Name: direct and indirect culture methods for studying biodegradable implant materials in vitro
Uploaded: 2022-04-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct and Indirect Culture Methods for Studying Biodegradable Implant Materials In Vitro at JoVE.com

Авторы высоко оценивают финансовую поддержку со стороны Национального научного фонда США (NSF CBET award 1512764 и NSF PIRE 1545852), Национальных институтов здравоохранения (NIH NIDCR 1R03DE028631), стипендии регентов Калифорнийского университета (UC) и Комитета по исследовательскому гранту семян (Huinan Liu) и гранта UC-Riverside Dissertation Research Grant (Jiajia Lin). Авторы высоко оценивают Центральный центр передовой микроскопии и микроанализа (CFAMM) в Калифорнийском университете в Риверсайде за использование SEM / EDS и доктора Перри Чунга за использование инструментов XRD. Авторы также ценят Thanh Vy Nguyen и Queenie Xu за частичное редактирование. Авторы также хотели бы поблагодарить Синди Ли за запись повествования для видео. Любые мнения, выводы и выводы, выраженные в этой статье, являются мнениями авторов и не обязательно отражают взгляды Национального научного фонда или Национальных институтов здравоохранения.

Этот протокол был одобрен Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Калифорнийском университете в Риверсайде (UCR) для сбора клеток и тканей. 12-недельная самка крысы Sprague-Dawley (SD) показана в качестве примера в видео. Предпочтение отдается более молодым сам?...

Различные методы культивирования клеток могут быть использованы для оценки цитосовместимости биоматериалов in vitro , представляющих интерес для различных аспектов применения in vivo. В этой статье демонстрируются три метода культивирования in vitro , то есть прямая культура, ку?...

На протяжении десятилетий биоразлагаемые материалы широко изучались и использовались в биомедицинских приложениях, таких как ортопедические1,2, стоматологические3,4 и черепно-челюстно-лицевые5. В отличие от постоянных имплантатов и материалов, биоразлагаемые металлы, керамика, полимеры и их композиты постепенно разлагаются в организме с течением времени в результате различных химических реакций в физиологической среде. Например, биоразлагаемые металлы, такие как магниевые (Mg) сплавы1,6,7 и цинковые (Zn) сплавы8,9, являются перспективными материалами для устройств фиксации кости. Их биоразлагаемость может устранить необходимость вторичных операций по удалению имплантатов после заживления кости. Биоразлагаемая керамика, такая как цементы фосфата кальция (CPC), показала захватывающий потенциал для лечения остеопоротических компрессионных переломов позвонков при чрескожной кифопластике10. ЦПК обеспечивают механическую поддержку сломанного тела позвонка и постепенно деградируют после заживления перелома.
Биоразлагаемые полимеры, такие как некоторые полисахариды и полиэфиры, также широко исследовались для биомедицинских применений. Например, гидрогель хитозана как биоразлагаемый полисахарид продемонстрировал свои способности предотвращать инфекцию и регенерировать ткани кожи11. Поли-L-молочная кислота (PLLA), поли(гликолевая кислота) (PGA) и поли(молочная-со-гликолевая кислота) (PLGA) являются широко изученными полиэфирами для изготовления 2D или 3D пористых каркасов для тканевой инженерии12,13,14. Кроме того, композиционные материалы объединяют две или более фаз металлов, керамики и полимеров, чтобы обеспечить расширенные функции для широкого спектра биомедицинских применений15,16,17. Например, композиты PLGA и фосфата кальция могут быть использованы для изготовления биоразлагаемых каркасов для таких применений, как восстановление дефектов костей черепа18. Эти биоразлагаемые каркасы и имплантаты могут поддерживать и стимулировать рост клеток и тканей, а затем постепенно разлагаться в организме с течением времени.
Как показано в Дополнительной таблице 1, различные биоразлагаемые материалы могут иметь различные механизмы деградации, продукты и скорости. Например, магниевые сплавы, такие как Mg-2 мас.% Zn-0,5 мас.% Ca (ZC21)1, Mg-4 мас.% Zn-1 мас.% Sr (ZSr41)19 и Mg-9 мас.% Al-1 мас.% цинка (AZ91)20, разлагаются в результате взаимодействия с водой, и их продукты деградации в основном включают ионы Mg2+, OH-ионы, газ H2 и минеральные осаждения. Скорость деградации биоразлагаемых металлов варьируется в зависимости от их различного состава, геометрии и среды деградации. Например, Cipriano et al.19 сообщили, что провода ZSr41 (Ø1,1 × 15 мм) потеряли 85% массы, в то время как чистые провода Mg с той же геометрией потеряли 40% массы после имплантации в большеберцовую кость крысы в течение 47 дней. Биоразлагаемые керамические материалы, такие как гидроксиапатит (ГК) и β-трикальцийфосфат (β-TCP), могут разлагаться через внеклеточное растворение жидкости или распадаться на мелкие частицы, а затем разлагаться как через внеклеточное жидкое растворение, так и через процессы резорбции, опосредованные клетками. Продукты разложения этих керамических изделий на основе фосфата кальция могут включать ионы Ca2+, (PO4)3-ионы, OH-ионы и минеральные осаждения21. Скорость деградации керамики фосфата кальция значительно зависит от ее кристаллической структуры. Например, Van Blitterswijk et al.22 сообщили, что ГК с 40 об.% микропор не теряла массы, в то время как β-TCP с 40 об.% микропор потерял 30 ± 4% массы после имплантации в большеберцовые кости кроликов в течение 3 месяцев. Полимеры, такие как PLGA14,23, могут разлагаться из-за гидролиза эфирных связей в присутствии воды, а продукты разложения в основном включают молочную и гликолевую кислоты. Для достижения полной деградации PLGA 50/50 может потребоваться один месяц, а для PLGA 95/5 - несколько месяцев24.
Клеточный ответ и тестирование цитосовместимости имеют решающее значение для оценки и скрининга этих биоразлагаемых материалов имплантатов для биомедицинских применений. Однако текущие стандарты Международной организации по стандартизации (ISO), такие как ISO 10993-5:2009 «Биологическая оценка медицинских устройств - Часть 5 Тесты на цитотоксичность in vitro», изначально были разработаны для оценки цитотоксичности неразлагаемых биоматериалов, таких как ti-сплавы и сплавы Cr-Co in vitro25. В частности, ISO 10993-5:2009 охватывает только тесты на цитотоксичность экстракта in vitro, тесты на прямой контакт и косвенный контакт. В тесте экстракта экстракт получают путем погружения образцов в экстракционные жидкости, такие как питательные среды с сывороткой и физиологические солевые растворы в одном из стандартных временных и температурных условий. Собранный экстракт или разбавление затем добавляют в культуру клеток для изучения цитотоксичности. Для испытания на прямой контакт прямой контакт между образцом и клетками достигается путем помещения испытуемого образца на установленный (приклеенный) клеточный слой. В тесте на косвенный контакт культуральная среда, содержащая сыворотку и расплавленный агар, пипетируется для покрытия установленных клеток. Затем образец помещают на затвердевший слой агара с фильтром или без него.
Стандарты ИСО показали некоторые ограничения при применении для оценки биоразлагаемых материалов in vitro. В отличие от неразлагаемых материалов, поведение деградации биоразлагаемых материалов является динамическим и может изменяться в разное время или в различных условиях окружающей среды (например, температура, влажность, состав среды и тип ячейки). Тест экстракта оценивает только цитотоксичность продуктов разложения материала и не отражает динамический процесс деградации образца. Как прямые, так и косвенные контактные тесты стандарта ISO характеризуют только взаимодействия между установленными ячейками и образцами. Кроме того, при испытании на косвенный контакт материалы и клетки находятся в различных микросредах, которые не отражают среду in vivo и не улавливают динамическую деградацию биоразлагаемых материалов.
Целью данной статьи является представление и обсуждение методов тестирования цитосовместимости для различных биоразлагаемых материалов имплантатов для устранения вышеупомянутых ограничений методов, описанных в текущих стандартах ISO. Методы, представленные в данной статье, учитывают динамическое деградационное поведение материалов имплантатов и различные обстоятельства взаимодействия клеток и материалов in vivo. В частности, в этой статье представлены три метода тестирования цитосовместимости, а именно прямая культура, культура прямого воздействия и культура воздействия для различных биоразлагаемых материалов, включая биоразлагаемые полимеры, керамику, металлы и их композиты для применения в медицинских имплантатах.
В методе прямого культивирования клетки, взвешенные в культуральной среде, непосредственно засеивают на образцы, тем самым оценивая взаимодействие между вновь засеянными клетками и имплантатами. В культуре прямого воздействия образцы помещаются непосредственно на установленный клеточный слой, чтобы имитировать взаимодействие имплантатов с установленными клетками-хозяевами в организме. В культуре воздействия образцы помещают в соответствующие вкладыши колодца, а затем вводят в культуральные колодцы с установленными клетками, что характеризует реакцию установленных клеток на изменения в местной среде, вызванные деградацией имплантата, когда они не имеют прямого контакта с имплантатами. Методы культуры прямого и прямого воздействия оценивают клетки, прямо или косвенно контактирующие с материалами имплантата в той же культуре. Экспозиционная культура характеризует клетки, косвенно контактирующие с материалами имплантата в пределах предписанного расстояния в той же культуре.
В данной статье представлено подробное описание тестирования цитосовместимости различных биоразлагаемых материалов и их взаимодействия с модельными клетками, то есть мезенхимальными стволовыми клетками, полученными из костного мозга (BMSC). Протоколы включают сбор, культивирование, посев, фиксацию, окрашивание и визуализацию клеток, а также анализы посткультурных материалов и сред, которые применяются к различным биоразлагаемым материалам имплантатов и широкому спектру типов клеток. Эти методы полезны для скрининга биоразлагаемых материалов для различных биомедицинских применений с точки зрения клеточных реакций и цитосовместимости in vitro.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>490019-704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well tissue-culture-treated plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube (Polypropylene)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 G needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25&#189; G needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8242;,6-diamidino-2- phenylindole dilactate (DAPI)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D3571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tube (Polypropylene)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m nylon strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-105-0135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Flour 488-phalloidin</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet</td>
			<td>LABCONCO</td>
			<td>Class II, Type A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Rotor F-35-6-30, Centrifuge5430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Fused Quartz Round Dish</td>
			<td>AdValue Technology</td>
			<td>FQ-4085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>SANYO</td>
			<td>MCO-19AIC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolCell Freezer Container</td>
			<td>Corning</td>
			<td>432000</td>
			<td>foam container designed to regulate temperature decrease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovial</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>5000-1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>472301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDX analysis software</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>AztecSynergy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Energy dispersive X-ray spectroscopy (EDX)</td>
			<td>FEI</td>
			<td>50mm2 X-Max50 SDD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>SH30910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100496-496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>3520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation (LOCI, University of Wisconsin)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inductively coupled plasma 
			optical emission spectrometry (ICP-OES)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>Optima 8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical microscope</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VistaVision</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin (P/S)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Inc.,</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>model SB70P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning electronic microscope (SEM)</td>
			<td>FEI</td>
			<td>Nova NanoSEM 450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical blade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76353-728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Flasks</td>
			<td>VWR</td>
			<td>T-75, MSPP-90076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell inserts</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid solution (Trypsin-EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray diffraction instrument (XRD)</td>
			<td>PANalytical</td>
			<td>Empyrean Series 2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct and indirect culture methods for studying biodegradable implant materials in vitro

За последние несколько десятилетий биоразлагаемые материалы были широко исследованы для биомедицинских применений, таких как ортопедические, стоматологические и черепно-мышечно-лицевые имплантаты. Для скрининга биоразлагаемых материалов для биомедицинских применений необходимо оценить эти материалы с точки зрения клеточных реакций in vitro , цитосовместимости и цитотоксичности. Стандарты Международной организации по стандартизации (ИСО) широко используются при оценке биоматериалов. Однако большинство стандартов ИСО были первоначально установлены для оценки цитотоксичности неразлагаемых материалов, что обеспечивает ограниченную ценность для скрининга биоразлагаемых материалов. 
В этой статье представлены и обсуждаются три различных метода культивирования, а именно: метод прямого культивирования, метод культуры прямого воздействия и метод культуры воздействия для оценки цитосовместимости in vitro биоразлагаемых материалов имплантатов, включая биоразлагаемые полимеры, керамику, металлы и их композиты, с различными типами клеток. Исследования показали, что методы культивирования влияют на реакцию клеток на биоразлагаемые материалы, поскольку их динамическая деградация вызывает пространственно-временные различия на границе раздела и в местной среде. В частности, метод прямого культивирования выявляет реакции клеток, посеянных непосредственно на имплантатах; метод культивирования прямого воздействия выявляет реакции установленных клеток-хозяев, вступающих в контакт с имплантатами; и метод культивирования воздействия оценивает установленные клетки-хозяева, которые не находятся в непосредственном контакте с имплантатами, но находятся под влиянием изменений в местной среде из-за деградации имплантата. 
В этой статье приведены примеры этих трех методов культивирования для изучения цитосовместимости биоразлагаемых материалов имплантатов in vitro и их взаимодействия с мезенхимальными стволовыми клетками, полученными из костного мозга (BMSC). В нем также описывается, как собирать, проходить, культивировать, сеять, фиксировать, окрашивать, характеризовать клетки и анализировать посткультурные среды и материалы. Методы in vitro , описанные в этой статье, имитируют различные сценарии среды in vivo , расширяя применимость и актуальность тестирования цитосовместимости различных биоматериалов in vitro для различных биомедицинских применений.

На рисунке 4 показаны репрезентативные флуоресцентные изображения BMSC в условиях прямого и косвенного контакта с использованием различных методов культивирования. На рисунке 4A,B показаны BMSC в условиях прямого и косвенного контакта после той же ...

Watch this Scientific Journal Video about Direct and Indirect Culture Methods for Studying Biodegradable Implant Materials In Vitro at JoVE.com

Direct and Indirect Culture Methods for Studying Biodegradable Implant Materials In Vitro

Мы вводим три метода прямого культивирования, культуры прямого воздействия и культуры воздействия для оценки цитосовместимости биоразлагаемых материалов имплантатов in vitro . Эти методы in vitro имитируют различные взаимодействия между клетками и имплантатами in vivo и могут быть применены для изучения различных биоразлагаемых материалов.

Методы прямого и косвенного культивирования для изучения биоразлагаемых материалов имплантатов in vitro

Over the past several decades, biodegradable materials have been extensively explored for biomedical applications such as orthopedic, dental, and ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Direct and Indirect Culture Methods for Studying Biodegradable Implant Materials In Vitro

Studying Cell Rolling Trajectories on Asymmetric Receptor Patterns

Изучение сотовый Роллинг Траектории на ассиметричные паттерны рецепторов

Lateral displacement of cells orthogonal to a flow stream by rolling on asymmetric receptor patterns presents an opportunity for development of new ...

Silk Film Culture System for in vitro Analysis and Biomaterial Design

Silk Film Culture System for in vitro Analysis and Biomaterial Design

Шелковый Фильм культуры система В пробирке Анализ и Дизайн биоматериала

Silk films are promising protein-based biomaterials that can be fabricated with high fidelity and economically within a research laboratory environment ...

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

В пробирке клеточных культур модели для токсичных ингаляционной химической тестирования

Cell cultures are indispensable to develop and study efficacy of therapeutic agents, prior to their use in animal models. We have the unique ability to ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Раздражение глаз тест (СПЭ) для идентификации опасности глазных Раздражает химических веществ с использованием реконструированного человеческой роговицы, как Эпителиальный (RHCE) тканей Модель

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Fabricating Superhydrophobic Polymeric Materials for Biomedical Applications

Изготовление супергидрофобных полимерных материалов для биомедицинских применений

Superhydrophobic materials, with surfaces possessing permanent or metastable non-wetted states, are of interest for a number of biomedical and industrial ...

Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

Изучение стехиометрии рецептор эпидермального фактора роста в интактных клетках, используя КОРРЕЛЯЦИОННЫМ микроскопия

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Свет-опосредованной Формирование и структурирование гидрогелей для клеточных культур

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

<em&gt; In Vitro</em&gt; Орган культуры Модель мышиной межпозвонкового диска

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Улучшение 3D гидрогеля культур первичных глиальных клеток In Vitro моделирования Neuroinflammation

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

Человек 3D Экстраклеточная матрица-Адипоцит Культура Модель для изучения Матрица-Клеточная метаболический перекрестный разговор

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...