وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح DA15169 وDA035224 إلى HEM

تم تنفيذ جميع التعامل مع الحيوانات وحصاد الأنسجة وفقا للمبادئ التوجيهية للجامعة ماساتشوستس كلية الطب جنة استخدام المؤسسية رعاية الحيوان (IACUC)، وبعد الموافقة على بروتوكول # A1506 (Melikian، PI). الحلول المطلوبة السائل النخاعي الاصطناعي (ACSF) - جعل الطازجة يوميا 125 ملي مول كلوريد الصوديوم، 2.5 ملي بوكل، 1.2 ملي ناه 2 ص 4، 1.2 ملم MgCl 2، 2.4 مم CaCl 2، 26 مم 3 NaHCO، و 11 ملي الجلوكوز ملاحظة: إعداد ACSF كحل الأسهم 10X، باستثناء NaHCO 3 و الجلوكوز. جعل الحلول 1X العمل يوميا من المخزون 10X، المكمل مع الطازجة NaHCO 3 و الجلوكوز. تستكمل السكروز ACSF (SACSF) - جعل الطازجة يوميا 250 ملي يمثوارتفع، 2.5 ملي بوكل، 1.2 ملي ناه 2 ص 4، 1.2 ملم MgCl 2، 2.4 مم CaCl 2، 26 مم 3 NaHCO، و 11 ملي الجلوكوز ملاحظة: إعداد SACSF كحل الأسهم 10X، باستثناء NaHCO 3 و الجلوكوز. جعل الحلول 1X العمل يوميا من المخزون 10X، المكمل مع الطازجة NaHCO 3 و الجلوكوز. سلفو-N-hydroxysuccinyl-SS-البيوتين (سلفو-NHS-SS-البيوتين، الشركة الكيميائية بيرس) وينبغي أن تكون الحلول الأسهم 200 ملغ / مل في DMSO ومقاومة لعدة دورات تجميد / الذوبان. يتم تخزين aliquots في -20 درجة مئوية. وتحلل استر succinyl بسرعة في محلول مائي، لذلك ينبغي إعداد حلول العمل على الفور قبل التقدم بطلب إلى شرائح. شريحة تطفئوا الحل ACSF تستكمل مع 100 ملي جليكاين RIPA تحلل العازلهص 10 ملي تريس، ودرجة الحموضة 7.4، 150 ملي مول كلوريد الصوديوم، 1.0 ملي EDTA، 1٪ تريتون-X-100، 0.1٪ SDS، 1٪ نا deoxycholate RIPA مع مثبطات البروتياز (RIPA / PI) - جعل الطازجة يوميا تستكمل RIPA مع 1 ميكرومتر leupeptin، 1 ميكرومتر pepstatin، 1 ميكرومتر أبروتينين، و1 ملم phenylmethyl السلفونيل الفلورايد. 1. إعداد شرائح الدماغ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل 1X الطازجة SACSF و 1X ACSF </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هدئ SACSF على الجليد في كوب صغير. وسوف تستخدم هذه لعقد مخ الفأر المقطوع حديثا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشبع ACSF وSACSF مع الأوكسجين من قبل محتدما مع 95٪ / 5٪ O 2 / CO 2، 20 دقيقة على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وينبغي أن تستخدم P30-38 الفئران للبقاء الأنسجة الأمثل. التضحية الحيوانات عن طريق خلع عنق الرحم وقطع الرأس، وبسرعة إزالة العقول في prechilled، SACSF الاوكسيجين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مشراح تهتز، وجعل 300 ميكرون أقسام الدماغ في المنطقة ذات الاهتمام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا رغبت في ذلك، وشرائح يمكن تشريح مزيد من قبل الاستعادة لإثراء لمناطق الدماغ معينة أو الحق منفصلة وتركت نصفي الكرة الأرضية لاستخدام الرقابة وشرائح التجريبية، على التوالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة باستير النار مصقول، ونقل شرائح إلى شبكة القاع، غرف تعيين في 24 لوحات جيدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمح شرائح لاسترداد لمدة 40 دقيقة، 31 درجة مئوية في ACSF الاوكسيجين، مع المستمر، محتدما لطيف. </li></ol> 2. علاج المخدرات (إذا كان ذلك مناسبا) وشريحة Biotinylation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الانتعاش، وغسل 3X شرائح في prewarmed (37 درجة مئوية)، الاوكسيجين ACSF محتدما باستمرار مع 95٪ / 5٪ O 2 / CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة مركبات اختبار واحتضان مع الأوكسجين المستمر. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للراحة، إضافة حجم ال 1/10 من 10X المخدرات المركزة، وتخلط بواسطة قلب بلطف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يهز بلطف لوحات في حمام مائي عند درجة الحرارة المطلوبة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد العلاج من تعاطي المخدرات، بسرعةشرائح البرد عن طريق غسل 3X في ACSF الباردة الجليد. </li></ol> 3. البروتينات السطحية Biotinylate <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 1.0 ملغ / مل سلفو-NHS-SS-البيوتين في ACSF الباردة الجليد مباشرة قبل وضع العلامات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0.75 مل سلفو-NHS-SS-البيوتين إلى شرائح واحتضان شرائح على الجليد، 45 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل شرائح ثلاث مرات بسرعة مع الثلج الباردة ACSF، ثم احتضان لمدة 10 دقيقة في ACSF الباردة الجليد على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل شرائح ثلاث مرات مع الثلج الباردة العازلة شريحة إخماد واحتضان مع 0.75 مل شريحة عازلة إخماد مرتين، 25 دقيقة، على الجليد لإرواء الحرة سلفو-NHS-SS-البيوتين. </li></ol> 4. إعداد الأنسجة لست] <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل شرائح ثلاث مرات في ACSF الباردة الجليد ونقل كل شريحة إلى أنبوب microcentrifuge باستخدام باستور ماصة مصقول النار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه بلطف شريحة بواسطة الطرد المركزي 200 x ج، 1 دقيقة وبعناية المتبقية نضح ACSF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 400 ميكرولتر الجليد الباردة RIPA / PI وتفتيت الأنسجة بواسطة pipetting صعودا وهبوطا مرة واحدة من خلال نقطة P200ETTE. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل فصلها شريحة / RIPA إلى أنبوب جديد واحتضان 30 دقيقة، 4 درجات مئوية، بالتناوب، لاستكمال تحلل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه الحطام الخلوية بواسطة الطرد المركزي، 18،000 x ج، 15 دقيقة، 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد تركيزات البروتين المحللة باستخدام فحص البروتين BCA، مع ألبومين المصل البقري (BSA) كمعيار. </li></ol> 5. عزل البروتينات البيروكسيديز <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحسين الخرزة / إجمالي نسبة البروتين. ملاحظة: يمكن لمستويات البروتين التعبير الفردية تختلف على نطاق واسع في جميع أنحاء مناطق الدماغ المختلفة. ما لم يتم القبض على كل من البروتين البيروكسيديز في كمية معينة من الأنسجة المحللة، فإنه ليس من الممكن الكشف بدقة أي تغييرات محتملة في التعبير السطح. وبالتالي، لا بد من تحديد تجريبيا الأمثل حبة / إجمالي نسبة البروتين عن معين البروتين المنطقة / الدماغ قبل الإقدام على دراسة شريحة biotinylation جديدة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان 25 ميكرولتر streptavidin الخرز الاغاروز مع كمية متزايدةق من الأنسجة المحللة (المدى التقريبي 25-200 ميكروغرام)، ومن ثم المضي قدما كما هو موضح أدناه للربط، وغسل وشطف الخطوات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد نطاقات مناعيا الناتجة عنها، واختيار نسبة حبة / المحللة في مجموعة خطية ملزمة من شأنها أن تسمح الكمي دقيقة إما زيادة أو نقصان البروتين التعبير السطح. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الخرز Streptavidin-الاغاروز <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد إجمالي حجم حبة اللازمة لجميع العينات. إعداد حجم حبة كافية لهذا المبلغ زائد إضافي (أي 4 عينات واحد على 25 ميكرولتر / عينة = 100 حبات ميكرولتر + واحد = 125 حبات اضافية ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة Streptavidin الأسهم حبة وماصة للخروج المطلوب الحجم. إذا باستخدام ماصة P200، وقطع نهاية طرف لمنع انسداد أو حبة الضرر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل حبات 3 مرات في 0.5-1.0 مل RIPA / PI لإزالة المواد الحافظة، وبعد كل إضافة vortexing لRIPA وجمع حبات بين يغسل بواسطة الطرد المركزي 18،000 x ج، 1 دقيقة، في غرفة نخففature. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح قبالة عازلة بين يغسل باستخدام ماصة باستير الزجاج تعلق على قارورة فراغ. A P200 غيض من البلاستيك تعلق على نهاية ماصة باستير الزجاج يوفر تحكم أكثر دقة عند الشفط. فإنه ليس من الضروري لإزالة تماما عن المخزن المؤقت ليغسل الأولين، لأنه يخاطر الخرز الشفط إلى ماصة. بعد غسل النهائي، وإزالة أكبر قدر ممكن عازلة الزائدة دون الشفط الخرز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة RIPA / PI لتقديم حبات مرة أخرى إلى حجمها الأصلي، pipetting صعودا وهبوطا ل resuspend. تجنب vortexing لفي هذه المرحلة، والخرز سوف تتمسك جدار الأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع الخرز قسامة في أنابيب microcentrifuge باستخدام P200 مع طرف خارج. ماصة صعودا وهبوطا عدة مرات بين العينات لضمان بقاء حبات علقت بالتساوي وفرقت بين الأنابيب. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البروتينات البيروكسيديز ربط لstreptavidin الخرز <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توزيع لست] الخلية إلى الأنابيب التي تحتوي على حبات الاغاروز. للتجارب عرج<html> إعادة عينات متعددة يجري مقارنة، للتأكد من استخدام نفس كمية البروتين لكل عينة لإجراء مقارنات دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة إضافية RIPA / PI لجلب لعينات إلى الحد الأدنى من 200 ميكرولتر حجم. هذا يؤكد أن العينات سوف مزيج كاف أثناء الحضانة، وكذلك يوحد تركيزات البروتين في عينات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الأنابيب في محور دوار أنبوب وتخلط بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في أنابيب منفصلة، ​​موزعة ما يعادل حجم المحللة الكلية المستخدمة لكل عينة. بدلا من ذلك، إذا كان حجم العينة مرتفعة، جزء من اجمالي حجم المحللة يمكن حجز بدلا من ذلك، لاستيعاب كميات الحمولة القصوى على المواد الهلامية SDS-PAGE. وسوف تستخدم هذه لتطبيع التعبير السطح لمجموع كمية البروتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة إما حجم مساو من 2X أو 1/5 حجم 6X SDS-PAGE العازلة عينة وإما احتضان عند 4 درجات مئوية، بالتوازي مع عينات حبة، أو تخزينها في -20 درجة مئوية حتى يتم تحليل العينات. </li></ol></li></ol>ove_title &quot;&gt; 6. أزل وتحليل عينات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه الخرز بواسطة الطرد المركزي 18،000 x ج، 2 دقيقة، في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طاف نضح ويغسل حبات ثلاث مرات مع 0.75 مل RIPA. لتقليل الخسائر حبة، وترك حجم رأس صغير من العازلة أعلاه الخرز بين يغسل. بعد غسل النهائي، وإزالة أكبر قدر ممكن RIPA، دون الإخلال بيليه حبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أزل البروتينات البيروكسيديز من الخرز streptavidin عن طريق الحد من الربط ثاني كبريتيد. إضافة 25 ميكرولتر 2X SDS-PAGE الحد من عينة العازلة، دوامة جيدا وتدوير عينات 30 دقيقة، درجة حرارة الغرفة. ملاحظة: كثير من البروتينات الغشاء لديهم ميل عالية لتجميع عند المغلي SDS-PAGE عينة العازلة، عرقلة حركتهم كثيرا الكهربي. إذا كان هذا هو الحال بالنسبة للبروتين يجري التحقيق، وتجنب عينات التدفئة و، بدلا من ذلك، أزل ببطء في درجة حرارة الغرفة. إذا المغلي أمر ضروري للغاية (على سبيل المثال إذا بروتين آخر تقييم بالتوازي يتطلب الغليان)، samplويمكن استكمال عازلة ه مع 2 M اليوريا (تركيز النهائي) لتقليل التجميع. في حين فعالة في الحد من التجميع في بعض الحالات، وغالبا ما يهدد اليوريا مظاهر الفرقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل العينات بواسطة طخة مناعية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد مجموع العينات المحللة وتدوير بالتوازي مع عينات حبة، 30 دقيقة، درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البروتينات منفصلة على المواد الهلامية SDS-PAGE. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد بروتين (ق) من الفائدة بمقدار immunoblotting. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكون على يقين من أن يتم الكشف عن العصابات في مجموعة خطية من الكشف عن الكمي السليم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لضمان أن كاشف biotinylation لم تمكنت من الوصول إلى داخل الخلايا البروتينات عبر الخلايا التالفة / خطر. هو أفضل إنجاز ذلك عن طريق immunoblotting بشكل متواز لبروتين داخل الخلايا محددة إلى نوع من الخلايا التي يجري التحقيق فيها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس كثافة الفرقة وحساب نسبة البروتين الكثافة السطحية كنسبة مئوية من إجمالي مستوى البروتين التعبير. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Conner, S. D., Schmid, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+portals+of+entry+into+the+cell.">Regulated portals of entry into the cell.</a> Nature. 422, 37-44 (2003).</li><li>Zastrow, M., Williams, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+neuromodulation+by+receptor+membrane+traffic+in+the+endocytic+pathway.">Modulating neuromodulation by receptor membrane traffic in the endocytic pathway.</a> Neuron. 76, 22-32 (2012).</li><li>Leto, D., Saltiel, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+glucose+transport+by+insulin:+traffic+control+of+GLUT4.">Regulation of glucose transport by insulin: traffic control of GLUT4.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13, 383-396 (2012).</li><li>Liu, Y. W., Lukiyanchuk, V., Schmid, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+membrane+trafficking+defects+of+disease-associated+dynamin+2+mutations.">Common membrane trafficking defects of disease-associated dynamin 2 mutations.</a> Traffic. 12, 1620-1633 (2011).</li><li>Li, X., DiFiglia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+recycling+endosome+and+its+role+in+neurological+disorders.">The recycling endosome and its role in neurological disorders.</a> Prog. Neurobiol. , 127-141 (2012).</li><li>Sandvig, K., Pust, S., Skotland, T., van Deurs, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clathrin-independent+endocytosis:+mechanisms+and+function.">Clathrin-independent endocytosis: mechanisms and function.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 23, 413-420 (2011).</li><li>Kumari, S., Mg, S., Mayor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytosis+unplugged:+multiple+ways+to+enter+the+cell.">Endocytosis unplugged: multiple ways to enter the cell.</a> Cell Res. 20, 256-275 (2010).</li><li>Barry, M. F., Ziff, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+trafficking+and+the+plasticity+of+excitatory+synapses.">Receptor trafficking and the plasticity of excitatory synapses.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 12, 279-286 (2002).</li><li>Bredt, D. S., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPA+receptor+trafficking+at+excitatory+synapses.">AMPA receptor trafficking at excitatory synapses.</a> Neuron. 40, 361-379 (2003).</li><li>Kerchner, G. A., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silent+synapses+and+the+emergence+of+a+postsynaptic+mechanism+for+LTP.">Silent synapses and the emergence of a postsynaptic mechanism for LTP.</a> Nat. Rev. Neurosci. 9, 813-825 (2008).</li><li>Malinow, R., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPA+receptor+trafficking+and+synaptic+plasticity.">AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity.</a> Annu. Rev. Neurosci. 25, 103-126 (2002).</li><li>Borgland, S. L., Malenka, R. C., Bonci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+and+chronic+cocaine-induced+potentiation+of+synaptic+strength+in+the+ventral+tegmental+area:+electrophysiological+and+behavioral+correlates+in+individual+rats.">Acute and chronic cocaine-induced potentiation of synaptic strength in the ventral tegmental area: electrophysiological and behavioral correlates in individual rats.</a> J. Neurosci. 24, 7482-7490 (2004).</li><li>Dong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cocaine-induced+potentiation+of+synaptic+strength+in+dopamine+neurons:+Behavioral+correlates+in+GluRA(-/-)+mice.">Cocaine-induced potentiation of synaptic strength in dopamine neurons: Behavioral correlates in GluRA(-/-) mice.</a> PNAS. 101, 14282-14287 (2004).</li><li>Hyman, S. E., Malenka, R. C., Nestler, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+mechanisms+of+addiction:+the+role+of+reward-related+learning+and+memory.">Neural mechanisms of addiction: the role of reward-related learning and memory.</a> Annu. Rev. Neurosci. 29, 565-598 (2006).</li><li>Thomas, M. J., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+plasticity+in+the+mesolimbic+dopamine+system.">Synaptic plasticity in the mesolimbic dopamine system.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 358, 815-819 (2003).</li><li>Sorkina, T., Hoover, B. R., Zahniser, N. R., Sorkin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+and+protein+kinase+C-induced+internalization+of+the+dopamine+transporter+is+mediated+by+a+clathrin-dependent+mechanism.">Constitutive and protein kinase C-induced internalization of the dopamine transporter is mediated by a clathrin-dependent mechanism.</a> Traffic. 6, 157-170 (2005).</li><li>Holton, K. L., Loder, M. K., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonclassical,+distinct+endocytic+signals+dictate+constitutive+and+PKC-regulated+neurotransmitter+transporter+internalization.">Nonclassical, distinct endocytic signals dictate constitutive and PKC-regulated neurotransmitter transporter internalization.</a> Nat. Neurosci. 8, 881-888 (2005).</li><li>Loder, M. K., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dopamine+transporter+constitutively+internalizes+and+recycles+in+a+protein+kinase+C-regulated+manner+in+stably+transfected+PC12+cell+lines.">The dopamine transporter constitutively internalizes and recycles in a protein kinase C-regulated manner in stably transfected PC12 cell lines.</a> J. Biol. Chem. 278, 22168-22174 (2003).</li><li>Melikian, H. E., Buckley, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+trafficking+regulates+the+activity+of+the+human+dopamine+transporter.">Membrane trafficking regulates the activity of the human dopamine transporter.</a> J. Neurosci. 19, 7699-7710 (1999).</li><li>Daniels, G. M., Amara, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+trafficking+of+the+human+dopamine+transporter.+Clathrin-mediated+internalization+and+lysosomal+degradation+in+response+to+phorbol+esters.">Regulated trafficking of the human dopamine transporter. Clathrin-mediated internalization and lysosomal degradation in response to phorbol esters.</a> J. Biol. Chem. 274, 35794-35801 (1999).</li><li>Sorkina, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+screen+reveals+an+essential+role+of+Nedd4-2+in+dopamine+transporter+ubiquitination+and+endocytosis.">RNA interference screen reveals an essential role of Nedd4-2 in dopamine transporter ubiquitination and endocytosis.</a> J. Neurosci. 26, 8195-8205 (2006).</li><li>Eriksen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+dopamine+transporter+trafficking+in+live+neurons+by+use+of+fluorescent+cocaine+analogs.">Visualization of dopamine transporter trafficking in live neurons by use of fluorescent cocaine analogs.</a> J. Neurosci. 29, 6794-6808 (2009).</li><li>Rao, A., Simmons, D., Sorkin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+subcellular+distribution+of+endosomal+compartments+and+the+dopamine+transporter+in+dopaminergic+neurons.">Differential subcellular distribution of endosomal compartments and the dopamine transporter in dopaminergic neurons.</a> Mol. Cell Neurosci. 46, 148-158 (2011).</li><li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+channelrhodopsin-2+transgenic+mice+for+optogenetic+dissection+of+neural+circuitry+function.">Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function.</a> Nat. Methods. 8, 745-752 (2011).</li></ol>

والكتاب ليس لديهم مصالح مالية تتعارض مع هذا العمل.

على الرغم من المعرفة منذ وقت طويل أن الاتجار التقامي خطيرة الآثار إشارات متشابك في الدماغ، وقد ثبت صعوبة في قياس كميا التغيرات في تعبير البروتين في الخلايا العصبية سطح الكبار. في هذا العمل، ونحن التقرير نهجا يمكن الاعتماد عليها لتسمية بروتين السطح فيفو السابقين</em...

الاتجار التقامي هو آلية الخلوية في كل مكان أن غرامة الإيقاعات العرض غشاء البلازما من مجموعة متنوعة من البروتينات الغشاء لا يتجزأ. الإلتقام يسلم المواد الغذائية الحيوية إلى الخلايا الوسط 1 وتبلد مستقبلات الإشارات ردا على تنشيط مستقبلات 2. يمكن إعادة تدوير التقامي العودة إلى غشاء البلازما بالإضافة إلى تعزيز الإشارات الخلوية من خلال زيادة مستويات البروتين التعبير على سطح الخلية 3. علاوة على ذلك، وتورط الاضطرابات الاتجار الغشاء في العديد من الأمراض والحالات المرضية 4،5، مشددا على ضرورة التحقيق في الآليات الجزيئية التي تتحكم البروتين الاتجار التقامي. بينما العديد من البروتينات الاستفادة من آليات استيعاب الكلاسيكية التي تعتمد على بالكلاذرين، أدلة متزايدة على مدى السنوات القليلة الماضية يدل على أن آليات بالكلاذرين مستقلة متعددة التقامي تحكم المحتملة التقامي من مجموعة متزايدة منالبروتينات 6،7. وبالتالي، نمت الحاجة إلى آليات التحقيق التقامي تسهيل الاتجار في النظم الفسيولوجية ذات الصلة إلى حد كبير. في الدماغ، والاتجار التقامي من المستقبلات، وقنوات ايون والنقل العصبي له دور أساسي في إنشاء اللدونة متشابك 8-11 وردا على تعاطي المخدرات 12-15، مما يؤثر في النهاية استثارة الخلايا العصبية واستجابات متشابك. حتى الآن معظم الدراسات الاتجار العصبية تعتمد على إما أنظمة تعبير مغايرة أو الخلايا العصبية الأولية مثقف، لا هذا ولا ذاك والتي قد تعكس بشكل موثوق آليات في اللعب في الخلايا العصبية الكبار. هنا، ونحن التقرير النهج الذي يستخدم سطح biotinylation لقياس كميا مستويات البروتين السطح في شرائح الدماغ الحادة المستمدة من القوارض الكبار. باستخدام هذا النهج، فإننا نقدم البيانات التي تثبت أن نقل الدوبامين الجسم المخطط الماوس internalizes بسرعة في إعادةsponse بأن phorbol بوساطة استر بروتين كيناز C (PKC) التنشيط.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="682">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">sulfo NHS-SS-biotin</td>
			<td style="width:83px;">Pierce</td>
			<td style="width:119px;">21331</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Streptavidin agarose</td>
			<td style="width:83px;">Pierce</td>
			<td>20347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">IgG-free, Protease-free Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:83px;">Sigma</td>
			<td>A3059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Vibrating microtome sectioner</td>
			<td style="width:83px;">Various</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Shaking water bath</td>
			<td style="width:83px;">various</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Milli-cell mesh-bottomed inserts (8&#181;m pore size)</td>
			<td style="width:83px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">PI8P 012 50</td>
			<td>These can be washed by hand and re-used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

brain slice biotinylation: an ex vivo approach to measure region-specific plasma membrane protein trafficking in adult neurons

الاتجار التقامي ينظم هو الآلية المركزية تسهيل مجموعة متنوعة من الأحداث neuromodulatory، من خلال السيطرة على مستقبلات حيوي، القناة الايونية، ونقل الخلايا السطحية العرض على نطاق والوقت دقيقة. هناك تنوع واسع من الآليات التي تتحكم في الاتجار التقامي من البروتينات الفردية. وقد اعتمدت الدراسات التحقيق في الأسس الجزيئية للاتجار في المقام الأول على سطح biotinylation لقياس كميا التغيرات في غشاء البروتين التعبير سطح استجابة للمؤثرات الخارجية والتلاعب الجيني. ومع ذلك، فقد تم هذا النهج تقتصر أساسا على الخلايا المستزرعة، والتي قد لا تعكس بأمانة الآليات ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية في اللعب في الخلايا العصبية الكبار. وعلاوة على ذلك، قد نهج خلايا مستنبتة نقلل الاختلافات الخاصة بكل منطقة في آليات الاتجار. هنا، نحن تصف النهج الذي يمتد biotinylation سطح الخلية إلى إعداد شريحة حاد في الدماغ. نحنإثبات أن هذا الأسلوب يوفر نهجا عالية الدقة لقياس التغيرات السريعة في مستويات سطح بروتين الغشاء في الخلايا العصبية الكبار. هذا النهج من المرجح أن يكون أداة واسعة في مجال الاتجار التقامي العصبية.

والمنضوية نقل الدوبامين العصبية في استجابة لتفعيل PKC في خطوط الخلايا 16-20. على الرغم من العديد من التقارير التي تبين الخسائر سطح DAT بي كي سي التي يسببها في مجموعة متنوعة من خطوط الخلايا والنظم التعبير، فقد كان تحدي لتأكيد هذه النتيجة في الخلايا العصبية الدوبامين ...

Watch this Scientific Journal Video about Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons at JoVE.com

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

الاتجار غشاء الخلايا العصبية تسيطر بشكل حيوي غشاء البلازما توافر البروتين والآثار بشكل كبير العصبي. حتى الآن، فقد كان تحدي لقياس الاتجار التقامي العصبية في الخلايا العصبية الكبار. هنا، نحن تصف أو أسلوب الكمي فعالة للغاية لقياس التغيرات السريعة في سطح بروتين تعبير فيفو السابقين في شرائح الدماغ الحادة.

الدماغ شريحة Biotinylation: و<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; النهج لقياس منطقة محددة بلازما بروتين غشاء الاتجار الكبار الخلايا العصبية

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

brain-slice-biotinylation-an-ex-vivo-approach-to-measure-region

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

12.8K Views.  University of Massachusetts Medical School.  الاتجار غشاء الخلايا العصبية تسيطر بشكل حيوي غشاء البلازما توافر البروتين والآثار بشكل كبير العصبي. حتى الآن، فقد كان تحدي لقياس الاتجار التقامي العصبية في الخلايا العصبية الكبار. هنا، نحن تصف أو أسلوب الكمي فعالة للغاية لقياس التغيرات السريعة في سط...

Video: Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

تحليل كمي متشابك الحويصلة التجديد حمام سباحة في الخلايا العصبية مثقف الحبيبية للدماغ باستخدام الأصباغ FM

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an experimental approach with excellent spatial and temporal resolutions. Moreover, such an approach must also have the ability to distinguish receptors localized on the PM from those in intracellular compartments. Most importantly, detecting receptors in a single vesicle requires outstanding detection sensitivity, since each vesicle carries only a small number of receptors. Standard approaches for examining receptor trafficking include surface biotinylation followed by biochemical detection, which lacks both the necessary spatial and temporal resolutions; and fluorescence microscopy examination of immunolabeled surface receptors, which requires chemical fixation of cells and therefore lacks sufficient temporal resolution1-6 . To overcome these limitations, we and others have developed and employed a new strategy that enables visualization of the dynamic insertion of receptors into the PM with excellent spatial and temporal resolutions 7-17 . The approach includes tagging of a pH-sensitive GFP, the superecliptic pHluorin 18, to the N-terminal extracellular domain of the receptors. Superecliptic pHluorin has the unique property of being fluorescent at neutral pH and non-fluorescent at acidic pH (pH &lt; 6.0). Therefore, the tagged receptors are non-fluorescent when within the acidic lumen of intracellular trafficking vesicles or endosomal compartments, and they become readily visualized only when exposed to the extracellular neutral pH environment, on the outer surface of the PM. Our strategy consequently allows us to distinguish PM surface receptors from those within intracellular trafficking vesicles. To attain sufficient spatial and temporal resolutions, as well as the sensitivity required to study dynamic trafficking of receptors, we employed total internal reflection fluorescent microscopy (TIRFM), which enabled us to achieve the optimal spatial resolution of optical imaging (~170 nm), the temporal resolution of video-rate microscopy (30 frames/sec), and the sensitivity to detect fluorescence of a single GFP molecule. By imaging pHluorin-tagged receptors under TIRFM, we were able to directly visualize individual receptor insertion events into the PM in cultured neurons. This imaging approach can potentially be applied to any membrane protein with an extracellular domain that could be labeled with superecliptic pHluorin, and will allow dissection of the key detailed mechanisms governing insertion of different membrane proteins (receptors, ion channels, transporters, etc.) to the PM.

By tagging the extracellular domains of membrane receptors with superecliptic pHluorin, and by imaging these fusion receptors in cultured mouse neurons, we can directly visualize individual vesicular insertion events of the receptors to the plasma membrane. This technique will be instrumental in elucidating the molecular mechanisms governing receptor insertion to the plasma membrane.

التصوير pHluorin الموسومة الإدراج مستقبلات غشاء البلازما إلى الخلايا العصبية في الابتدائية الماوس مثقف

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

Using an &#945;-Bungarotoxin Binding Site Tag to Study GABA A Receptor Membrane Localization and Trafficking

It is increasingly evident that neurotransmitter receptors, including ionotropic GABA A receptors (GABAAR), exhibit highly dynamic trafficking and cell surface mobility1-7. To study receptor cell surface localization and endocytosis, the technique described here combines the use of fluorescent &#945;-bungarotoxin with cells expressing constructs containing an &#945;-bungarotoxin (Bgt) binding site (BBS). The BBS (WRYYESSLEPYPD) is based on the &#945; subunit of the muscle nicotinic acetylcholine receptor, which binds Bgt with high affinity8,9. Incorporation of the BBS site allows surface localization and measurements of receptor insertion or removal with application of exogenous fluorescent Bgt, as previously described in the tracking of GABAA and metabotropic GABAB receptors2,10. In addition to the BBS site, we inserted a pH-sensitive GFP (pHGFP11) between amino acids 4 and 5 of the mature GABAAR subunit by standard molecular biology and PCR cloning strategies (see Figure 1)12. The BBS is 3&#39; of the pH-sensitive GFP reporter, separated by a 13-amino acid alanine/proline linker. For trafficking studies described in this publication that are based on fixed samples, the pHGFP serves as a reporter of total tagged GABAAR subunit protein levels, allowing normalization of the Bgt labeled receptor population to total receptor population. This minimizes cell to cell Bgt staining signal variability resulting from higher or lower baseline expression of the tagged GABAAR subunits. Furthermore the pHGFP tag enables easy identification of construct expressing cells for live or fixed imaging experiments.

Using an &amp;#945;-Bungarotoxin Binding Site Tag to Study GABA A Receptor Membrane Localization and Trafficking

Here we demonstrate the use of fluorescent Alexa dye coupled to &#945;-bungarotoxin to measure GABA A receptor surface localization and endocytosis in hippocampal neurons. Through the use of constructs bearing a short extracellular tag that binds &#945;-bungarotoxin, analysis of plasma membrane protein endocytic trafficking can be achieved.

باستخدام α-بنغاروتوكسين تجليد الوسم الموقع لدراسة مستقبلات GABA A غشاء توطين والاتجار

It is increasingly evident that neurotransmitter receptors, including ionotropic GABA A receptors (GABAAR), exhibit highly dynamic trafficking and cell ...

Slice It Hot: Acute Adult Brain Slicing in Physiological Temperature

Here we present a protocol for preparation of acute brain slices. This procedure is a critical element for electrophysiological patch-clamp experiments that largely determines the quality of results. It has been shown that omitting the cooling step during cutting procedure is beneficial in obtaining healthy slices and cells, especially when dealing with highly myelinated brain structures from mature animals. Even though the precise mechanism whereby elevated temperature supports neural health can only be speculated upon, it stands to reason that, whenever possible, the temperature in which the slicing is performed should be close to physiological conditions to prevent temperature related artifacts. Another important advantage of this method is the simplicity of the procedure and therefore the short preparation time. In the demonstrated method adult mice are used but the same procedure can be applied with younger mice as well as rats. Also, the following patch clamp experiment is performed on horizontal cerebellar slices, but the same procedure can also be used in other planes as well as other posterior areas of the brain.

In this paper we show a method for preparing acute brain slices in physiological temperature, using a conventional physiological solution without special modifications for the cutting (such as adding sucrose) and without intracardial perfusion of the animal before slice preparation.

شريحة ساخنة: الكبار الدماغ الحاد في درجة الحرارة الفسيولوجية التقطيع

Here we present a protocol for preparation of acute brain slices. This procedure is a critical element for electrophysiological patch-clamp experiments ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal degeneration. Lack of growth cone formation, regeneration, and loss of additional myelinated axonal projections within the spinal cord greatly limits neurological recovery following injury. To assess how central myelinated axons of the spinal cord respond to injury, we developed an ex vivo living spinal cord model utilizing transgenic mice that express yellow fluorescent protein in axons and a focal and highly reproducible laser-induced spinal cord injury to document the fate of axons and myelin (lipophilic fluorescent dye Nile Red) over time using two-photon excitation time-lapse microscopy. Dynamic processes such as acute axonal injury, axonal retraction, and myelin degeneration are best studied in real-time. However, the non-focal nature of contusion-based injuries and movement artifacts encountered during in vivo spinal cord imaging make differentiating primary and secondary axonal injury responses using high resolution microscopy challenging. The ex vivo spinal cord model described here mimics several aspects of clinically relevant contusion/compression-induced axonal pathologies including axonal swelling, spheroid formation, axonal transection, and peri-axonal swelling providing a useful model to study these dynamic processes in real-time. Major advantages of this model are excellent spatiotemporal resolution that allows differentiation between the primary insult that directly injures axons and secondary injury mechanisms; controlled infusion of reagents directly to the perfusate bathing the cord; precise alterations of the environmental milieu (e.g., calcium, sodium ions, known contributors to axonal injury, but near impossible to manipulate in vivo); and murine models also offer an advantage as they provide an opportunity to visualize and manipulate genetically identified cell populations and subcellular structures. Here, we describe how to isolate and image the living spinal cord from mice to capture dynamics of acute axonal injury.

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

ل<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; يسببها الليزر اصابات الحبل الشوكي نموذج لتقييم آليات محور عصبي تنكس في الوقت الحقيقي

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated proteins and subsequent manipulation of neural activity by light. Channelrhodopsins (ChRs) are light-gated cation-channels and when fused to a fluorescent protein their expression allows for visualization and concurrent activation of specific cell types and their axonal projections in defined areas of the brain. Via stereotactic injection of viral vectors, ChR fusion proteins can be constitutively or conditionally expressed in specific cells of a defined brain region, and their axonal projections can subsequently be studied anatomically and functionally via ex vivo optogenetic activation in brain slices. This is of particular importance when aiming to understand synaptic properties of connections that could not be addressed with conventional electrical stimulation approaches, or in identifying novel afferent and efferent connectivity that was previously poorly understood. Here, a few examples illustrate how this technique can be applied to investigate these questions to elucidating fear-related circuits in the amygdala. The amygdala is a key region for acquisition and expression of fear, and storage of fear and emotional memories. Many lines of evidence suggest that the medial prefrontal cortex (mPFC) participates in different aspects of fear acquisition and extinction, but its precise connectivity with the amygdala is just starting to be understood. First, it is shown how ex vivo optogenetic activation can be used to study aspects of synaptic communication between mPFC afferents and target cells in the basolateral amygdala (BLA). Furthermore, it is illustrated how this ex vivo optogenetic approach can be applied to assess novel connectivity patterns using a group of GABAergic neurons in the amygdala, the paracapsular intercalated cell cluster (mpITC), as an example.

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are widely used to manipulate neural activity and assess the consequences for brain function. Here, a technique is outlined that&#160;upon in vivo expression of the optical activator Channelrhodopsin, allows for ex vivo analysis of synaptic properties of specific long range and local neural connections in fear-related circuits.

فيفو السابقين علم البصريات الوراثي تشريح الدوائر الخوف في الدماغ شرائح

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral tissues. The hypothalamus in the central nervous system (CNS) is the control center for energy and insulin signal response regulation. Chronic inflammation in peripheral tissues and imbalances of certain chemokines (such as CCL5, TNF&#945;, and IL-6) contribute to diabetes and obesity. However, the functional mechanism(s) connecting chemokines and hypothalamic insulin signal regulation still remain unclear.
In vitro primary neuron culture models are convenient and simple models which can be used to investigate insulin signal regulation in hypothalamic neurons. In this study, we introduced exogeneous GLUT4 protein conjugated with GFP (GFP-GLUT4) into primary hypothalamic neurons to track GLUT4 membrane translocation upon insulin stimulation. Time-lapse images of GFP-GLUT4 protein trafficking were recorded by deconvolution microscopy, which allowed users to generate high-speed, high-resolution images without damaging the neurons significantly while conducting the experiment. The contribution of CCR5 in insulin regulated GLUT4 translocation was observed in CCR5 deficient hypothalamic neurons, which were isolated and cultured from CCR5 knockout mice. Our results demonstrated that the GLUT4 membrane translocation efficiency was reduced in CCR5 deficient hypothalamic neurons after insulin stimulation.

This protocol describes a technique for observation of real-time Green Fluorescence Protein (GFP) tagged Glucose Transporter 4 (GLUT4) protein trafficking upon insulin stimulation and characterization of the biological role of CCR5 in the insulin&#8211;GLUT4 signaling pathway with Deconvolution Microscopy.

صور حية من GLUT4 البروتين الاتجار بالماوس الخلايا العصبية طائي الأولية باستخدام الفحص المجهري Deconvolution

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral ...

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, very few have been widely accepted. Here, we propose&#160;a new procedure&#160;adapted from the well-known ex vivo brain slice technique, which offers a closer in vivo-like scenario than in vitro preparations, for investigating the early events triggering cell degeneration, as observed in Alzheimer&#39;s disease (AD). This variation consists of simple and easily reproducible steps, which enable preservation of the anatomical cytoarchitecture of the selected brain region and its local functionality in a physiological milieu. Different anatomical areas can be obtained from the same brain, providing the opportunity to perform multiple experiments with the treatments in question in a site-, dose-, and time-dependent manner. Potential limitations&#160;which could affect the outcomes related to this methodology are related to the conservation of the tissue, i.e., the maintenance of its anatomical integrity during the slicing and incubation steps and the section thickness, which can influence the biochemical and immunohistochemical analysis. This approach can be employed for different purposes, such as exploring molecular mechanisms involved in physiological or pathological conditions, drug screening, or dose-response assays. Finally, this protocol could also reduce the number of animals employed in behavioral studies. The application reported here has been recently described and tested for the first time on ex vivo rat brain slices containing the basal forebrain (BF), which is one of the cerebral regions primarily affected in AD. Specifically, it has been demonstrated that the administration of a toxic peptide derived from the C-terminus of acetylcholinesterase (AChE) could prompt an AD-like profile, triggering, along the antero-posterior axis of the BF, a differential expression of proteins altered in AD, such as the alpha7 nicotinic receptor (&#945;7-nAChR), phosphorylated Tau (p-Tau), and amyloid beta (A&#946;).

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

We present a method which can&#160;provide further insights into the early events underlying neurodegeneration and based on the established ex-vivo brain technique, combining the advantages of in vivo and in vitro experiments. Moreover, it represents a unique opportunity for direct comparison of treated and untreated group in the same anatomical plane.

وثمة نهج بديل لدراسة الأحداث الرئيسية في نيوروديجينيريشن باستخدام شرائح المخ الفئران السابقين فيفو

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, ...

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model animal for endocrine research, Drosophila melanogaster, which has sophisticated genetic tools and genome information, is being increasingly used. This article describes a method for the calcium imaging of Drosophila brain explants. This method enables the detection of the direct signaling of a hormone to the brain. It is well known that many peptide hormones act through G-protein-coupled receptors (GPCRs), whose activation causes an increase in the intracellular Ca2+concentration. Neural activation also elevates intracellular Ca2+ levels, from both Ca2+ influx and the release of Ca2+ stored in the endoplasmic reticulum (ER). A calcium sensor, GCaMP, can monitor these Ca2+ changes. In this method, GCaMP is expressed in the neurons of interest, and the GCaMP-expressing larval brain is dissected and cultured ex vivo. The test peptide is then applied to the brain explant, and the fluorescent changes in GCaMP are detected using a spinning disc confocal microscope equipped with a CCD camera. Using this method, any water-soluble molecule can be tested, and various cellular events associated with neural activation can be imaged using the appropriate fluorescent indicators. Moreover, by modifying the imaging chamber, this method can be used to image other Drosophila organs or the organs of other animals.

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

This paper describes a protocol for ex vivo calcium imaging of the Drosophila brain. In this method, natural or synthetic compounds can be applied to the buffer to test their ability to activate particular neurons in the brain.

السابقين فيفو تصوير الكالسيوم لتصور استجابات الدماغ للإشارات الغدد الصماء في المورفولوجية

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

Using Near-infrared Fluorescence and High-resolution Scanning to Measure Protein Expression in the Rodent Brain

Neuroscience is the study of how cells in the brain mediate various functions. Measuring protein expression in neurons and glia is critical for the study of neuroscience as cellular function is determined by the composition and activity of cellular proteins. In this article, we describe how immunocytochemistry can be combined with near-infrared high-resolution scanning to provide a semi-quantitative measure of protein expression in distinct brain regions. This technique can be used for single or double protein expression in the same brain region. Measuring proteins in this fashion can be used to obtain a relative change in protein expression with an experimental manipulation, molecular signature of learning and memory, activity in molecular pathways, and neural activity in multiple brain regions. Using the correct proteins and statistical analysis, functional connectivity among brain regions can be determined as well. Given the ease of implementing immunocytochemistry in a laboratory, using immunocytochemistry with near-infrared high-resolution scanning can expand the ability of the neuroscientist to examine neurobiological processes at a systems level.

Here, we present a protocol that uses near-infrared dyes in conjunction with immunohistochemistry and high-resolution scanning to assay proteins in brain regions.

استخدام الاشعه تحت الحمراء القريبة والمسح عاليه الدقة لقياس تعبير البروتين في الدماغ القوارض

Neuroscience is the study of how cells in the brain mediate various functions. Measuring protein expression in neurons and glia is critical for the study ...