt olarak değerlendirmenin yanı sıra, bu teknik epitel hücre fonksiyonunu içeren diğer hastalıklara, özellikle epitel hücre sıvısı taşınımına da uygulanabilir. Bu yöntemler öncelikle kistik fibroz çalışmalarında kullanılmak üzere geliştirilmiştir. Primer siliyer diskinezi gibi hava yolu epitelini değerlendiren diğer çalışmalar da bu yöntemleri yararlı bulabilir.Bu teknikler detaylara ve hassasiyete dikkat etmeyi gerektirir. Ayrıca, hücrelerin ilk genişlemesinin uygun olduğundan emin olmak için dikkatli bir gözlem gerektirirler. Tüm kültürleri her gün izleyin ve başarı daha muhtemel olacaktır.Başlamak için, burun fırçası biyopsisini, sitoloji fırçasını bir mililitrelik büyük delikli pipet ucundan birkaç kez geçirerek 15 mililitrelik bir konik tüp içinde 8 militer RPMI ortamına ayırın. Hücreleri dört santigrat derecede beş dakika boyunca 500 kez g'de santrifüj edin. Süpernatantı atın ve ardından hücre peletini üç mililitre hücre ayrılma çözeltisi içinde yeniden askıya alın.Sindirmek için oda sıcaklığında 16 dakika inkübe edin. Hücreleri iki kez yıkamak için beş mililitre genleşme ortamı kullanın. Ardından, ışınlanmış, inaktive edilmiş ve% 50 ila% 60 akıcı 3T3 fibroblastları ile önceden tohumlanmış bir T75 şişesine ekleyin.Hücrelerin 7 ila 14 gün boyunca genişleme ortamında birlikte kültürlenmesine ve genişlemesine izin verin. Kistik fibrozlu hastalardan elde edilen hücreler için antibiyotikler kullanılmışsa, ilk üç günlük kültürden sonra ortam antibiyotiksiz genişleme ortamı ile değiştirilmelidir ve% 80 birleşene kadar her iki günde bir ortam değiştirmeye devam edebilir. Hücreleri 1x DPBS ile yıkayın.Daha sonra, T75 şişesine 1.5 mililitre% 0.05 tripsin-EDTA ekleyin ve ışınlanmış ve inaktive edilmiş 3T3 fibroblastını kültürden çıkarmak için 37 santigrat derecede dört dakika inkübe edin. Kalan 3T3 fibroblastlarını iyice yıkamak için T75 şişesini 1x DPBS ile iki kez durulayın. T75 şişesine 1,5 mililitre% 0,05 tripsin-EDTA ekleyin ve HNE'leri ayırmak için 37 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin.Tripsini soya fasulyesi tripsin inhibitörü ile bire bir oranında nötralize edin. Hücreleri beş dakika boyunca 500 kez gi'de santrifüj edin. Ardından, süpernatantı atın ve hücreleri bir kez beş mililitre genleşme ortamı ile yıkayın.Hücreler artık organoidleri büyütmek için tohumlamaya hazırdır. Organoid kültür hücre dışı matrisini veya ECM'yi gece boyunca dört santigrat derecede çözün. 15 kuyucuklu anjiyogenez slaytlarını gece boyunca aynı sıcaklıkta soğutun.Ardından, pipet uçlarını dört santigrat dereceye kadar soğutun. Kızakları buz üzerinde beş mikrolitre soğuk% 100 ECM ile kaplayın. Konsolidasyon için en az 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede bir hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin.Bir hemositometre kullanarak ko-kültürden toplanan HNE'leri sayın. Daha sonra, hücreleri toplam sayıda mikrolitre başına 500 hücreye seyreltin,% 20 ECM buz üzerindeki farklılaşma ortamı ile seyreltilir. ECM kaplı kızakları inkübatörden çıkarın ve soğuk hücre ECM karışımının beş mikrolitresini kuyucukların her birine tohumlayın.Hücre ECM karışımını birleştirmek için slaytları derhal 37 santigrat derecede bir kültür inkübatörüne bir saat boyunca aktarın. Bundan sonra, slaytları inkübatörden çıkarın ve hücreleri, 50 mikrolitre farklılaşma ortamı ile 15 kuyucuklu anjiyogenez slaytlarının her bir kuyucuğuna besleyin. Slaytı 37 santigrat derecede kültür inkübatörüne geri döndürün, organoidler daha fazla deney için hazır olana kadar medyayı her gün değiştirin.8 delikli cam tabanlı hazne kızaklarına hücre yapıştırıcısı ile 30 dakika boyunca ön işlem yapın. Çözeltiyi atın ve kuyucukları 30 dakika daha havayla kurulayın. Ardından, ortamı ECM'nin üstünden atın ve ardından buz üzerindeki 15 kuyucuklu kızakların her bir kuyucuğuna 50 mikrolitre soğuk 1x PBS ekleyin.Büyük delikli pipet ucunun 200 mikrolitresini kullanarak üç ila beş kez yukarı ve aşağı pipet alın. Çözeltiyi, 8 delikli oda kızaklarının bir kuyusunun ortasına dağıtın. Fazla sıvıyı hemen kuyucuklardan ince uçlu bir pipetle çıkarın.Ardından, cam tabana yapışan organoidi arttırmak için odayı 40 dakika boyunca 37 santigrat derecelik bir inkübatöre yerleştirin. 40 dakika sonra, organoidleri iki kez 1x PBS ile nazikçe yıkayın ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca her bir kuyucukta 300 mikrolitre% 4 paraformaldehit ile sabitleyin. 1x PBS ile iki kez yıkayın ve organoidleri iki haftaya kadar immün boyama için dört santigrat derece ayarlanmış 1x PBS'de saklayın.Histolojik çalışmalar için organoidleri toplamak için, medyayı kültürden çıkarın ve buz üzerindeki slaytların her bir kuyucuğuna 50 mikrolitre soğuk bir 1x PBS ekleyin. 200 mikrolitrelik büyük delikli pipet ucu kullanarak üç ila beş kez yukarı ve aşağı pipet alın. 15 delikli sürgü veya kültür eklerindeki tüm çözeltileri buz üzerinde 15 mililitrelik konik bir tüpte birleştirin.Soğuk 1x PBS ekleyerek tüpteki toplam çözelti hacmini 10 mililitreye ayarlayın. Tüpü dört santigrat derecede, beş dakika boyunca 300 kez g'de santrifüj yapın. Daha sonra, süpernatantı aspire edin ve 200 mikrolitrelik büyük delikli pipet ucu kullanarak organoid pelet ile karıştırmak için 60 mikrolitre ılık histojel ekleyin.Süspansiyonu hemen bir histoloji kalıbına aktarın. Histojeli oda sıcaklığında birleştirdikten sonra, kalıp bloğunu gece boyunca dört santigrat derecede sabitlemek için% 4 paraformaldehit içine koyun. Yazılımı açın ve ekranın altına sağ tıklayın.Ardından, Analiz Kontrolleri'ni ve ardından Otomatik Ölçüm Sonuçları'nı seçin. Organoid görüntüyü açın ve görünür lümenli 5 ila 10 organoid seçin. Menüyü açmak için resme sağ tıklayın ve organoidin toplam yüzey alanını elde etmek üzere tam organoidi özetlemek için Poligonal YG'yi seçin.Ardından, lümen alanını elde etmek için lümeni ana hatlarıyla belirtin. Bunu kuyudaki kalan organoidler ve tahlildeki tüm kuyular için tekrarlayın. Son olarak, verileri Excel'e aktarın.Lümen alanını toplam yüzey alanına bölün ve Temel Lümen Oranını elde etmek için numunedeki tüm organoidlerin ortalamasını alın. Parlak alan görüntüleri, başarılı ve başarısız bir numune koleksiyonundan HNE'leri temsil eder. HNE'ler büyük bir kümede iyi büyür.Buna karşılık, HNE'ler ışınlanmış 3T3 hücrelerini çevreleyen iki küçük kümede zayıf büyür. 15 delikli slayttaki organoidler, kültür ekindekilerden daha hassas ve keskin görüntülere sahiptir. Bunun yanı sıra bu iki kültür yönteminde anlamlı bir morfolojik farklılık gözlenmedi.CF olmayan organoidler tipik olarak CF organoidlerinden daha büyük bir lümene ve daha sıvıya sahiptir. CF olmayan, F508del/F508del deneğinden organoidlerde HNE boyaması ve bir organoiddeki kirpiklerin immünofloresan boyanması bu görüntülerde gösterilmiştir. Asetile tübülin ile boyanmış kirpikler, FITC etiketli sekonder antikor ve DAPI ile etiketlenmiş çekirdekler burada gösterilmiştir.İki temsili organoidin tam montajlı immünofloresan boyama ile maksimum projeksiyon görüntüleri ve bunlara karşılık gelen üç boyutlu rekonstrüksiyon görüntüleri burada gösterilmiştir. Organoidlerin lümeni içindeki mukus ve kirpikler gösterilmiştir. Grafik görüntüler, primer nazal epitel hücrelerinde CFTR fonksiyonunu test etmek için forskolin kaynaklı şişlik testini temsil eder.Burada KF olmayan gönüllülerin temsili bir forskolin doz-yanıt deneyi gösterilmektedir. FSK doz-yanıtı, sekiz saate kıyasla bir saatteki ortalama fraksiyonel değişimle karşılaştırılır, bu da sekiz saatlik tahlilin farklı FSK dozları arasında bir saattekilerden daha önemli bir şişme farkı üretebileceğini düşündürmektedir. Eğrinin altındaki alan, sekiz saatte ortalama fraksiyonel değişime kıyasla şişmede küçük bir fark gösterebilir.Bu prosedürü denerken, toplama, sabitleme ve boyama işlemi sırasında organoidlerin kaybolacağını unutmayın. Bu nedenle, her adımda titizlikle dikkat edilmeli ve başarıyı sağlamak için yeterli başlangıç sayıları alınmalıdır. Kültür eklerinde büyüyen organoidler, bu teknikler geliştirildiği için bu konuda yardımcı olabilir.Burada, diğer araştırmacılara genişlemeyi kolaylaştırmak için ticari olarak temin edilebilen reaktifleri ve malzemeleri kullandık. Ortak mikroskop teknikleri ve daha özel ekipman kullanan fonksiyonel bir tahlil de geliştirilmiştir.

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

İnsan Fetal Pankreas Hücre Kümeleri İzolasyon, Kültür ve Görüntüleme

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

Primary Culture of Human Vestibular Schwannomas

İnsan Vestibüler Schwannomalar İlköğretim Kültürü

Vestibular schwannomas (VSs) represent Schwann cell (SC) tumors of the vestibular nerve, compromising 10% of all intracranial neoplasms. VSs occur in ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

İzolasyon, Kriyoprezervasyon ve Kültür Klinik Uygulamaları İnsan Amniyon Epitel Hücreleri

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Establishment of Human Epithelial Enteroids and Colonoids from Whole Tissue and Biopsy

Tüm Doku ve Biyopsi İnsan Epitelyal Enteroids ve Colonoids kurulması

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem ...

Absorption of Nasal and Bronchial Fluids: Precision Sampling of the Human Respiratory Mucosa and Laboratory Processing of Samples

Burun ve bronş sıvıları emilimini: hassas örnekleme insan solunum mukoza ve laboratuvar işleme örnekleri

The methods of nasal absorption (NA) and bronchial absorption (BA) use synthetic absorptive matrices (SAM) to absorb the mucosal lining fluid (MLF) of the ...

Standardized Measurement of Nasal Membrane Transepithelial Potential Difference (NPD)

Standardized Measurement of Nasal Membrane Transepithelial Potential Difference NPD

Burun membran Transepithelial potansiyel farkının (NPD) standart ölçüm

We describe a standardized measurement of nasal potential difference (NPD). In this technique, cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) ...

Generation of Human Nasal Epithelial Cell Spheroids for Individualized Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Study

İnsan nazal epitel hücre pulcuklarının nesil bireyselleştirilmiş Kistik fibrozis transmembran gürültülerinden regülatör çalışma için

While the introduction of Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) modulator drugs has revolutionized care in Cystic Fibrosis (CF), the ...

Muscle Imbalances: Testing and Training Functional Eccentric Hamstring Strength in Athletic Populations

Kas dengesizlikleri: Test ve fonksiyonel eksantrik Hamstring gücü atletik nüfus eğitim

Many hamstring injuries that occur during physical activity occur while the muscles are lengthening, during eccentric hamstring muscle actions. Opposite ...

Quantitative Mapping of Specific Ventilation in the Human Lung using Proton Magnetic Resonance Imaging and Oxygen as a Contrast Agent

Proton manyetik rezonans görüntüleme ve oksijen kontrast ajan olarak kullanarak ınsan akciğerinde spesifik havalandırma niceliksel haritalama

Specific ventilation imaging (SVI) is a functional magnetic resonance imaging technique capable of quantifying specific ventilation &#8213; the ratio of ...