In Situ Visualisering af axonvækst og vækstkegledynamik i akutte ex vivo embryonale hjerneskivekulturer

Hvordan axoner navigerer i den komplekse matrix for centralnervesystemet er et grundlæggende spørgsmål i neurobiologi. Denne protokol muliggør undersøgelse af axonvækst og vækstkegledynamik i det fysiologiske miljø med billeddannelse i høj opløsning. Denne protokol beskriver en brugervenlig end-to-end-pipeline til levering af DNA i musens embryonale hjerne, forberedelser til organotypiske skiver af høj kvalitet og en trinvis vejledning til billedoptagelse og analyse.

Selvom den oprindeligt var designet til at studere axondynamik i det embryonale centralnervesystem, kunne denne protokol justeres for at muliggøre organotypisk kultur og visualisering af axonplasticitet efter traumatiske eller patologiske tilstande. Selve protokollen er relativt ligetil. Men at opnå sin første mærkning og bevarelse af hjernestrukturer er kritiske punkter.

Derfor kræver elektroporation, hjernedissektion og udskæringstrin ekstra pleje. At demonstrere proceduren vil være nyttigt, og ph.d.-studerende er fra Bracket's laboratorium. Efter bedøvelse af en gravid kvindelig mus, lav et snit for at trække begge livmoderhorn ud ved hjælp af en bomuldsknop gennemblødt i varmt saltvand eller tang, og tag forsigtigt fat i mellemrummet mellem embryonerne.

Placer derefter embryonerne på våd gasbind. Efter at have skåret livmodersækken op, skal du fjerne hvert embryo. Læg embryonerne i en 10 centimeter skål indeholdende HBSS suppleret med glukose på is.

For ex utero elektroporation skal du samle et embryo op og placere det i holderen. Indsæt derefter forsigtigt glaskapillæren, der indeholder DNA-hurtiggrøn blanding gennem embryokraniet i den laterale ventrikel, og injicer to til tre mikroliter af DNA-plasmidblandingen i hver ventrikel. Hold derefter embryoets hoved mellem platinpincetelektroder i den passende vinkel for at målrette mod det ønskede hjerneområde, hvor katoden vender mod det område, hvor DNA-overførslen er beregnet.

For i utero elektroporation, efter at have trukket livmoderhornene ud og placeret embryonerne på en våd gasbind som tidligere påvist, skal du bruge fingerspidserne til forsigtigt at rotere embryoet inde i livmoderen, indtil lambdoidal og saggital suturer er placeret. Indsæt derefter forsigtigt glaskapillæren, der indeholder DNA-hurtiggrøn blanding gennem livmodervæggen og embryokraniet i den laterale ventrikel, og injicer to til tre mikroliter af DNA-plasmidblandingen i enten en eller begge ventrikler som ønsket med maksimalt to mikroliter pr. Ventrikel. Efter injektionen skal embryonets hoved holdes mellem platinpincetelektroder i den passende vinkel for at målrette mod det ønskede hjerneområde med katoden vendt mod det område, hvor DNA-overførslen er beregnet.

Når alle de nødvendige embryoner er blevet elektroporneret, skal du bruge en saltvand gennemblødt vatpind til forsigtigt at placere livmoderhornene tilbage inde i bukhulen. Sutur muskel- og hudsnit ved hjælp af 5-0 suturmateriale, fastgør derefter såret ved hjælp af suturklip, og desinficer såret ved at sprøjte det med betadin. Placer musen tilbage i genopretningsburet, og oprethold varmen ved hjælp af et langt infrarødt opvarmningslys i mindst 20 minutter efterproceduren.

Fastgør embryoets hoved under et dissektionsmikroskop. Fjern derefter huden i kraniet ved at skære langs midterlinjen startende fra bunden af hovedet mod næsen. Skræl huden i kraniet sideværts, hvilket gør et stort nok hul til, at hjernen kan udskæres.

For at fjerne hjernen skal du derefter indsætte den lukkede spids af steril dissektionssaks, der starter under den olfaktoriske pære og bevæger sig mod hjernestammen. Skær derefter hjernestammen af og trim mange løse stykker meninges rundt om hjernen. Brug en perforeret ske til at samle hjernen op og fjerne den overskydende væske ved at duppe bunden af skeen mod tørt silkepapir.

Placer derefter hjernen i en agaroseskål på is. Brug derefter en mindre ske bland agarose i 10 sekunder for jævn afkøling, manøvrer derefter hjernen til midten af skålen og placer den vandret med dorsalsiden op og sikrer, at den er helt dækket af agarose fra alle retninger. Tag forsigtigt agaroseblokken op fra Vibratome-arbejdsstationen, og tør bunden ved at duppe mod silkepapir.

Placer derefter blokken på det limede område af prøveholderen med den rostrale side af hjernen vendt op, og læg prøveholderen på is. Lad limen tørre i et minut. Skær hjernen i koronale skiver i en vinkel på 15 grader.

Brug derefter rene spatler til at samle hjerneskiverne og placere dem på en PTFE-membran, der er immobiliseret i en 35 millimeter glasbundsskål ved hjælp af Parrafin. Saml op til fem hjerneskiver pr. Membran. Derefter fjernes den overskydende HBSS-glucoseopløsning ved hjælp af en 200 mikroliterpipette fra omkring skiverne på membranen, hvilket efterlader skiverne halvtøre, tilsæt derefter 500 mikroliter forvarmede skivemedier direkte til rummet under membranen og inkuber skiverne ved 35 grader Celsius med 5% kuldioxid.

Til billeddannelse af axonvækst skal du finde en cortexregion med lav til medium celletæthed. Mens du for billeddannelse af vækstkegledynamik, skal du finde en vækstkegle i cortexens umiddelbare zone eller subventrikulære zone. Definer derefter en Z-stakstørrelse.

For axonvækst i en stor Z-stak skal du indstille en trinstørrelse på to mikrometer og for vækstkegler i en mindre Z-stak indstille en trinstørrelse på en mikrometer. Til dataanalyse skal du åbne billedfilen i Fiji ved at klikke på fil, derefter åbne og vælge billedet. Opnå den maksimale intensitetsprojektion af tidsforløbet ved at klikke på billedet efterfulgt af stakke, Z-projektion og maksimal intensitetsprojektion.

Gå gennem tidsforløbet og find en voksende axon. Når du er placeret, skal du tegne en linje gennem den voksende axon, startende fra spidsen af axonen i den første ramme og efter axonen gennem hele tidsforløbet. Derefter synges pluginet kymo re-slice bredt.

Indstil kymografens skala ved at gå til billede og derefter egenskaber. Når du har indstillet afstanden i mikrometer og pixelbredden og tiden i sekunder eller minutter og pixelhøjde, skal du gå til analysér og klik på mål. For at måle volumenet af vækstkeglen skal du åbne billedfilen i billedanalysesoftwaren ved at klikke på fil, åbne og vælge den fil, der er af interesse.

Vælg derefter guiden Tilføj nye overflader i trin et, under algoritmeindstillinger, vælg kun segmenter et område af interesse, og beskær rammen i trin to, så den passer til hele vækstkeglen i alle rammer. Næste i trin tre skal du holde tærsklen til absolut intensitet og i trin fire sikre, at hele vækstkegleområdet er tærskel. Vælg derefter antal voxels LMG til en under filtertype.

Vælg knappen Udfør for at udføre alle oprettelsestrinnene og afslutte guiden Tilføj nye overflader. Endelig skal du på fanen statistik øverst i guidevinduet vælge specifikke værdier og volumen under den detaljerede fane. Typisk viser succesfuldt dyrkede hjerneskiver afledt af enten in utero eller ex utero elektroporation normal cellulær fordeling og et organiseret udvalg af radial glia med apikalt orienterede pilo-kontaktprocesser.

Lejlighedsvis observeres en ex utero elektroporation markerede forstyrrelser i det radiale glial stillads og dyrkede hjerneskiver, hvilket gør denne kontrolfarvning anbefalelsesværdig. En repræsentativ pyramideformet kortikal projicerende neuron, der udtrykker Lyn-mNeonGreen og den dynamiske opførsel af dens vækstkegle, er vist her. Derudover blev neuroner mærket ved hjælp af en plasmid, der udtrykte actinsonde til at analysere actindynamik af aksonale vækstkegler in situ.

In situ-eksperimenter blev også udført med en dobbelt cre dre fluorophore, der udtrykte plasmiddesign, hvor tRFP eller ZsGreen fluoroforer kunne aktiveres specifikt og individuelt af henholdsvis dre eller cre rekombinaser i naboneuroner. Fra kymografer opnås let dynamiske vækstparametre som væksthastighed for flere axoner og vækstkeglevolumen over tid. Dette kan bruges til at evaluere hastigheden af actin løbebånd og balancen mellem filopodia og lamellapodia under vækstkegle udforske aktivitet.

Det er vigtigt at opretholde hjernens struktur og finjustere plasmidkoncentrationer for at opnå sparsom mærkning. Dette er afgørende for nøjagtig visualisering af axoner og vækstkegler i cortex. Afhængigt af de valgte plasmaer og genetisk baggrund tillader denne protokol brugere at ændre neuroner eller det miljø, hvor de vokser, hvilket giver mulighed for en bred vifte af undersøgelser.

Ved at muliggøre adgang i høj opløsning til neuroner in situ gør denne teknik det muligt for neuroforskere at forhøre den dynamiske interaktion mellem vækstkegler og centralnervesystemets målinger både på morfologisk og molekylært niveau.