Name: in situ visualization of axon growth and growth cone dynamics in acute ex vivo embryonic brain slice cultures
Uploaded: 2021-10-14T15:00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures at JoVE.com

Vi vil gerne takke Maria Eugenia Bernis for at fotografere procedurerne. Vi takker også Emily Burnside, Emily Handley, Thorben Pietralla, Max Schelski og Sina Stern for at have læst og diskuteret manuskriptet. Vi er taknemmelige for vores fremragende tekniske assistenter, Jessica Gonyer, Blanca Randel og Anh-Tuan Pham. Vi anerkender den værdifulde støtte fra DZNE's lysmikroskopanlæg og dyreanlæg. Dette arbejde blev støttet af Deutsche Forschungsgesellschaft (DFG), International Foundation for Research in Paraplegia (IRP) og Wings for Life (til F.B). F.B. er medlem af excellence-klyngen ImmunoSensation2, SFB'erne 1089 og 1158, og er modtager af Roger De Spoelberch-prisen.

<ol>
	<li>Schelski, M., Bradke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+polarization:+From+spatiotemporal+signaling+to+cytoskeletal+dynamics.">Neuronal polarization: From spatiotemporal signaling to cytoskeletal dynamics.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 84, 11-28 (2017).</li><li>Lowery, L. A., Van Vactor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+trip+of+the+tip:+understanding+the+growth+cone+machinery.">The trip of the tip: understanding the growth cone machinery.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 10 (5), 332-343 (2009).</li><li>Stoeckli, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+axon+guidance:+are+we+nearly+there+yet.">Understanding axon guidance: are we nearly there yet.</a> Development. 145 (10), (2018).</li><li>Bradke, F., Dotti, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+local+actin+instability+in+axon+formation.">The role of local actin instability in axon formation.</a> Science. 283 (5409), 1931-1934 (1999).</li><li>Neukirchen, D., Bradke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+linker+proteins+regulate+neuronal+polarization+through+microtubule+and+growth+cone+dynamics.">Cytoplasmic linker proteins regulate neuronal polarization through microtubule and growth cone dynamics.</a> Journal of Neuroscience. 31 (4), 1528-1538 (2011).</li><li>Witte, H., Bradke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+cytoskeleton+during+neuronal+polarization.">The role of the cytoskeleton during neuronal polarization.</a> Current Opinion in Neurobiology. 18 (5), 479-487 (2008).</li><li>Witte, H., Neukirchen, D., Bradke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+stabilization+specifies+initial+neuronal+polarization.">Microtubule stabilization specifies initial neuronal polarization.</a> Journal of Cell Biology. 180 (3), 619-632 (2008).</li><li>Nichol, R. H., Catlett, T. S., Onesto, M. M., Hollender, D., Gomez, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+elasticity+regulates+cell-type+specific+RHOA+signaling+and+neuritogenesis+of+human+neurons.">Environmental elasticity regulates cell-type specific RHOA signaling and neuritogenesis of human neurons.</a> Stem Cell Reports. 13 (6), 1006-1021 (2019).</li><li>Santos, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+growth+of+CNS+neurons+in+three+dimensions+is+amoeboid+and+independent+of+adhesions.">Axon growth of CNS neurons in three dimensions is amoeboid and independent of adhesions.</a> Cell Reports. 32 (3), 107907 (2020).</li><li>Mitchison, T., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal+dynamics+and+nerve+growth.">Cytoskeletal dynamics and nerve growth.</a> Neuron. 1 (9), 761-772 (1988).</li><li>Lin, C. H., Thompson, C. A., Forscher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal+reorganization+underlying+growth+cone+motility.">Cytoskeletal reorganization underlying growth cone motility.</a> Current Opinion in Neurobiology. 4 (5), 640-647 (1994).</li><li>Myers, J. P., Gomez, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+adhesion+kinase+promotes+integrin+adhesion+dynamics+necessary+for+chemotropic+turning+of+nerve+growth+cones.">Focal adhesion kinase promotes integrin adhesion dynamics necessary for chemotropic turning of nerve growth cones.</a> Journal of Neuroscience. 31 (38), 13585-13595 (2011).</li><li>Turney, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+growth+factor+stimulates+axon+outgrowth+through+negative+regulation+of+growth+cone+actomyosin+restraint+of+microtubule+advance.">Nerve growth factor stimulates axon outgrowth through negative regulation of growth cone actomyosin restraint of microtubule advance.</a> Molecular Biology of the Cell. 27 (3), 500-517 (2016).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurons+derived+from+radial+glial+cells+establish+radial+units+in+neocortex.">Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex.</a> Nature. 409 (6821), 714-720 (2001).</li><li>Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+neurons+arise+in+symmetric+and+asymmetric+division+zones+and+migrate+through+specific+phases.">Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases.</a> Nature Neuroscience. 7 (2), 136-144 (2004).</li><li>Ferent, J., Zaidi, D., Francis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+control+of+radial+glia+proliferation+and+scaffolding+during+cortical+development+and+pathology.">Extracellular control of radial glia proliferation and scaffolding during cortical development and pathology.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 578341 (2020).</li><li>Dent, E. W., Gupton, S. L., Gertler, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+growth+cone+cytoskeleton+in+axon+outgrowth+and+guidance.">The growth cone cytoskeleton in axon outgrowth and guidance.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (3), (2011).</li><li>Dupraz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RhoA+controls+axon+extension+independent+of+specification+in+the+developing+brain.">RhoA controls axon extension independent of specification in the developing brain.</a> Current Biology. 29 (22), 3874-3886 (2019).</li><li>Azzarelli, R., Oleari, R., Lettieri, A., Andre, V., Cariboni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro,+ex+vivo+and+in+vivo+techniques+to+study+neuronal+migration+in+the+developing+cerebral+cortex.">In vitro, ex vivo and in vivo techniques to study neuronal migration in the developing cerebral cortex.</a> Brain Sciences. 7 (5), (2017).</li><li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+brain+slice+cultures:+A+review.">Organotypic brain slice cultures: A review.</a> Neuroscience. 305, 86-98 (2015).</li><li>Namba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pioneering+axons+regulate+neuronal+polarization+in+the+developing+cerebral+cortex.">Pioneering axons regulate neuronal polarization in the developing cerebral cortex.</a> Neuron. 81 (4), 814-829 (2014).</li><li>Shah, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rap1+GTPases+are+master+regulators+of+neural+cell+polarity+in+the+developing+neocortex.">Rap1 GTPases are master regulators of neural cell polarity in the developing neocortex.</a> Cerebral Cortex. 27 (2), 1253-1269 (2017).</li><li>Wiegreffe, C., Feldmann, S., Gaessler, S., Britsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+confocal+imaging+of+migrating+neurons+in+organotypic+slice+culture+of+embryonic+mouse+brain+using+in+utero+electroporation.">Time-lapse confocal imaging of migrating neurons in organotypic slice culture of embryonic mouse brain using in utero electroporation.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), (2017).</li><li>de Anda, F. C., Meletis, K., Ge, X., Rei, D., Tsai, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosome+motility+is+essential+for+initial+axon+formation+in+the+neocortex.">Centrosome motility is essential for initial axon formation in the neocortex.</a> Journal of Neuroscience. 30 (31), 10391-10406 (2010).</li><li>Sakakibara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+centrosome+translocation+and+microtubule+organization+in+neocortical+neurons+during+distinct+modes+of+polarization.">Dynamics of centrosome translocation and microtubule organization in neocortical neurons during distinct modes of polarization.</a> Cerebral Cortex. 24 (5), 1301-1310 (2014).</li><li>Schatzle, P., Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+microtubule+dynamics+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures.">Live imaging of microtubule dynamics in organotypic hippocampal slice cultures.</a> Methods in Cell Biology. 131, 107-126 (2016).</li><li>Qu, X., Kumar, A., Bartolini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+microtubule+dynamics+at+excitatory+presynaptic+boutons+in+primary+hippocampal+neurons+and+acute+hippocampal+slices.">Live imaging of microtubule dynamics at excitatory presynaptic boutons in primary hippocampal neurons and acute hippocampal slices.</a> STAR Protocols. 2 (1), 100342 (2021).</li><li>Tonnesen, J., Katona, G., Rozsa, B., Nagerl, U. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spine+neck+plasticity+regulates+compartmentalization+of+synapses.">Spine neck plasticity regulates compartmentalization of synapses.</a> Nature Neuroscience. 17 (5), 678-685 (2014).</li><li>Buchsbaum, I. Y., Cappello, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+migration+in+the+CNS+during+development+and+disease:+insights+from+in+vivo+and+in+vitro+models.">Neuronal migration in the CNS during development and disease: insights from in vivo and in vitro models.</a> Development. 146 (1), (2019).</li><li>Rigby, M. J., Gomez, T. M., Puglielli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+cell-axonal+growth+cone+interactions+in+neurodevelopment+and+regeneration.">Glial cell-axonal growth cone interactions in neurodevelopment and regeneration.</a> Frontiers in Neuroscience. 14, 203 (2020).</li><li>Barnes, A. P., Polleux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+axon-dendrite+polarity+in+developing+neurons.">Establishment of axon-dendrite polarity in developing neurons.</a> Annual Review of Neuroscience. 32, 347-381 (2009).</li></ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

Hvordan vækstkeglerne sanser og reagerer på deres omgivende miljø for at koordinere samtidig axonudvidelse og vejledning er stadig et spørgsmål om debat 3,18. Banebrydende undersøgelser i 2D-substrater gav et glimt af de grundlæggende molekylære mekanismer, der genererer de kræfter, der driver vækstkegledynamik under axondannelse, udvækst og navigation 2,10,11,12,19. For nylig afslørede undersøgelser i 3D-matricer, hvor stor indflydelse en tredje dimension har på vækstkeglens opførsel og følgelig i axonvækst 8,9. Ikke desto mindre mangler de indviklede mekanismer, der instruerer vækstkegledynamik in vivo, at blive grundigt undersøgt.
Forberedelse af organotypiske skivekulturer fra IUE- eller EUE-hjerner er meget udbredt og veldokumenteret. Det er blevet en gylden standard, der giver forskere mulighed for at få indsigt i udviklingen og adfærden af neuroner i det levende hjernevæv20,21. Faktisk er denne teknik blevet anvendt med succes i kombination med forskellige billeddannelsesteknikker i høj opløsning til at visualisere specifikke molekylære processer og morfologiske begivenheder in situ. Sådanne undersøgelser omfatter, men er ikke begrænset til, axondannelse og forlængelse19,22, kortikal neuronal migration 19,22,23,24, centrosomdynamik 25,26, mikrotubulidynamik27 samt den funktionelle dynamik i præ- og postsynaptiske rum28,29.
Denne protokol adresserer et hul i eksperimentel neurobiologi, visualiserer vækstkegledynamikken ved udvikling af kortikale neuroner in situ, in ex vivo akutte hjerneskivekulturer og værktøjerne til at analysere de opnåede data.
Akutte hjerneskivekulturer blev brugt til at etablere denne protokol, fordi de (1) med en vis praksis er lette at generere; 2) præsentere et tilgængeligt system til undersøgelse af vækstkegler, der er indlejret i et kvasi-fuldt fysiologisk miljø, men alligevel gennemsigtigt nok til at muliggøre levende cellebilleddannelse i høj opløsning (3) kan udvides til dets anvendelse med et utal af transgene muselinjer; (4) kombineret med enten IUE eller EUE giver praktisk talt ubegrænset potentiale til at levere molekylære værktøjer til evaluering af vækstkeglers og axoners ydeevne in vivo under tab/forstærkning af funktionsregimer sammen med fluorescerende indberettere og cytoskeletprober.
Denne metode blev beskrevet i forbindelse med både EUE og IUE. Selvom det stadig er en meget pålidelig metode, resulterede EUE i en øget forekomst af hjerneskiver, der viste et uorganiseret RG-netværk sammenlignet med dem, der blev opnået med IUE som leveringsmetode (figur 4C). Forstyrrelser i RG-arrayet påvirker stærkt neuronal migration og mønsteret af axonforlængelse30,31. Dette er nøgleparametre, der forudsiger, hvor man kan finde axoner til analyse på et givet tidspunkt, og hvilken type miljø de navigerer i. Hjerneskiver med et signifikant forstyrret RG-netværk har typisk nedsat kortikal neuronstratificering. Dette producerer igen axoner med kaotiske baner. Derfor anbefales det kraftigt at kontrollere for RG-netværkets strukturelle integritet. Interessant nok korrelerer dårlig strukturel integritet med øget alder af den embryonale hjerne. Faktisk blev sådanne virkninger hos yngre E12,5-E13,5 embryoner typisk ikke observeret19.
Den nuværende protokol er grundig og ligetil. Ikke desto mindre er der et par kritiske trin, hvor der skal udvises særlig omhu og opmærksomhed for at opnå optimale resultater. Disse er udtrykkeligt nævnt i protokollen og inkluderer (1) tuning af mængden af DNA, der anvendes i elektroporationen for at få sparsom mærkning; 2) undgå skader under udtrækning af hjerner 3) kontrol af agarosetemperaturen under hjernehuset (4) fejlfinding af den ideelle procentdel af agarose for hjerner i en given alder; og (5) udvælgelse af fluoroforer, hvis erfaring følger. Under protokoloptimering blev ydeevnen for flere fluoroforer i live-cell in situ-billeddannelse testet. Monomere GFP-varianter EGFP og NeonGreen til fremstilling af LifeAct- og Lyn-mærkede plasmider blev valgt til denne protokol (figur 5A,B). Derudover blev RFP-varianten mScarlet testet og fundet yderst egnet til denne opsætning (data ikke vist). Multimere tRFP (dimer) og ZsGreen (tetramer) (figur 5C og supplerende video 1, til højre) blev også testet. Disse hurtigt foldbare superlyse fluoroforer anbefales, når metoden kræver hurtig fluorescerende signalgenerering efter DNA-levering.
En almindelig praksis i at bruge skivekulturer er at bruge skiver fra forskellige hjerner til at teste kontrol og eksperimentelle forhold. Dette repræsenterer en iboende kilde til uønsket variabilitet. Her blev der anvendt et ekspressionssystem, der muliggør uafhængig modifikation af naboneuroner og journalisters udtryk for identifikation. Bemærk, at der i denne demonstration (figur 5C) ikke var nogen forskelle mellem neuroner, der udtrykte nogen af fluoroforerne. Men som et eksempel vil en sådan plasmidblanding kombineret med en transgen muselinje, der huser et Cre-følsomt gen, mærke med tRFP (Dre-følsomme) neuroner, der forblev som vildtype. I modsætning hertil vil ZsGreen (også Cre-følsom) mærke de rekombinerede neuroner. Derfor kunne vækstkegler af de to forskellige genotyper, og sandsynligvis også fænotyper, studeres side om side samtidigt i samme hjerneskive.
Lokalisering af axoner og vækstkegler til analyse er en vigtig overvejelse. Kortikale neuroner polariserer, mens de radialt migrerer fra den ventrikulære zone (VZ) mod den kortikale plade (CP). Under denne proces danner neuroner en førende proces (en fremtidig dendrit) og en efterfølgende proces, der bliver axonen, der til sidst slutter sig til banebrydende axoner i den mellemliggende zone (IZ) og etablerer axonkanaler32. For at fange aksonale vækstkegler blev der derfor foretaget billeddannelse på aksonale fibre i IZ, herunder axoner, der forlader CP og tidligt genererede axoner, der allerede er forbundet med aksonale bundter; eller til sidst i fibre, der krydser IZ og strækker sig under den (figur 7).
Denne protokol gør det muligt at udføre superopløsningsbilleddannelse af neuroner inden for organotypiske skiver. Historisk set var lysspredning et væsentligt problem, der blev konfronteret med billeddannelse af tykke prøver. I løbet af de sidste to årtier har omfattende fremskridt inden for optiske teknologier gjort billeddannelse af tykke prøver mulig. Her blev et langt arbejdsafstandsmål brugt til at visualisere mindre strukturer bedre, såsom vækstkegler. Uundgåeligt fanger denne protokol ikke mere detaljerede begivenheder såsom retrograd actinflow eller mikrotubuli dynamik. Målet om langdistance, som kræver en lavere numerisk blænde (NA), bevarer information fra tykke skiver. Det var dog også muligt at tilpasse denne protokol til brug med henblik på kortere arbejdsafstand. Dette krævede en jævn overførsel af skiver til en glasbundet skål for at bevare strukturel integritet. Brug af denne metode resulterede imidlertid i kortere overlevelse - ~ 15 h - på grund af tab af gasudveksling (data ikke vist). I modsætning til 2D-kulturer optager vækstkegler i 3D et større volumen og kræver bevægelsesartefaktkompensation i z-aksen. For at øge evnen til at afbilde detaljerede begivenheder skal moderne konfokal teknologi anvendes. Derfor anbefales det at bruge en hurtigscannings z-stack-motor, såsom z-Galvo, der er tilgængelig på meget følsomme konfokale mikroskoper33.
Bemærk, at denne protokol præsenterer tre hovedbegrænsninger. For det første er det ofte udfordrende at kontrollere niveauer af ekspression /antal ekspressionsceller af et givet plasmid in vivo. Dette introducerer variabilitet mellem alle skiver, selv når den samme plasmidkoncentration opretholdes. Derfor skal udvælgelsen af reguleringselementerne i de anvendte ekspressionsvektorer forudbestemmes med omhu. For det andet er det i øjeblikket ikke muligt at afbilde detaljerede hændelser ved hjælp af membranindsatser. Denne anden begrænsning kan overvindes med de metodologiske ajourføringer, der foreslås i det foregående stykke. Endelig er vækstkegler meget lysfølsomme og kan hurtigt blive fotoblegerede. Derfor kan hyppig billeddannelse af vækstkeglerne i så lidt som 5 minutter ved hjælp af laserscanningsmikroskoper ofte kollapse vækstkeglerne. I denne henseende kan nye fremskridt inden for lysarkmikroskopigenererede enheder tilpasses til langsigtet billeddannelse af hjerneskiverne34.
Protokoller af denne slags er planlagt til at åbne nye forskningsveje, hvilket giver en bedre forståelse af, hvad der kræves for en vækstkegle at læse og reagere på et komplekst in vivo-miljø , og endnu vigtigere, at optrævle mekanikken i dette sofistikerede samspil.

Neuroner er stærkt polariserede celler, der repræsenterer den grundlæggende beregningsenhed i nervesystemet. De modtager og udsender information, der er afhængig af opdeling af input- og outputsteder: dendritter og axoner, henholdsvis1. Under udviklingen strækker axoner sig, mens de navigerer i et utroligt komplekst miljø for at nå deres destination. Axonnavigation styres af vækstkeglen, en sensorisk struktur placeret ved spidsen af den udviklende axon. Vækstkeglen er ansvarlig for at detektere miljømæssige signaler og oversætte dem til den dynamiske rumlige omorganisering af dets cytoskelet 2,3. De resulterende morfo-mekaniske reaktioner instruerer vækstkeglen til at strække sig eller trække sig tilbage fra det udløsende signal, hvilket fører til specifikke axonmanøvrer.
Den nuværende forståelse af axonudvidelse og vækstkegledynamik stammer fra undersøgelser, der evaluerer axonvækst over todimensionelle (2D) substrater 2,4,5,6,7. Disse banebrydende undersøgelser identificerede sofistikeret samspil mellem vækstkegler og vækstsubstrater og afslørede slående forskelle afhængige af substrategenskaber som klæbeevne og stivhed 8,9. Ledet af disse indsigter blev ekstracellulære miljøsignaler antaget at diktere axonvækst, hvor vækstkeglecytoskelettet udførte denne vækst 2,10,11,12. Især kan neuroner udvide axoner i ikke-klæbende substrater (f.eks. Polylysin, poly-ornithin)13. Desuden kan substratstivhed påvirke axonvæksthastigheden uafhængig af celleklæbende komplekser8. Derfor kan undersøgelse af vækstkegledynamik i 2D-substrater alene ikke nøjagtigt modellere styrkebalancen, der stammer fra interaktionen mellem aksonale vækstkegler med fysiologisk relevante tredimensionelle (3D) miljøer, såsom dem, der findes in vivo.
For at overvinde begrænsningerne i 2D-assays er axonvækst og vækstkegledynamik blevet undersøgt i 3D-matricer 8,9. Disse matricer udgør mere fysiologisk kontekst, men tillader alligevel at studere celle-iboende mekanismer for axonvækst. Det muliggør vækstkegleundersøgelse på en enkeltcellet måde under en række forskellige tilstande og farmakologiske behandlinger9. I sådanne 3D-miljøer viste axoner tydelig cytoskeletal dynamik og voksede hurtigere end dem, der blev observeret i 2D-dyrkede neuroner9. Disse elegante undersøgelser viste indflydelsen af en ekstra dimension på omorganiseringen af vækstkeglecytoskelettet og følgelig på dets adfærd.
På trods af tilsyneladende fordele ved 3D-matricer i forhold til 2D-overflader til støtte for indfødt-lignende neuronal udvikling og axonvækst, forbliver de et forenklet syntetisk stillads, der ikke kan afspejle kompleksiteten af dynamik observeret i centralnervesystemet (CNS) væv. Her blev levering af reporterplasmider ved ex utero og in utero elektroporation kombineret med hjerneorganotypisk skivekultur og in situ live superopløsningsbilleddannelse for at analysere vækstkegledynamik inden for en fysiologisk kontekst. Denne metode muliggør visualisering af udviklende axoner, mens man oplever 3-dimensionaliteten af in vivo-miljøer og kompleksiteten af dens fysisk-kemiske sammensætning. Endelig beskrives brugervenlige procedurer til måling af axonvækst og vækstkegledynamik ved hjælp af almindeligt licenseret og offentligt tilgængelig software.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adson Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11006-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21202</td>
			<td>Goat Anti-Mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21236</td>
			<td>Goat Anti-Mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Vimentin antibody</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>V2258-.2ML</td>
			<td>Monoclonal mouse, clone LN-6, ascites fluid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>3864154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biozym Sieve GP Agarose</td>
			<td>Biozyme</td>
			<td>850080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Braunol, Spr&#252;hflasche</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>3864073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine (Temgesic)</td>
			<td>GEHE Pharma</td>
			<td>345928</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMZ unevirsal electrode puller</td>
			<td>Zeitz</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric razor</td>
			<td>Andes</td>
			<td>NA</td>
			<td>ProClip UltraEdge Super 2-Speed model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enrofloxacin (Baytril)</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>3543238</td>
			<td>2,5% (wt/vol)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf microloader pipette tips</td>
			<td>FischerScientific</td>
			<td>10289651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green FCF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7252-5G</td>
			<td>Dye content &#8805; 85 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji 2.1.0</td>
			<td>NIH</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji/downloads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-09</td>
			<td>ToughCut/Straight/9cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroDish Cell Culture Dish</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>FD5040-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount Aqueous Mounting Medium</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>F4680-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>MedPex</td>
			<td>3705391</td>
			<td>5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14025092</td>
			<td>calcium, magnesium, no phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Pan-Biotech</td>
			<td>P30-0711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris 9.7.2</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://imaris.oxinst.com/products/imaris-for-neuroscientists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Virbac</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotonic saline solution</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>8609261</td>
			<td>0.90%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica VT1200 S vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14048142066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 880 with Airyscan</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metacam</td>
			<td>Venusberg Apotheke</td>
			<td>8890217</td>
			<td>5 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>Janvier Labs</td>
			<td>NA</td>
			<td>C57BL/6JRj</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Adson Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11018-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Storage Jar</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>E210</td>
			<td>&#160;16.16.27</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/p/excel/cfq7ttc0k7dx?activetab=pivot:overviewtab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell Cell Culture Insert</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td>30&#160;mm, hydrophilic PTFE, 0.4&#160;&#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moria Perforated Spoons</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10370-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moria Spoon</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10321-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium, minus phenol red</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12348017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neuropan-2 supplement</td>
			<td>Pan-Biotech</td>
			<td>P07-11010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab138478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olsen-Hegar Needle Holder with Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Tub-alpha-1-Dre</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>133925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Tub-alpha-1-iCre</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>133924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Tub-alpha-1-LifeAct-GFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>175437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52858-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3813-10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCAG-lox-rox-STOP-rox-tRFP-lox-Lyn-ZsGreen</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>175438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCAG-lox-STOP-lox-Lyn-mNeonGreen</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>175257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoNozzle Kit v2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>5430-ALL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum Tweezertrodes</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>45-0487</td>
			<td>1 mm / 3 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAGEN Maxi kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reflex wound closure Clip</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500344-10</td>
			<td>7 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sekundenkleber Pattex Mini Trio</td>
			<td>Lyreco</td>
			<td>4722659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square wave electroporation system ECM830</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>W3 45-0052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile gauze</td>
			<td>Braun Askina</td>
			<td>9031216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile lubricant eye ointment</td>
			<td>Bayer Vital</td>
			<td>PZN1578675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile surgical gloves</td>
			<td>Sempermed</td>
			<td>14C0451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4621.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supramid 5-0 surgical silk sutures</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin-wall glass capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW100-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide 8 Well Glass Bottom</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80827</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ visualization of axon growth and growth cone dynamics in acute ex vivo embryonic brain slice cultures

Under neuronal udvikling navigerer axoner i det kortikale miljø for at nå deres endelige destinationer og etablere synaptiske forbindelser. Vækstkegler - de sensoriske strukturer placeret ved de distale spidser af udvikling af axoner - udfører denne proces. At studere vækstkeglens struktur og dynamik er afgørende for at forstå aksonal udvikling og interaktionerne med det omgivende centralnervesystem (CNS), der gør det muligt at danne neurale kredsløb. Dette er vigtigt, når man udtænker metoder til at reintegrere axoner i neurale kredsløb efter skade i grundforskning og prækliniske sammenhænge. Hidtil er den generelle forståelse af vækstkegledynamik primært baseret på studier af neuroner dyrket i to dimensioner (2D). Selvom det utvivlsomt er grundlæggende for den nuværende viden om vækstkeglestrukturel dynamik og reaktion på stimuli, misrepræsenterer 2D-undersøgelser det fysiologiske tredimensionelle (3D) miljø, som neuronale vækstkegler støder på i intakt CNS-væv. For nylig blev kollagengeler anvendt til at overvinde nogle af disse begrænsninger, hvilket gjorde det muligt at undersøge neuronal udvikling i 3D. Imidlertid mangler både syntetiske 2D- og 3D-miljøer signalsignaler i CNS-væv, som styrer udvidelsen og pathfinding af at udvikle axoner. Denne protokol giver en metode til at studere axoner og vækstkegler ved hjælp af organotypiske hjerneskiver, hvor udviklende axoner støder på fysiologisk relevante fysiske og kemiske signaler. Ved at kombinere finjusteret in utero og ex utero elektroporation for sparsomt at levere fluorescerende reportere sammen med superopløsningsmikroskopi præsenterer denne protokol en metodologisk pipeline til visualisering af axon- og vækstkegledynamik in situ. Desuden er en detaljeret værktøjskassebeskrivelse af analysen af langtids- og levende cellebilleddannelsesdata inkluderet.

Repræsentative resultater opnået med den beskrevne metode arbejdsgang vises. E15.5-mus blev brugt i den nuværende demonstration, selvom denne protokol let kan tilpasses stort set alle embryonale aldre, der spænder fra E11 til sen E17. I denne protokol er enten ex utero elektroporation (EUE; Figur 2A, 2C-I) eller i utero elektroporation (IUE; Figur 2B, C og 2J-Q) blev brugt til at levere plasmider ind i stamcelleneuronerne, der forer de laterale ventrikler. Disse forfædre er kilden til fremtidige kortikale projicerende neuroner (CPN) 15,16. Plasmidblandinger blev forberedt til at drive sparsom neuronspecifik ekspression af enten membranmålrettet (Lyn)-mNeonGreen (figur 1A) eller LifeAct-forbedret (E) GFP (figur 1B) for at evaluere henholdsvis den overordnede adfærd og actindynamik i vækstkegler. Desuden blev en plasmidblanding med det formål at mærke individuelle neuroner med enten turbo (t) -RFP eller zoanthus sp. (Zs) grønt fluorescerende protein (ZsGreen) (figur 1C) inkluderet. Dette letter overvågningen af vækstkegleadfærd fra uafhængige naboneuroner.
Hjernedissektion fra elektroporerede embryoner er et afgørende skridt, der skal udføres omhyggeligt for at opnå skiver af høj kvalitet, der bevarer den oprindelige hjernestruktur. Dissektionsinstrumenter og vibratom blev forberedt på forhånd og omhyggeligt ethanolsteriliseret (figur 3A,B). Dernæst blev hovederne af elektroprerede embryoner omhyggeligt dissekeret, og hjernerne blev ekstraheret. Her vises repræsentativ dissektion af hjerner fra de embryoner, der udsættes for EUE ved E15 (figur 3C-F) og E12.5 (figur 3G-J). Hjerner indkapsles straks i en agarosematrix, skæres i skiver og placeres på PTFE-membranindsatser i en bundglasskål til inkubation (figur 3K-M).
Sundhedsstatus for hjerneskiver er et vigtigt punkt for kontrol for at sikre pålidelige resultater. En visuel inspektion for enhver forurening blev udført dagligt. Derudover, når kulturen var afsluttet, fastgøres hjerneskiverne og udsættes for immunhistokemi. Her blev 4′,6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) brugt til at kontrollere den overordnede cellulære organisation og vimentinfarvning for at afsløre glial organisation; især radial glia (RG) stillads. Typisk viser succesfuldt dyrkede hjerneskiver afledt af enten IUE eller EUE normal cellulær fordeling som afsløret af DAPI og et noget organiseret array af RG med apikalt orienterede pial-kontaktprocesser17 (henholdsvis figur 4A, B). Lejlighedsvis observeres markante forstyrrelser i RG-stilladset i dyrkede hjerneskiver, især hos dem, der stammer fra EUE-elektroporation (figur 4C). Hjerneskiver med ekstremt uorganiseret RG-stillads viser nedsat neuronal migration og defekt axonvækst (ikke vist). Derfor er styring af RG-stilladset en nem postkulturmetode til at sortere de data, der er opnået fra pålidelige hjerneskiver.
Hjerneskiver afledt af enten IUE eller EUE med Lyn-mNeonGreen-ekspressiv plasmidblanding resulterer i lignende sparsom neuronmærkning. Et repræsentativt pyramideformet CPN, der udtrykker Lyn-mNeonGreen og den dynamiske opførsel af dens vækstkegle, vises som et eksempel (figur 5A og supplerende video 1, øverst til venstre). Derudover blev neuroner mærket ved hjælp af et plasmid, der udtrykte en actinsonde til at analysere actindynamikken af aksonale vækstkegler in situ (figur 5B og supplerende video 1, nederst til venstre). In situ-eksperimenter blev også udført med et dual-Cre/Dre fluorophore-ekspressor-ekspressorisk plasmiddesign (figur 1C og supplerende video 1, til højre). tRFP eller ZsGreen fluoroforer i dette plasmid kunne specifikt og individuelt aktiveres af henholdsvis Dre eller Cre rekombinerer i naboneuroner (figur 5C). Denne eksperimentelle line-up tillader side om side analyse af vækstkegler fra kontrolneuroner med nærliggende modificerede neuroner (ethvert givet tab eller gevinst af funktion). Dette omgår variabilitet som følge af brugen af forskellige skiver til testkontrol og eksperimentelle forhold.
Kymografer genereret fra den optagede film blev analyseret, hvorfra dynamiske vækstparametre som fremspringende aktivitet over tid og vækstlængde let kan opnås (figur 6A). Bemærk, at en simpel justering i den tidsmæssige opløsning af time-lapse muliggør måling af axonforlængelseshastigheden i 2 timer (figur 6A). Desuden kan variationen i vækstkeglevolumen over tid - et mål for generel vækstkegledynamisk aktivitet - let opnås, i dette tilfælde med licenseret software (figur 6B og figur 6E,F). Dette kan bruges til at evaluere hastigheden af actin løbebånd og balancen af filopodia / lamellipodia under vækstkegle udforske aktivitet.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig01.jpg"> Figur 1: Skemaer over de plasmider, der anvendes i protokollen. (A) pCAG-lox-STOP-lox-Lyn-mNeonGreen. (B) p-Tub-alpha-1-LifeAct-GFP. (C) pCAG-lox-rox-STOP-rox-tRFP-pA-lox-ZsGreen-pA. Relevante oplysninger om plasmidkomponenter og fluorofors oprindelse findes i æskerne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig02.jpg"> Figur 2: Arbejdsgang af ex utero og in utero elektroporation af E15.5 mus. (A) Opsætning af operationsstation til ex utero elektroporation. (B) Opsætning af operationsstation for in utero elektroporation. (C) Livmoderhorn trukket uden for bughulen i den auteste mus. D) Ekstraktion af et embryon fra livmodersækken. (E) Embryoofring ved fuldstændig rygmarvstranssektion via et diagonalt snit; Bemærk, at halshugning blev undgået. F) Placering af embryo i holderen og injiceret med DNA/Fast Green-blanding i venstre laterale ventrikel. (G,H) Placer embryoets hoved mellem platinpincetelektroder med katoden (rød pil) over cortex i en 60 ° vinkel. I) Placering af embryoets arme (sorte pile) uden for holderen for at forhindre, at embryoet glider under indgrebet. (J) Rotation af embryoet inde i livmodersækken for at udsætte hovedet. (K,L) Injektion af DNA/Fast Green-blanding i embryoets laterale ventrikler gennem livmodervæggen. (M) Placer embryoets hoved mellem platinpincetelektroder med en katode (rød pil) over cortex i en vinkel på 60°. (N) Sutureret muskelsnit via løbende låsesutur. (O) Sutureret hudsnit via en afbrudt sutur. P) Sikring af såret ved hjælp af kirurgiske sårclips og desinfektion ved hjælp af betadin. (Q) Placering af musen i genopretningsburet med langt infrarødt opvarmningslys. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig03.jpg"> Figur 3: Ekstraktion af E15.5 og E12.5 hjerner og organotypisk skivekulturprocedure. (A) Værktøjer, der anvendes til hjerneekstraktionsproceduren. (B) Opsætning af organotypisk kulturstation. (C-F) Ekstraktion af E15.5 hjerne. (G-J) Ekstraktion af E12.5 hjerne. Prikkede linjer fremhæver placeringen af snit. Røde pile peger i retning af at trække med tang. (K) Indlejring af hjernen i en 3 cm skål indeholdende 3% lavsmeltet agarose, hvilket efterlader et hul på 1-2 mm agaroseafstand under hjernen. (L) Indsamling af 150 μm hjerneskive. (M) Placering af hjerneskiver på PTFE-membranindsatser immobiliseret i et 35 mm fad ved hjælp af paraffinfilm (blå pil). Rød stjernemærkning angiver en given hjerneskiveopsamling fra vibratom (L) og dens overførsel til PTFE-membran (M). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig04.jpg"> Figur 4: Bevaret radial glialcellestruktur i sunde organotypiske skiver. Konfokale billeder af E17.5 hjerneskiver, der afslører RG-array (vimentin; grøn) og den samlede celleorganisation (DAPI; magenta) efter IUE (A) og EUE (B,C). Bemærk de kraftige forstyrrelser i RG-arrayet, der lejlighedsvis kan skyldes EUE (C). Forstørrelser svarer til de røde prikkede rammer i hovedfiguren: skalabjælker, 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig05.jpg"> Figur 5: In situ visualisering af vækstkegledynamikken i akutte organotypiske skiver. (A,B) Neuroner og deres tilsvarende vækstkegler mærket med henholdsvis Lyn-mNeonGreen og LifeAct-GFP. Rød stjerne, der markerer vækstkegle af Lyn-mNeonGreen, der udtrykker neuron. Blå stjerne, der markerer vækstkegle af LifeAct-GFP, der udtrykker neuron. (C) Naboneuroner mærket med det dobbelte plasmidsystem, der indeholder tRFP (magenta) og ZsGreen (grøn) og deres tilsvarende vækstkegler. Vækstkegler afbildet (højre) var uden for den fangede ramme (venstre), opnået kort efter erhvervelsen af vækstkeglens time-lapse; skalabjælker, 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig05large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig6v2.jpg"> Figur 6: Analyse af axonvæksthastighed og vækstkeglevolumen. (A) Axonsporing på en neuron, der udtrykker Lyn-mNeonGreen (øverst) og dens tilsvarende kymograf (nedenfor) genereret ved hjælp af ImageJ. (B) Rekonstruktion af z-stack-video af vækstkegle ved hjælp af billedanalysesoftwaren (øverst) og den samme vækstkegle fremhævet ved hjælp af overflademålingsværktøjet (nedenfor). (C) Grafer, der viser ændringer i væksthastigheden over tid for flere axoner. D) Axonernes gennemsnitlige væksthastighed kvantificeres i (C). (E) Graf, der viser ændringerne i vækstkeglevolumen over tid. F) Det gennemsnitlige volumen af vækstkegler kvantificeres i (E); skalabjælke, 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig6v2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig07.jpg"> Figur 7: Radial migration og neuronal polarisering af pyramidale kortikale neuroner. Diagram, der illustrerer udviklingen af pyramideformede kortikale neuroner (pink), der migrerer radialt fra den germinale ventrikulære zone (VZ) mod pia-overfladen. Styret af radiale glia-processer (grå) etablerer migrerende polariserede neuroner en førende proces, fremtidig dendrit og efterfølgende proces, fremtidig axon, der fortsætter med at strække sig nedad mod den mellemliggende zone (IZ). Stiplede røde felter repræsenterer de kortikale områder, hvor vækstkegler blev afbildet. Specifikt i IZ, subventrikulær zone (SVZ) eller sammenføjning af axonbundter (grøn). Illustrationen blev oprettet med et webbaseret værktøj, BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig07large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Plasmid</td>
			<td>Koncentration (μg/μL)</td>
			<td>Tilsigtet anvendelse</td>
		</tr>
<tr>
<td>pCAG-lox-STOP-lox-Lyn-mNeonGreen</td>
			<td>0.25</td>
			<td rowspan="3">Mærkning af membranmålrettet protein (Lyn)</td>
		</tr>
<tr>
<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>p-Tub-alpha-1-iCre</td>
			<td>0.08</td>
		</tr>
<tr>
<td>p-Tub-alpha-1-LifeAct-GFP</td>
			<td>0.125</td>
			<td>Filamentøs actin (F-actin) mærkning i vækstkegler</td>
		</tr>
<tr>
<td>pCAG-lox-rox-STOP-rox-tRFP-lox-Lyn-ZsGreen</td>
			<td>1</td>
			<td rowspan="5">Uafhængig mærkning af to populationer af naboneuroner</td>
		</tr>
<tr>
<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>p-Tub-alpha-1-iCre</td>
			<td>0.004</td>
		</tr>
<tr>
<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>p-Tub-alpha-1-Dre</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Liste over plasmider, der anvendes i protokollen. Navn, koncentration og tilsigtet anvendelse af hvert udnyttet plasmid.
Supplerende video 1: In situ visualisering af vækstkegledynamikken i akutte organotypiske skiver. Dynamikken i vækstkegler mærket med Lyn-mNeonGreen (øverst til venstre) og LifeAct-GFP (nederst til venstre). Nærliggende vækstkegler er forskelligt mærket med det dobbelte plasmidsystem, der indeholder tRFP (magenta; øverst til højre) og ZsGreen (grøn; nederst til højre). Billedinterval, 2,5 s. Skalabjælker, 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/Supplementary_Video_1.mp4" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures at JoVE.com

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

Denne protokol demonstrerer en ligetil og robust metode til at studere in situ axon vækst og vækstkegle dynamik. Den beskriver, hvordan man forbereder ex vivo fysiologisk relevante akutte hjerneskiver og giver en brugervenlig analysepipeline.

In Situ Visualisering af axonvækst og vækstkegledynamik i akutte ex vivo embryonale hjerneskivekulturer

During neuronal development, axons navigate the cortical environment to reach their final destinations and establish synaptic connections. Growth cones ...

Hvordan axoner navigerer i den komplekse matrix for centralnervesystemet er et grundlæggende spørgsmål i neurobiologi. Denne protokol muliggør undersøgelse af axonvækst og vækstkegledynamik i det fysiologiske miljø med billeddannelse i høj opløsning. Denne protokol beskriver en brugervenlig end-to-end-pipeline til levering af DNA i musens embryonale hjerne, forberedelser til organotypiske skiver af høj kvalitet og en trinvis vejledning til billedoptagelse og analyse.Selvom den oprindeligt var designet til at studere axondynamik i det embryonale centralnervesystem, kunne denne protokol justeres for at muliggøre organotypisk kultur og visualisering af axonplasticitet efter traumatiske eller patologiske tilstande. Selve protokollen er relativt ligetil. Men at opnå sin første mærkning og bevarelse af hjernestrukturer er kritiske punkter.Derfor kræver elektroporation, hjernedissektion og udskæringstrin ekstra pleje. At demonstrere proceduren vil være nyttigt, og ph.d.-studerende er fra Bracket's laboratorium. Efter bedøvelse af en gravid kvindelig mus, lav et snit for at trække begge livmoderhorn ud ved hjælp af en bomuldsknop gennemblødt i varmt saltvand eller tang, og tag forsigtigt fat i mellemrummet mellem embryonerne.Placer derefter embryonerne på våd gasbind. Efter at have skåret livmodersækken op, skal du fjerne hvert embryo. Læg embryonerne i en 10 centimeter skål indeholdende HBSS suppleret med glukose på is.For ex utero elektroporation skal du samle et embryo op og placere det i holderen. Indsæt derefter forsigtigt glaskapillæren, der indeholder DNA-hurtiggrøn blanding gennem embryokraniet i den laterale ventrikel, og injicer to til tre mikroliter af DNA-plasmidblandingen i hver ventrikel. Hold derefter embryoets hoved mellem platinpincetelektroder i den passende vinkel for at målrette mod det ønskede hjerneområde, hvor katoden vender mod det område, hvor DNA-overførslen er beregnet.For i utero elektroporation, efter at have trukket livmoderhornene ud og placeret embryonerne på en våd gasbind som tidligere påvist, skal du bruge fingerspidserne til forsigtigt at rotere embryoet inde i livmoderen, indtil lambdoidal og saggital suturer er placeret. Indsæt derefter forsigtigt glaskapillæren, der indeholder DNA-hurtiggrøn blanding gennem livmodervæggen og embryokraniet i den laterale ventrikel, og injicer to til tre mikroliter af DNA-plasmidblandingen i enten en eller begge ventrikler som ønsket med maksimalt to mikroliter pr. Ventrikel. Efter injektionen skal embryonets hoved holdes mellem platinpincetelektroder i den passende vinkel for at målrette mod det ønskede hjerneområde med katoden vendt mod det område, hvor DNA-overførslen er beregnet.Når alle de nødvendige embryoner er blevet elektroporneret, skal du bruge en saltvand gennemblødt vatpind til forsigtigt at placere livmoderhornene tilbage inde i bukhulen. Sutur muskel- og hudsnit ved hjælp af 5-0 suturmateriale, fastgør derefter såret ved hjælp af suturklip, og desinficer såret ved at sprøjte det med betadin. Placer musen tilbage i genopretningsburet, og oprethold varmen ved hjælp af et langt infrarødt opvarmningslys i mindst 20 minutter efterproceduren.Fastgør embryoets hoved under et dissektionsmikroskop. Fjern derefter huden i kraniet ved at skære langs midterlinjen startende fra bunden af hovedet mod næsen. Skræl huden i kraniet sideværts, hvilket gør et stort nok hul til, at hjernen kan udskæres.For at fjerne hjernen skal du derefter indsætte den lukkede spids af steril dissektionssaks, der starter under den olfaktoriske pære og bevæger sig mod hjernestammen. Skær derefter hjernestammen af og trim mange løse stykker meninges rundt om hjernen. Brug en perforeret ske til at samle hjernen op og fjerne den overskydende væske ved at duppe bunden af skeen mod tørt silkepapir.Placer derefter hjernen i en agaroseskål på is. Brug derefter en mindre ske bland agarose i 10 sekunder for jævn afkøling, manøvrer derefter hjernen til midten af skålen og placer den vandret med dorsalsiden op og sikrer, at den er helt dækket af agarose fra alle retninger. Tag forsigtigt agaroseblokken op fra Vibratome-arbejdsstationen, og tør bunden ved at duppe mod silkepapir.Placer derefter blokken på det limede område af prøveholderen med den rostrale side af hjernen vendt op, og læg prøveholderen på is. Lad limen tørre i et minut. Skær hjernen i koronale skiver i en vinkel på 15 grader.Brug derefter rene spatler til at samle hjerneskiverne og placere dem på en PTFE-membran, der er immobiliseret i en 35 millimeter glasbundsskål ved hjælp af Parrafin. Saml op til fem hjerneskiver pr. Membran. Derefter fjernes den overskydende HBSS-glucoseopløsning ved hjælp af en 200 mikroliterpipette fra omkring skiverne på membranen, hvilket efterlader skiverne halvtøre, tilsæt derefter 500 mikroliter forvarmede skivemedier direkte til rummet under membranen og inkuber skiverne ved 35 grader Celsius med 5% kuldioxid.Til billeddannelse af axonvækst skal du finde en cortexregion med lav til medium celletæthed. Mens du for billeddannelse af vækstkegledynamik, skal du finde en vækstkegle i cortexens umiddelbare zone eller subventrikulære zone. Definer derefter en Z-stakstørrelse.For axonvækst i en stor Z-stak skal du indstille en trinstørrelse på to mikrometer og for vækstkegler i en mindre Z-stak indstille en trinstørrelse på en mikrometer. Til dataanalyse skal du åbne billedfilen i Fiji ved at klikke på fil, derefter åbne og vælge billedet. Opnå den maksimale intensitetsprojektion af tidsforløbet ved at klikke på billedet efterfulgt af stakke, Z-projektion og maksimal intensitetsprojektion.Gå gennem tidsforløbet og find en voksende axon. Når du er placeret, skal du tegne en linje gennem den voksende axon, startende fra spidsen af axonen i den første ramme og efter axonen gennem hele tidsforløbet. Derefter synges pluginet kymo re-slice bredt.Indstil kymografens skala ved at gå til billede og derefter egenskaber. Når du har indstillet afstanden i mikrometer og pixelbredden og tiden i sekunder eller minutter og pixelhøjde, skal du gå til analysér og klik på mål. For at måle volumenet af vækstkeglen skal du åbne billedfilen i billedanalysesoftwaren ved at klikke på fil, åbne og vælge den fil, der er af interesse.Vælg derefter guiden Tilføj nye overflader i trin et, under algoritmeindstillinger, vælg kun segmenter et område af interesse, og beskær rammen i trin to, så den passer til hele vækstkeglen i alle rammer. Næste i trin tre skal du holde tærsklen til absolut intensitet og i trin fire sikre, at hele vækstkegleområdet er tærskel. Vælg derefter antal voxels LMG til en under filtertype.Vælg knappen Udfør for at udføre alle oprettelsestrinnene og afslutte guiden Tilføj nye overflader. Endelig skal du på fanen statistik øverst i guidevinduet vælge specifikke værdier og volumen under den detaljerede fane. Typisk viser succesfuldt dyrkede hjerneskiver afledt af enten in utero eller ex utero elektroporation normal cellulær fordeling og et organiseret udvalg af radial glia med apikalt orienterede pilo-kontaktprocesser.Lejlighedsvis observeres en ex utero elektroporation markerede forstyrrelser i det radiale glial stillads og dyrkede hjerneskiver, hvilket gør denne kontrolfarvning anbefalelsesværdig. En repræsentativ pyramideformet kortikal projicerende neuron, der udtrykker Lyn-mNeonGreen og den dynamiske opførsel af dens vækstkegle, er vist her. Derudover blev neuroner mærket ved hjælp af en plasmid, der udtrykte actinsonde til at analysere actindynamik af aksonale vækstkegler in situ.In situ-eksperimenter blev også udført med en dobbelt cre dre fluorophore, der udtrykte plasmiddesign, hvor tRFP eller ZsGreen fluoroforer kunne aktiveres specifikt og individuelt af henholdsvis dre eller cre rekombinaser i naboneuroner. Fra kymografer opnås let dynamiske vækstparametre som væksthastighed for flere axoner og vækstkeglevolumen over tid. Dette kan bruges til at evaluere hastigheden af actin løbebånd og balancen mellem filopodia og lamellapodia under vækstkegle udforske aktivitet.Det er vigtigt at opretholde hjernens struktur og finjustere plasmidkoncentrationer for at opnå sparsom mærkning. Dette er afgørende for nøjagtig visualisering af axoner og vækstkegler i cortex. Afhængigt af de valgte plasmaer og genetisk baggrund tillader denne protokol brugere at ændre neuroner eller det miljø, hvor de vokser, hvilket giver mulighed for en bred vifte af undersøgelser.Ved at muliggøre adgang i høj opløsning til neuroner in situ gør denne teknik det muligt for neuroforskere at forhøre den dynamiske interaktion mellem vækstkegler og centralnervesystemets målinger både på morfologisk og molekylært niveau.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output.  During development, this activity is important for the ...

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

Metoder til Undersøgelse af Neuronal morfogenese:<em&gt; Ex vivo</em&gt; RNAi Elektroporation i embryoniske murin Cerebral Cortex

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Funktionel Neuroimaging Med Ultrasonic blod-hjerne barrieren forstyrrelser og mangan-forstærket MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinylering: En<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Tilgang til Measure Region-specifikke plasmamembranprotein Trafficking in Adult neuroner

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Ex vivo Tilberedninger af den intakte Vomeronasal orgel og tilbehør lugtekolben

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

Organotypiske skivekulturer at studere oligodendrocyt Dynamics og myelinering

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

Slice It Hot: Acute Adult Brain Slicing in Physiological Temperature

Slice It Hot: Akut voksne hjerne Slicing i fysiologisk temperatur

Here we present a protocol for preparation of acute brain slices. This procedure is a critical element for electrophysiological patch-clamp experiments ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

Det olfaktoriske system som en model til at studere axonal vækstmønstre og morfologi<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imaging Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dynamics i Cone Lysmodtageren Axon Terminals i Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Samtidige<em&gt; Ex vivo</em&gt; Functional Test af to nethinder af<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogrammet System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...