Name: in situ visualization of axon growth and growth cone dynamics in acute ex vivo embryonic brain slice cultures
Uploaded: 2021-10-14T15:00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures at JoVE.com

نود أن نشكر ماريا يوجينيا بيرنيس على تصوير الإجراءات. كما نشكر إميلي بيرنسايد وإميلي هاندلي وثوربن بيترالا وماكس شيلسكي وسينا ستيرن على قراءة المخطوطة ومناقشتها. نحن ممتنون لمساعدينا الفنيين المتميزين ، جيسيكا جونير ، بلانكا راندل ، وآن توان فام. نحن نعترف بالدعم القيم لمرفق المجهر الضوئي ومرفق الحيوانات في DZNE. تم دعم هذا العمل من قبل Deutsche Forschungsgesellschaft (DFG) ، والمؤسسة الدولية للبحوث في الشلل النصفي (IRP) ، وأجنحة من أجل الحياة (إلى F.B). F.B. هو عضو في مجموعة التميز ImmunoSensation2 ، SFBs 1089 و 1158 ، وهو حاصل على جائزة Roger De Spoelberch.

<ol>
	<li>Schelski, M., Bradke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+polarization:+From+spatiotemporal+signaling+to+cytoskeletal+dynamics.">Neuronal polarization: From spatiotemporal signaling to cytoskeletal dynamics.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 84, 11-28 (2017).</li><li>Lowery, L. A., Van Vactor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+trip+of+the+tip:+understanding+the+growth+cone+machinery.">The trip of the tip: understanding the growth cone machinery.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 10 (5), 332-343 (2009).</li><li>Stoeckli, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+axon+guidance:+are+we+nearly+there+yet.">Understanding axon guidance: are we nearly there yet.</a> Development. 145 (10), (2018).</li><li>Bradke, F., Dotti, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+local+actin+instability+in+axon+formation.">The role of local actin instability in axon formation.</a> Science. 283 (5409), 1931-1934 (1999).</li><li>Neukirchen, D., Bradke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+linker+proteins+regulate+neuronal+polarization+through+microtubule+and+growth+cone+dynamics.">Cytoplasmic linker proteins regulate neuronal polarization through microtubule and growth cone dynamics.</a> Journal of Neuroscience. 31 (4), 1528-1538 (2011).</li><li>Witte, H., Bradke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+cytoskeleton+during+neuronal+polarization.">The role of the cytoskeleton during neuronal polarization.</a> Current Opinion in Neurobiology. 18 (5), 479-487 (2008).</li><li>Witte, H., Neukirchen, D., Bradke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+stabilization+specifies+initial+neuronal+polarization.">Microtubule stabilization specifies initial neuronal polarization.</a> Journal of Cell Biology. 180 (3), 619-632 (2008).</li><li>Nichol, R. H., Catlett, T. S., Onesto, M. M., Hollender, D., Gomez, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+elasticity+regulates+cell-type+specific+RHOA+signaling+and+neuritogenesis+of+human+neurons.">Environmental elasticity regulates cell-type specific RHOA signaling and neuritogenesis of human neurons.</a> Stem Cell Reports. 13 (6), 1006-1021 (2019).</li><li>Santos, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+growth+of+CNS+neurons+in+three+dimensions+is+amoeboid+and+independent+of+adhesions.">Axon growth of CNS neurons in three dimensions is amoeboid and independent of adhesions.</a> Cell Reports. 32 (3), 107907 (2020).</li><li>Mitchison, T., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal+dynamics+and+nerve+growth.">Cytoskeletal dynamics and nerve growth.</a> Neuron. 1 (9), 761-772 (1988).</li><li>Lin, C. H., Thompson, C. A., Forscher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal+reorganization+underlying+growth+cone+motility.">Cytoskeletal reorganization underlying growth cone motility.</a> Current Opinion in Neurobiology. 4 (5), 640-647 (1994).</li><li>Myers, J. P., Gomez, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+adhesion+kinase+promotes+integrin+adhesion+dynamics+necessary+for+chemotropic+turning+of+nerve+growth+cones.">Focal adhesion kinase promotes integrin adhesion dynamics necessary for chemotropic turning of nerve growth cones.</a> Journal of Neuroscience. 31 (38), 13585-13595 (2011).</li><li>Turney, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+growth+factor+stimulates+axon+outgrowth+through+negative+regulation+of+growth+cone+actomyosin+restraint+of+microtubule+advance.">Nerve growth factor stimulates axon outgrowth through negative regulation of growth cone actomyosin restraint of microtubule advance.</a> Molecular Biology of the Cell. 27 (3), 500-517 (2016).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurons+derived+from+radial+glial+cells+establish+radial+units+in+neocortex.">Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex.</a> Nature. 409 (6821), 714-720 (2001).</li><li>Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+neurons+arise+in+symmetric+and+asymmetric+division+zones+and+migrate+through+specific+phases.">Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases.</a> Nature Neuroscience. 7 (2), 136-144 (2004).</li><li>Ferent, J., Zaidi, D., Francis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+control+of+radial+glia+proliferation+and+scaffolding+during+cortical+development+and+pathology.">Extracellular control of radial glia proliferation and scaffolding during cortical development and pathology.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 578341 (2020).</li><li>Dent, E. W., Gupton, S. L., Gertler, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+growth+cone+cytoskeleton+in+axon+outgrowth+and+guidance.">The growth cone cytoskeleton in axon outgrowth and guidance.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (3), (2011).</li><li>Dupraz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RhoA+controls+axon+extension+independent+of+specification+in+the+developing+brain.">RhoA controls axon extension independent of specification in the developing brain.</a> Current Biology. 29 (22), 3874-3886 (2019).</li><li>Azzarelli, R., Oleari, R., Lettieri, A., Andre, V., Cariboni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro,+ex+vivo+and+in+vivo+techniques+to+study+neuronal+migration+in+the+developing+cerebral+cortex.">In vitro, ex vivo and in vivo techniques to study neuronal migration in the developing cerebral cortex.</a> Brain Sciences. 7 (5), (2017).</li><li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+brain+slice+cultures:+A+review.">Organotypic brain slice cultures: A review.</a> Neuroscience. 305, 86-98 (2015).</li><li>Namba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pioneering+axons+regulate+neuronal+polarization+in+the+developing+cerebral+cortex.">Pioneering axons regulate neuronal polarization in the developing cerebral cortex.</a> Neuron. 81 (4), 814-829 (2014).</li><li>Shah, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rap1+GTPases+are+master+regulators+of+neural+cell+polarity+in+the+developing+neocortex.">Rap1 GTPases are master regulators of neural cell polarity in the developing neocortex.</a> Cerebral Cortex. 27 (2), 1253-1269 (2017).</li><li>Wiegreffe, C., Feldmann, S., Gaessler, S., Britsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+confocal+imaging+of+migrating+neurons+in+organotypic+slice+culture+of+embryonic+mouse+brain+using+in+utero+electroporation.">Time-lapse confocal imaging of migrating neurons in organotypic slice culture of embryonic mouse brain using in utero electroporation.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), (2017).</li><li>de Anda, F. C., Meletis, K., Ge, X., Rei, D., Tsai, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosome+motility+is+essential+for+initial+axon+formation+in+the+neocortex.">Centrosome motility is essential for initial axon formation in the neocortex.</a> Journal of Neuroscience. 30 (31), 10391-10406 (2010).</li><li>Sakakibara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+centrosome+translocation+and+microtubule+organization+in+neocortical+neurons+during+distinct+modes+of+polarization.">Dynamics of centrosome translocation and microtubule organization in neocortical neurons during distinct modes of polarization.</a> Cerebral Cortex. 24 (5), 1301-1310 (2014).</li><li>Schatzle, P., Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+microtubule+dynamics+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures.">Live imaging of microtubule dynamics in organotypic hippocampal slice cultures.</a> Methods in Cell Biology. 131, 107-126 (2016).</li><li>Qu, X., Kumar, A., Bartolini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+microtubule+dynamics+at+excitatory+presynaptic+boutons+in+primary+hippocampal+neurons+and+acute+hippocampal+slices.">Live imaging of microtubule dynamics at excitatory presynaptic boutons in primary hippocampal neurons and acute hippocampal slices.</a> STAR Protocols. 2 (1), 100342 (2021).</li><li>Tonnesen, J., Katona, G., Rozsa, B., Nagerl, U. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spine+neck+plasticity+regulates+compartmentalization+of+synapses.">Spine neck plasticity regulates compartmentalization of synapses.</a> Nature Neuroscience. 17 (5), 678-685 (2014).</li><li>Buchsbaum, I. Y., Cappello, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+migration+in+the+CNS+during+development+and+disease:+insights+from+in+vivo+and+in+vitro+models.">Neuronal migration in the CNS during development and disease: insights from in vivo and in vitro models.</a> Development. 146 (1), (2019).</li><li>Rigby, M. J., Gomez, T. M., Puglielli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+cell-axonal+growth+cone+interactions+in+neurodevelopment+and+regeneration.">Glial cell-axonal growth cone interactions in neurodevelopment and regeneration.</a> Frontiers in Neuroscience. 14, 203 (2020).</li><li>Barnes, A. P., Polleux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+axon-dendrite+polarity+in+developing+neurons.">Establishment of axon-dendrite polarity in developing neurons.</a> Annual Review of Neuroscience. 32, 347-381 (2009).</li></ol>

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

كيف تستشعر مخاريط النمو وتتفاعل مع البيئة المحيطة بها لتنسيق تمديد وتوجيه المحور العصبي في وقت واحد لا تزال مسألة نقاش 3,18. قدمت الدراسات الرائدة في الركائز ثنائية الأبعاد لمحة عن الآليات الجزيئية الأساسية التي تولد القوى التي تدفع ديناميكيات مخروط النمو أثناء تكوين المحور العصبي والنمو والملاحة2،10،11،12،19. في الآونة الأخيرة ، كشفت الدراسات في مصفوفات 3D عن مدى تأثير البعد الثالث في سلوك مخروط النمو وبالتالي في نمو المحور العصبي 8,9. ومع ذلك، فإن الآليات المعقدة التي توجه ديناميات مخروط النمو في الجسم الحي لا تزال بحاجة إلى دراسة دقيقة.
يستخدم إعداد ثقافات شرائح النمط العضوي من أدمغة IUE أو EUE على نطاق واسع وموثق جيدا. لقد أصبح معيارا ذهبيا يسمح للعلماء باكتساب رؤى ثاقبة حول تطور وسلوك الخلايا العصبية في أنسجة المخ الحية20,21. في الواقع ، تم استخدام هذه التقنية بنجاح في تركيبة مع العديد من تقنيات التصوير عالية الدقة لتصور عمليات جزيئية محددة وأحداث مورفولوجية في الموقع. وتشمل هذه الدراسات ، على سبيل المثال لا الحصر تكوين المحور العصبي وامتداده 19،22 ، والهجرة العصبية القشرية 19،22،23،24 ، والديناميات المركزية 25،26 ، وديناميات الأنابيب الدقيقة27 ، وكذلك الديناميكيات الوظيفية للمقصورات قبل وبعد المشبكي28،29.
يعالج هذا البروتوكول فجوة في البيولوجيا العصبية التجريبية ، وتصور ديناميكيات مخروط النمو لتطوير الخلايا العصبية القشرية في الموقع ، في ثقافات شرائح الدماغ الحادة خارج الجسم الحي ، والأدوات اللازمة لتحليل البيانات التي تم الحصول عليها.
تم استخدام ثقافات شرائح الدماغ الحادة لإنشاء هذا البروتوكول لأنها (1) مع بعض الممارسة ، يسهل توليدها. (2) تقديم نظام يمكن الوصول إليه لدراسة مخاريط النمو المضمنة في بيئة شبه فسيولوجية كاملة ، ولكنها شفافة بما يكفي للسماح بتصوير الخلايا الحية عالي الدقة ؛ (3) يمكن توسيعها لاستخدامها مع عدد لا يحصى من خطوط الماوس المعدلة وراثيا ؛ (4) جنبا إلى جنب مع IUE أو EUE ، توفر إمكانات غير محدودة تقريبا لتقديم أدوات جزيئية لتقييم أداء مخاريط النمو والمحاور العصبية في الجسم الحي في ظل فقدان / كسب أنظمة الوظائف ، جنبا إلى جنب مع مراسلي الفلورسنت ومجسات الهيكل الخلوي.
وقد وصفت هذه المنهجية في سياق كل من الاتحاد الأوروبي والجامعة الإسلامية في أوروبا. على الرغم من أنها لا تزال طريقة موثوقة للغاية ، إلا أن EUE أدت إلى زيادة حدوث شرائح الدماغ التي تظهر شبكة RG غير منظمة مقارنة بتلك التي تم الحصول عليها باستخدام IUE كطريقة تسليم (الشكل 4C). تؤثر الاضطرابات في مصفوفة RG بشدة على هجرة الخلايا العصبية ونمط استطالة المحور العصبي30,31. هذه هي المعلمات الرئيسية التي تتنبأ بمكان العثور على محاور محورية للتحليل في وقت معين ونوع البيئة التي يتنقلون فيها. عادة ما تعاني شرائح الدماغ ذات شبكة RG المعطلة بشكل كبير من ضعف التقسيم الطبقي للخلايا العصبية القشرية . وهذا بدوره ينتج محاور ذات مسارات فوضوية. لذلك ، يوصى بشدة بالتحكم في السلامة الهيكلية لشبكة RG. ومن المثير للاهتمام أن ضعف السلامة الهيكلية يرتبط بزيادة عمر الدماغ الجنيني. في الواقع ، لم يتم ملاحظة مثل هذه الآثار في أجنة E12.5-E13.5 الأصغر سنا عادة19.
والبروتوكول الحالي شامل ومباشر. ومع ذلك ، هناك بعض الخطوات الحاسمة التي يجب فيها توخي الحذر والاهتمام الخاصين للحصول على أفضل النتائج. وقد أشير إلى ذلك صراحة في البروتوكول ويشمل (1) ضبط كمية الحمض النووي المستخدمة في المعالجة الكهربائية للحصول على علامات متفرقة؛ و (2) ضبط كمية الحمض النووي المستخدمة في المعالجة الكهربائية للحصول على علامات متفرقة؛ و (2) ضبط كمية الحمض النووي المستخدمة في المعالجة الكهربائية للحصول على علامات متفرقة؛ و (2) ضبط كمية الحمض النووي المستخدمة في المعالجة الكهربائية للحصول على علامات متفرقة؛ و (2) ضبط كمية الحمض النووي المستخدمة في المعالجة الكهربائية للحصول على علامات متفرق (2) تجنب الضرر أثناء استخراج الأدمغة ؛ (3) التحكم في درجة حرارة الأغاروز أثناء غلاف الدماغ ؛ (4) استكشاف الأخطاء وإصلاحها النسبة المئوية المثالية من الأغاروز لأدمغة عمر معين ؛ و (5) اختيار الفلوروفورات ، التي تتبع تجربتها. أثناء تحسين البروتوكول ، تم اختبار أداء العديد من الفلوروفورات في التصوير بالخلايا الحية في الموقع. تم اختيار متغيرات GFP الأحادية EGFP و NeonGreen لإعداد البلازميدات الموسومة LifeAct- و Lyn لهذا البروتوكول (الشكل 5A ، B). بالإضافة إلى ذلك ، تم اختبار متغير RFP mScarlet ووجد أنه مناسب للغاية لهذا الإعداد (البيانات غير معروضة). كما تم اختبار tRFP متعدد الوسائط (dimer) و ZsGreen (tetramer) (الشكل 5C والفيديو التكميلي 1 ، إلى اليمين). يوصى باستخدام هذه الفلوروفورات فائقة السطوع سريعة الطي عندما تتطلب الطريقة توليد إشارة فلورسنت سريعة بعد تسليم الحمض النووي.
من الممارسات الشائعة في استخدام مزارع الشرائح استخدام شرائح من أدمغة مختلفة لاختبار التحكم والظروف التجريبية. وهذا يمثل مصدرا متأصلا للتقلبات غير المرغوب فيها. هنا ، تم استخدام نظام تعبير يتيح تعديلا مستقلا للخلايا العصبية المجاورة وتعبير المراسلين لتحديد الهوية. لاحظ أنه في هذا العرض التوضيحي (الشكل 5C) ، لم تكن هناك اختلافات بين الخلايا العصبية التي تعبر عن أي من الفلوروفورات. ومع ذلك ، على سبيل المثال ، فإن مثل هذا المزيج من البلازميد جنبا إلى جنب مع خط الفأر المعدل وراثيا الذي يؤوي جينا حساسا ل Cre سوف يحمل الخلايا العصبية tRFP (الحساسة للدرد) التي بقيت كنوع بري. في المقابل ، فإن ZsGreen (أيضا Cre-sensitive) سوف يصنف الخلايا العصبية المعاد تجميعها. وبالتالي ، يمكن دراسة مخاريط النمو للنمطين الوراثيين المختلفين ، ومن المحتمل أيضا الأنماط الظاهرية ، جنبا إلى جنب في وقت واحد في نفس شريحة الدماغ.
يعد توطين المحاور ومخاريط النمو للتحليل أحد الاعتبارات المهمة. تستقطب الخلايا العصبية القشرية أثناء الهجرة شعاعيا من المنطقة البطينية (VZ) نحو الصفيحة القشرية (CP). خلال هذه العملية ، تشكل الخلايا العصبية عملية رائدة (تشعبات مستقبلية) وعملية زائدة ستصبح المحور العصبي ، وتنضم في النهاية إلى محاور رائدة في المنطقة الوسيطة (IZ) ، وإنشاء مسارات محورية32. لذلك ، لالتقاط مخاريط النمو المحوري ، تم إجراء التصوير على الألياف المحورية في IZ ، بما في ذلك المحاور العصبية الخارجة من CP والمحاور العصبية التي تم إنشاؤها مبكرا والمرتبطة بالفعل بالحزم المحورية ؛ أو في نهاية المطاف ، في الألياف التي تستعرض IZ وتمتد تحتها (الشكل 7).
يجعل هذا البروتوكول من الممكن إجراء تصوير فائق الدقة للخلايا العصبية داخل شرائح النمط العضوي. تاريخيا ، كان تشتت الضوء مشكلة كبيرة تواجه عند تصوير عينات سميكة. على مدى العقدين الماضيين ، جعلت التطورات الواسعة في التقنيات البصرية تصوير العينات السميكة ممكنا. هنا ، تم استخدام هدف مسافة العمل الطويلة لتصور الهياكل الأصغر بشكل أفضل ، مثل مخاريط النمو. لا مفر من أن هذا البروتوكول لا يلتقط أحداثا أكثر تفصيلا مثل تدفق الأكتين الرجعي أو ديناميكيات الأنابيب الدقيقة. يحافظ هدف مسافة العمل الطويلة، الذي يتطلب فتحة عدسة رقمية أقل (NA)، على المعلومات من الشرائح السميكة. ومع ذلك، كان من الممكن أيضا تكييف هذا البروتوكول لاستخدامه مع أهداف تقصير مسافة العمل. وهذا يتطلب نقلا سلسا للشرائح إلى طبق ذو قاع زجاجي للحفاظ على السلامة الهيكلية. ومع ذلك ، أدى استخدام هذه الطريقة إلى بقاء أقصر - ~ 15 ساعة - بسبب فقدان تبادل الغازات (البيانات غير معروضة). على عكس ثقافات 2D ، تحتل مخاريط النمو في 3D حجما أكبر وتتطلب تعويضا عن الحركة والقطع الأثرية في المحور z. لزيادة القدرة على تصوير الأحداث التفصيلية ، يجب استخدام التكنولوجيا البؤرية الحديثة. لذلك ، يوصى باستخدام محرك z-stack سريع المسح الضوئي ، مثل z-Galvo المتوفر على المجاهر البؤرية شديدة الحساسية33.
وتجدر الإشارة إلى أن هذا البروتوكول يقدم ثلاثة قيود رئيسية. أولا ، غالبا ما يكون من الصعب التحكم في مستويات التعبير / عدد الخلايا المعبرة عن أي بلازميد معين في الجسم الحي. هذا يدخل التباين بين جميع الشرائح حتى عند الحفاظ على نفس تركيز البلازميد. لذلك ، يجب تحديد اختيار العناصر التنظيمية في ناقلات التعبير المستخدمة مسبقا بعناية. ثانيا ، تصوير الأحداث التفصيلية باستخدام إدراج الغشاء غير ممكن حاليا. ويمكن التغلب على هذا القيد الثاني بالتحديثات المنهجية المقترحة في الفقرة السابقة. وأخيرا ، فإن مخاريط النمو حساسة للغاية للضوء ويمكن أن تصبح مبيضة ضوئيا بسرعة. لذلك ، فإن التصوير المتكرر لمخاريط النمو ، لمدة تقل عن 5 دقائق باستخدام المجاهر الماسحة بالليزر يمكن أن يؤدي في كثير من الأحيان إلى انهيار مخاريط النمو. في هذا الصدد ، يمكن تكييف التقدم الجديد في الأجهزة التي تم إنشاؤها بواسطة المجهر الضوئي للتصوير طويل الأجل لشرائح الدماغ34.
ومن المتوخى أن تفتح بروتوكولات من هذا القبيل طرقا بحثية جديدة، مما يسمح بفهم أفضل لما يتطلبه الأمر حتى يقرأ مخروط النمو ويتفاعل مع بيئة معقدة في الجسم الحي ، والأهم من ذلك، كشف آليات هذا التفاعل المتطور.

الخلايا العصبية هي خلايا شديدة الاستقطاب تمثل الوحدة الحسابية الأساسية في الجهاز العصبي. فهي تتلقى وتصدر معلومات تعتمد على تجزئة مواقع المدخلات والمخرجات: التشعبات والمحاور المحورية، على التوالي1. أثناء التطوير ، تمتد المحاور العصبية أثناء التنقل في بيئة معقدة لا تصدق للوصول إلى وجهتها. تسترشد الملاحة المحورية بمخروط النمو ، وهو هيكل حسي يقع عند طرف المحور المحوري النامي. مخروط النمو مسؤول عن اكتشاف الإشارات البيئية وترجمتها إلى إعادة التنظيم المكاني الديناميكي للهيكل الخلوي 2,3. تقوم التفاعلات المورفولوجية الميكانيكية الناتجة بتوجيه مخروط النمو إلى التمدد أو التراجع عن إشارة التحفيز ، مما يؤدي إلى مناورات محورية محددة.
ينبع الفهم الحالي لديناميكيات مخروط المحور العصبي والنمو من الدراسات التي تقيم نمو المحور العصبي على ركائز ثنائية الأبعاد (2D)2،4،5،6،7. حددت هذه الدراسات الرائدة التفاعل المتطور بين مخاريط النمو وركائز النمو وكشفت عن اختلافات مذهلة تعتمد على خصائص الركيزة مثل الالتصاق والصلابة 8,9. بقيادة هذه الرؤى ، تم افتراض الإشارات البيئية خارج الخلية لإملاء نمو المحور العصبي ، مع الهيكل الخلوي المخروطي للنمو الذي نفذ هذا النمو2،10،11،12. والجدير بالذكر أن الخلايا العصبية يمكنها تمديد المحاور العصبية في ركائز غير لاصقة (على سبيل المثال، بولي ليسين وبولي أورنيثين)13. علاوة على ذلك ، يمكن أن تؤثر صلابة الركيزة على معدل نمو المحور العصبي بشكل مستقل عن المجمعات اللاصقة للخلايا8. وبالتالي ، فإن دراسة ديناميكيات مخروط النمو في ركائز 2D وحدها لا يمكن أن تشكل بدقة توازن القوى التي تنشأ عن تفاعل مخاريط النمو المحورية مع البيئات ثلاثية الأبعاد (3D) ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية ، مثل تلك الموجودة في الجسم الحي.
للتغلب على قيود الفحوصات ثنائية الأبعاد ، تمت دراسة نمو المحور العصبي وديناميكيات مخروط النمو في مصفوفات 3D 8,9. تشكل هذه المصفوفات سياقا فسيولوجيا أكثر ولكنها تسمح بدراسة الآليات الجوهرية الخلوية لنمو المحور العصبي. وهو يتيح فحص مخروط النمو بطريقة خلية واحدة في مجموعة متنوعة من الحالات والعلاجات الدوائية9. في مثل هذه البيئات ثلاثية الأبعاد ، أظهرت المحاور العصبية ديناميكيات هيكلية خلوية متميزة ونمت بشكل أسرع من تلك التي لوحظت في الخلايا العصبية المستزرعة 2D9. أظهرت هذه الدراسات الأنيقة تأثير بعد إضافي على إعادة تنظيم الهيكل الخلوي المخروطي للنمو ، وبالتالي على سلوكه.
على الرغم من المزايا الواضحة التي تقدمها مصفوفات 3D على الأسطح 2D في دعم التطور العصبي الشبيه بالسكان الأصليين ونمو المحور العصبي ، إلا أنها تظل سقالة اصطناعية مبسطة لا يمكنها أن تعكس تعقيد الديناميكيات التي لوحظت في أنسجة الجهاز العصبي المركزي (CNS). هنا ، تم الجمع بين تسليم البلازميدات المراسلة عن طريق الرحم الخارجي وفي الرحم الكهربائي مع ثقافة شرائح النمط العضوي في الدماغ والتصوير الحي فائق الدقة في الموقع لتحليل ديناميكيات مخروط النمو في سياق فسيولوجي. تسمح هذه المنهجية بتصور المحاور النامية أثناء تجربة 3-dimensionality في بيئات الجسم الحي وتعقيد تركيبتها الفيزيائية الكيميائية. وأخيرا، يتم وصف الإجراءات سهلة الاستخدام لقياس نمو المحور العصبي وديناميكيات مخروط النمو باستخدام برامج مرخصة بشكل شائع ومتاحة للجمهور.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adson Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11006-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21202</td>
			<td>Goat Anti-Mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21236</td>
			<td>Goat Anti-Mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Vimentin antibody</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>V2258-.2ML</td>
			<td>Monoclonal mouse, clone LN-6, ascites fluid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>3864154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biozym Sieve GP Agarose</td>
			<td>Biozyme</td>
			<td>850080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Braunol, Spr&#252;hflasche</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>3864073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine (Temgesic)</td>
			<td>GEHE Pharma</td>
			<td>345928</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMZ unevirsal electrode puller</td>
			<td>Zeitz</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric razor</td>
			<td>Andes</td>
			<td>NA</td>
			<td>ProClip UltraEdge Super 2-Speed model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enrofloxacin (Baytril)</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>3543238</td>
			<td>2,5% (wt/vol)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf microloader pipette tips</td>
			<td>FischerScientific</td>
			<td>10289651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green FCF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7252-5G</td>
			<td>Dye content &#8805; 85 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji 2.1.0</td>
			<td>NIH</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji/downloads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-09</td>
			<td>ToughCut/Straight/9cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroDish Cell Culture Dish</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>FD5040-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount Aqueous Mounting Medium</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>F4680-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>MedPex</td>
			<td>3705391</td>
			<td>5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14025092</td>
			<td>calcium, magnesium, no phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Pan-Biotech</td>
			<td>P30-0711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris 9.7.2</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://imaris.oxinst.com/products/imaris-for-neuroscientists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Virbac</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotonic saline solution</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>8609261</td>
			<td>0.90%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica VT1200 S vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14048142066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 880 with Airyscan</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metacam</td>
			<td>Venusberg Apotheke</td>
			<td>8890217</td>
			<td>5 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>Janvier Labs</td>
			<td>NA</td>
			<td>C57BL/6JRj</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Adson Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11018-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Storage Jar</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>E210</td>
			<td>&#160;16.16.27</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/p/excel/cfq7ttc0k7dx?activetab=pivot:overviewtab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell Cell Culture Insert</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td>30&#160;mm, hydrophilic PTFE, 0.4&#160;&#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moria Perforated Spoons</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10370-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moria Spoon</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10321-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium, minus phenol red</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12348017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neuropan-2 supplement</td>
			<td>Pan-Biotech</td>
			<td>P07-11010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab138478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olsen-Hegar Needle Holder with Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Tub-alpha-1-Dre</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>133925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Tub-alpha-1-iCre</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>133924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Tub-alpha-1-LifeAct-GFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>175437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52858-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3813-10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCAG-lox-rox-STOP-rox-tRFP-lox-Lyn-ZsGreen</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>175438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCAG-lox-STOP-lox-Lyn-mNeonGreen</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>175257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoNozzle Kit v2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>5430-ALL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum Tweezertrodes</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>45-0487</td>
			<td>1 mm / 3 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAGEN Maxi kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reflex wound closure Clip</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500344-10</td>
			<td>7 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sekundenkleber Pattex Mini Trio</td>
			<td>Lyreco</td>
			<td>4722659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square wave electroporation system ECM830</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>W3 45-0052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile gauze</td>
			<td>Braun Askina</td>
			<td>9031216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile lubricant eye ointment</td>
			<td>Bayer Vital</td>
			<td>PZN1578675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile surgical gloves</td>
			<td>Sempermed</td>
			<td>14C0451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4621.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supramid 5-0 surgical silk sutures</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin-wall glass capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW100-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide 8 Well Glass Bottom</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80827</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ visualization of axon growth and growth cone dynamics in acute ex vivo embryonic brain slice cultures

أثناء تطور الخلايا العصبية ، تتنقل المحاور العصبية في البيئة القشرية للوصول إلى وجهاتها النهائية وإنشاء اتصالات متشابكة. تقوم مخاريط النمو - الهياكل الحسية الموجودة في الأطراف البعيدة لتطوير المحاور العصبية - بتنفيذ هذه العملية. تعد دراسة بنية وديناميكيات مخروط النمو أمرا بالغ الأهمية لفهم التطور المحوري والتفاعلات مع الجهاز العصبي المركزي المحيط (CNS) التي تمكنه من تكوين دوائر عصبية. هذا أمر ضروري عند ابتكار طرق لإعادة دمج المحاور العصبية في الدوائر العصبية بعد الإصابة في البحوث الأساسية والسياقات قبل السريرية. حتى الآن ، يعتمد الفهم العام لديناميكيات مخروط النمو في المقام الأول على دراسات الخلايا العصبية المستزرعة في بعدين (2D). على الرغم من أنها أساسية بلا شك للمعرفة الحالية بالديناميكيات الهيكلية لمخروط النمو والاستجابة للمحفزات ، إلا أن دراسات 2D تحرف البيئة الفسيولوجية ثلاثية الأبعاد (3D) التي تواجهها مخاريط النمو العصبي في أنسجة الجهاز العصبي المركزي السليمة. في الآونة الأخيرة ، تم استخدام المواد الهلامية الكولاجين للتغلب على بعض هذه القيود ، مما مكن من التحقيق في تطور الخلايا العصبية في 3D. ومع ذلك ، تفتقر كل من البيئات الاصطناعية 2D و 3D إلى إشارات الإشارة داخل أنسجة الجهاز العصبي المركزي ، والتي توجه الامتداد والبحث عن المسارات للمحاور الجذعية النامية. يوفر هذا البروتوكول طريقة لدراسة المحاور ومخاريط النمو باستخدام شرائح الدماغ العضوية ، حيث تواجه المحاور النامية إشارات فيزيائية وكيميائية ذات صلة فسيولوجيا. من خلال الجمع بين المضبوط بدقة في الرحم وخارج الرحم الكهربائي لتقديم مراسلات الفلورسنت بشكل ضئيل جنبا إلى جنب مع الفحص المجهري فائق الدقة ، يقدم هذا البروتوكول خط أنابيب منهجي لتصور ديناميكيات مخروط المحور العصبي والنمو في الموقع. وعلاوة على ذلك، يتضمن وصفا مفصلا لمجموعة أدوات لتحليل بيانات التصوير الطويل الأجل وبيانات التصوير بالخلايا الحية.

Watch this Scientific Journal Video about In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures at JoVE.com

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

يوضح هذا البروتوكول طريقة مباشرة وقوية لدراسة نمو المحور العصبي في الموقع وديناميكيات مخروط النمو. وهو يصف كيفية إعداد شرائح الدماغ الحادة ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية خارج الجسم الحي ويوفر خط أنابيب تحليل سهل الاستخدام.

في الموقع تصور نمو المحور العصبي وديناميكيات مخروط النمو في مزارع شرائح الدماغ الجنينية الحادة خارج الجسم الحي

During neuronal development, axons navigate the cortical environment to reach their final destinations and establish synaptic connections. Growth cones ...

كيف تتنقل المحاور العصبية في مصفوفة الجهاز العصبي المركزي المعقدة هو سؤال أساسي في علم الأحياء العصبي. يتيح هذا البروتوكول دراسة نمو المحور العصبي وديناميكيات مخروط النمو في البيئة الفسيولوجية مع التصوير عالي الدقة. يصف هذا البروتوكول خط أنابيب سهل الاستخدام من طرف إلى طرف لتوصيل الحمض النووي في الدماغ الجنيني للفأر ، والاستعدادات لشرائح النمط العضوي عالية الجودة ودليل خطوة بخطوة للحصول على الصور وتحليلها.على الرغم من أنه تم تصميمه في الأصل لدراسة ديناميكيات المحور العصبي في الجهاز العصبي المركزي الجنيني ، إلا أنه يمكن تعديل هذا البروتوكول للسماح بالثقافة العضوية وتصور لدونة المحور العصبي بعد الحالات المؤلمة أو المرضية. البروتوكول نفسه بسيط نسبيا. ومع ذلك ، فإن تحقيق أول وسم والحفاظ على هياكل الدماغ هي نقاط حرجة.لذلك ، تتطلب خطوات الكهربية وتشريح الدماغ والتقطيع عناية إضافية. سيكون إثبات الإجراء مفيدا ، وطالب الدكتوراه من مختبر Bracket. بعد تخدير أنثى الفأر الحامل ، قم بعمل شق لسحب كل من قرون الرحم باستخدام برعم قطني منقوع في محلول ملحي دافئ أو ملقط ، مع الاستيلاء بعناية على المسافات بين الأجنة.ثم ضع الأجنة على شاش مبلل. بعد فتح كيس الرحم ، قم بإزالة كل جنين. ضع الأجنة في طبق طوله 10 سنتيمترات يحتوي على HBSS مع مكملات الجلوكوز على الجليد.بالنسبة للكهربية خارج الرحم ، التقط جنينا وضعه في الحامل. ثم أدخل بعناية الشعيرات الدموية الزجاجية التي تحتوي على مزيج الحمض النووي الأخضر السريع من خلال جمجمة الجنين في البطين الجانبي ، وحقن اثنين إلى ثلاثة ميكرولترات من مزيج بلازميد الحمض النووي في كل بطين. بعد ذلك ، أمسك رأس الجنين بين أقطاب ملاقط البلاتين بالزاوية المناسبة لاستهداف منطقة الدماغ المطلوبة ، مع مواجهة الكاثود للمنطقة التي يهدف إلى نقل الحمض النووي.في الرحم الكهربائي ، بعد سحب قرون الرحم ووضع الأجنة على شاش رطب كما هو موضح سابقا ، استخدم أطراف الأصابع لتدوير الجنين بلطف داخل الرحم حتى يتم تحديد موقع خيوط lambdoidal و saggital. ثم أدخل بعناية الشعيرات الدموية الزجاجية التي تحتوي على مزيج الحمض النووي الأخضر السريع من خلال جدار الرحم وجمجمة الجنين في البطين الجانبي ، وحقن اثنين إلى ثلاثة ميكرولترات من مزيج بلازميد الحمض النووي في أحد البطينين أو كليهما حسب الرغبة بحد أقصى ميكرولترين لكل بطين. بعد الحقن ، أمسك رأس الجنين بين أقطاب ملاقط البلاتين بالزاوية المناسبة لاستهداف منطقة الدماغ المطلوبة مع الكاثود الذي يواجه المنطقة التي يقصد بها نقل الحمض النووي.بمجرد أن يتم فحص جميع الأجنة المطلوبة بالكهرباء ، استخدم برعم قطني منقوع بمحلول ملحي لوضع قرون الرحم بلطف داخل تجويف البطن. خياطة شقوق العضلات والجلد باستخدام 5-0 مادة خياطة، ثم تأمين الجرح باستخدام مشابك خياطة، وتطهير الجرح عن طريق رشه بالبيتادين. ضع الماوس مرة أخرى في قفص الاسترداد وحافظ على الدفء باستخدام ضوء الاحترار بالأشعة تحت الحمراء البعيدة لمدة 20 دقيقة على الأقل بعد الإجراء.إصلاح رأس الجنين تحت مجهر التشريح. ثم قم بإزالة الجلد في الجمجمة عن طريق القطع على طول خط الوسط بدءا من قاعدة الرأس نحو الأنف. قشر الجلد في الجمجمة أفقيا مما يجعل فجوة كبيرة بما يكفي لاستئصال الدماغ.بعد ذلك ، لإزالة الدماغ ، أدخل الطرف المغلق من مقص التشريح المعقم الذي يبدأ تحت المصباح الشمي ويتحرك نحو جذع الدماغ. ثم قطع جذع الدماغ وتقليم العديد من القطع فضفاضة من السحايا حول الدماغ. باستخدام ملعقة مثقوبة ، التقط الدماغ وأزل السائل الزائد عن طريق وضع الجزء السفلي من الملعقة على ورق المناديل الجافة.ثم ضع الدماغ في طبق أغاروز على الجليد. بعد ذلك ، باستخدام ملعقة أصغر ، امزج الأغاروز لمدة 10 ثوان حتى يبرد ، ثم قم بمناورة الدماغ إلى منتصف الطبق ووضعه أفقيا مع الجانب الظهري لأعلى والتأكد من أنه مغطى بالكامل بالأغاروز من جميع الاتجاهات. التقط كتلة الأغاروز بلطف من محطة عمل Vibratome وجفف الجزء السفلي عن طريق التدليك على المناديل الورقية.ثم ضع الكتلة على المنطقة الملصقة من حامل العينة مع الجانب السطحي من الدماغ متجها لأعلى ، ووضع حامل العينة على الجليد. اترك الغراء ليجف لمدة دقيقة واحدة. قطع الدماغ في شرائح إكليلية بزاوية 15 درجة.ثم باستخدام ملاعق نظيفة ، قم بجمع شرائح الدماغ ووضعها على غشاء PTFE مثبت في طبق زجاجي سفلي 35 ملم باستخدام Parrafin. اجمع ما يصل إلى خمس شرائح دماغية لكل غشاء. بعد ذلك ، باستخدام ماصة 200 ميكرولتر ، قم بإزالة محلول الجلوكوز HBSS الزائد من حول الشرائح الموجودة على الغشاء تاركا الشرائح شبه جافة ، ثم أضف 500 ميكرولتر من وسائط الشرائح المسخنة مسبقا مباشرة إلى المساحة الموجودة أسفل الغشاء واحتضن الشرائح عند 35 درجة مئوية بنسبة 5٪ من ثاني أكسيد الكربون.لتصوير نمو المحور العصبي، حدد موقع منطقة القشرة ذات كثافة الخلايا المنخفضة إلى المتوسطة. بينما بالنسبة لتصوير ديناميكيات مخروط النمو، حدد موقع مخروط النمو في المنطقة المباشرة للقشرة أو المنطقة تحت البطينية. بعد ذلك حدد حجم مكدس Z.بالنسبة لنمو المحور العصبي في مكدس Z كبير، قم بتعيين حجم خطوة مقداره ميكرومترين وبالنسبة لمخاريط النمو في مكدس Z أصغر، قم بتعيين حجم خطوة بمقدار ميكرومتر واحد. لتحليل البيانات، افتح ملف الصورة في فيجي بالنقر فوق ملف، ثم فتحه، وتحديد الصورة. احصل على أقصى إسقاط كثافة للفاصل الزمني من خلال النقر فوق الصورة، متبوعا بالمكدسات وإسقاط Z والحد الأقصى للكثافة في الإسقاط.انتقل عبر الفاصل الزمني وحدد موقع محور عصبي متنامي. بمجرد تحديد الموقع ، ارسم خطا عبر المحور العصبي المتنامي ، بدءا من طرف المحور العصبي في الإطار الأول واتباع المحور العصبي خلال الفاصل الزمني بأكمله. بعد ذلك ، قم بغناء المكون الإضافي kymo إعادة شريحة واسعة.اضبط مقياس الكيموجراف بالانتقال إلى الصورة، ثم الخصائص. بعد تعيين المسافة بالميكرومتر، وعرض البكسل والوقت بالثواني أو الدقائق، وارتفاع البكسل، انتقل إلى التحليل وانقر فوق قياس. لقياس حجم مخروط النمو، افتح ملف الصورة في برنامج تحليل الصور بالنقر فوق ملف وفتحه وتحديد الملف محل الاهتمام.ثم، حدد معالج إضافة أسطح جديدة في الخطوة الأولى، ضمن إعدادات الخوارزمية، حدد شريحة منطقة اهتمام فقط، وفي الخطوة الثانية، قم بقص الإطار ليناسب مخروط النمو بأكمله في جميع الإطارات. التالي في الخطوة الثالثة ، حافظ على العتبة إلى الكثافة المطلقة وفي الخطوة الرابعة ، تأكد من أن منطقة مخروط النمو بأكملها قد تم عتبتها. ثم في الخطوة الخامسة ، ضمن نوع المرشح ، حدد عدد voxels LMG إلى واحد.حدد الزر تنفيذ لتنفيذ كافة خطوات الإنشاء وإنهاء معالج إضافة أسطح جديدة. أخيرا ، في علامة التبويب إحصائيات في الجزء العلوي من نافذة المعالج ، حدد قيما ووحدة تخزين محددة ضمن علامة التبويب التفصيلية. عادة ما تظهر شرائح الدماغ المستزرعة بنجاح والمستمدة من الكهرباء في الرحم أو خارج الرحم توزيعا خلويا طبيعيا ومجموعة منظمة من الدبقية الشعاعية مع عمليات اتصال بيلو موجهة بشكل قمي.في بعض الأحيان ، لوحظ وجود اضطرابات خارج الرحم في السقالات الدبقية الشعاعية وشرائح الدماغ المستزرعة مما يجعل تلطيخ التحكم هذا أمرا مستوصيا. تظهر هنا خلية عصبية قشرية هرمية تمثيلية تعبر عن Lyn-mNeonGreen والسلوك الديناميكي لمخروط نموها. بالإضافة إلى ذلك ، تم تصنيف الخلايا العصبية باستخدام مسبار الأكتين الذي يعبر عن البلازميد لتحليل ديناميكيات الأكتين لمخاريط النمو المحورية في الموقع.كما أجريت تجارب في الموقع باستخدام فلوروفور مزدوج كري دري يعبر عن تصميم البلازميد ، حيث يمكن تنشيط فلوروفور tRFP أو ZsGreen بشكل خاص وفردي إما عن طريق المؤتلفات dre أو cre ، على التوالي في الخلايا العصبية المجاورة. من kymographs ، يمكن بسهولة الحصول على معلمات النمو الديناميكية مثل سرعة النمو للعديد من المحاور العصبية وحجم مخروط النمو بمرور الوقت. يمكن استخدام هذا لتقييم سرعة طحن الأكتين والتوازن بين الفيلوبوديا والصفائح أثناء نشاط استكشاف مخروط النمو.من المهم الحفاظ على بنية الدماغ وضبط تركيزات البلازميد لتحقيق وضع علامات متفرقة. هذا أمر بالغ الأهمية للتصور الدقيق للمحاور ومخاريط النمو في القشرة. اعتمادا على البلازما المختارة والخلفية الجينية ، يسمح هذا البروتوكول للمستخدمين بتعديل الخلايا العصبية أو البيئة التي تنمو فيها مما يسمح بمجموعة واسعة من الدراسات.من خلال تمكين الوصول عالي الدقة إلى الخلايا العصبية في الموقع ، تمكن هذه التقنية علماء الأعصاب من استجواب التفاعل الديناميكي بين مخاريط النمو ومقاييس الجهاز العصبي المركزي على المستويين المورفولوجي والجزيئي.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

تسجيلات صفيف متعدد القطب من الانهيارات الجليدية الخلايا العصبية في الثقافات عضوي النمط

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output.  During development, this activity is important for the ...

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

أساليب لدراسة التشكل متعلق بالخلايا العصبية:<em&gt; خارج الحي</em&gt; رني Electroporation في اللحاء المخي الفئران الجنينية

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

تصوير الأعصاب وظيفية عن طريق الموجات فوق الصوتية تعطيل حاجز الدم في الدماغ والتصوير بالرنين المغناطيسي المنغنيز معززة لل

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

الدماغ شريحة Biotinylation: و<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; النهج لقياس منطقة محددة بلازما بروتين غشاء الاتجار الكبار الخلايا العصبية

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

فيفو السابقين الاستعدادات للالميكعي الجهاز سليمة والإكسسوار الشم لمبة

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

الثقافات شريحة عضوي النمط لدراسة ديناميات دبقية قليلة التغصن وتكون الميالين

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

Slice It Hot: Acute Adult Brain Slicing in Physiological Temperature

شريحة ساخنة: الكبار الدماغ الحاد في درجة الحرارة الفسيولوجية التقطيع

Here we present a protocol for preparation of acute brain slices. This procedure is a critical element for electrophysiological patch-clamp experiments ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

النظام الشمي كنموذج لدراسة أنماط نمو محور عصبي ومورفولوجيا<em&gt; في فيفو</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

التصوير كاليفورنيا<sup&gt; 2+</sup&gt; حيوية في محطات المخروط مبصرة أكسون من شبكية العين الفأر

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

متزامنة<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; اختبار وظيفي اثنين من شبكية العين من قبل<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; نظام مخطط كهربية

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...