In situ Visualisatie van Axon-groei en groeikegeldynamiek in acute ex vivo embryonale hersenplakculturen

Hoe axonen navigeren door de complexe matrix van het centrale zenuwstelsel is een fundamentele vraag in de neurobiologie. Dit protocol maakt de studie van axongroei en groeikegeldynamiek in de fysiologische omgeving mogelijk met hoge resolutie beeldvorming. Dit protocol beschrijft een gebruiksvriendelijke end-to-end pijplijn voor de levering van DNA in het embryonale brein van muizen, preparaten voor hoogwaardige organotypische plakjes en een stapsgewijze handleiding voor beeldverwerving en -analyse.

Hoewel oorspronkelijk ontworpen om axondynamica in het embryonale centrale zenuwstelsel te bestuderen, kon dit protocol worden aangepast om organotypische cultuur en visualisatie van axonplasticiteit na traumatische of pathologische omstandigheden mogelijk te maken. Het protocol zelf is relatief eenvoudig. Het bereiken van de eerste etikettering en het behoud van hersenstructuren zijn echter kritieke punten.

Daarom vereisen de elektroporatie, hersendissectie en snijstappen extra zorg. Het demonstreren van de procedure zal nuttig zijn en de promovendus komt uit het laboratorium van Bracket. Na het verdoven van een zwangere vrouwelijke muis, maak een incisie om beide baarmoederhoorns eruit te trekken met behulp van een wattenstaaf gedrenkt in warme zoutoplossing of tang, waarbij zorgvuldig de ruimtes tussen de embryo's worden gegrepen.

Plaats de embryo's vervolgens op nat gaas. Na het opensnijden van de baarmoederzak, verwijdert u elk embryo. Leg de embryo's in een schaal van 10 centimeter met HBSS aangevuld met glucose op ijs.

Pak voor ex utero elektroporatie een embryo op en plaats het in de houder. Breng vervolgens voorzichtig het glazen capillair met het DNA-snelle groene mengsel door de embryoschedel in de laterale ventrikel en injecteer twee tot drie microliter van het DNA-plasmidemengsel in elke ventrikel. Houd vervolgens het hoofd van het embryo tussen platina pincetelektroden in de juiste hoek om het gewenste hersengebied te richten, waarbij de kathode naar het gebied is gericht waar de DNA-overdracht is bedoeld.

Voor in utero-elektroporatie, na het uittrekken van de baarmoederhoorns en het plaatsen van de embryo's op een nat gaas zoals eerder aangetoond, gebruik vingertoppen om het embryo voorzichtig in de baarmoeder te draaien totdat de lambdoïdale en saggitale hechtingen zich bevinden. Breng vervolgens voorzichtig het glazen capillair met het DNA-snelle groene mengsel door de baarmoederwand en de embryoschedel in de laterale ventrikel in en injecteer twee tot drie microliter van het DNA-plasmidemengsel in een of beide ventrikels zoals gewenst met een maximum van twee microliter per ventrikel. Houd na de injectie het hoofd van het embryo tussen platina pincetelektroden in de juiste hoek om het gewenste hersengebied te richten met de kathode naar het gebied waar de DNA-overdracht is bedoeld.

Zodra alle benodigde embryo's zijn geëlektropoteerd, gebruikt u een met zoutoplossing gedrenkt wattenstaafje om de baarmoederhoorns voorzichtig terug in de buikholte te plaatsen. Hecht de spier- en huidincisies met behulp van 5-0 hechtmateriaal, zet de wond vervolgens vast met hechtclips en desinfecteer de wond door deze te besproeien met betadine. Plaats de muis terug in de herstelkooi en houd de warmte vast met behulp van een ver-infrarood verwarmend licht gedurende ten minste 20 minuten na de procedure.

Fixeer het hoofd van het embryo onder een dissectiemicroscoop. Verwijder vervolgens de huid in de schedel door langs de middellijn te snijden vanaf de basis van het hoofd naar de neus. Pel de huid in de schedel zijdelings af en maak een opening die groot genoeg is om de hersenen te kunnen wegsnijden.

Om vervolgens de hersenen te verwijderen, plaatst u de gesloten punt van een steriele dissectieschaar die begint onder de reukbol en naar de hersenstam beweegt. Snijd vervolgens de hersenstam af en snijd veel losse stukjes hersenvliezen rond de hersenen af. Pak met een geperforeerde lepel de hersenen op en verwijder de overtollige vloeistof door de onderkant van de lepel tegen droog tissuepapier te deppen.

Plaats vervolgens de hersenen in een agarose-schaal op ijs. Meng vervolgens met een kleinere lepel de agarose gedurende 10 seconden voor gelijkmatige afkoeling en manoeuvreer vervolgens de hersenen naar het midden van de schaal en plaats deze horizontaal met de dorsale kant naar boven en zorg ervoor dat deze volledig bedekt is met agarose vanuit alle richtingen. Pak het agaroseblok voorzichtig op van het Vibratome-werkstation en droog de bodem door tegen tissuepapier te deppen.

Plaats het blok vervolgens op het gelijmde gebied van de monsterhouder met de rostrale kant van de hersenen naar boven gericht en zet de monsterhouder op ijs. Laat de lijm een minuut drogen. Snijd de hersenen in coronale plakjes onder een hoek van 15 graden.

Gebruik vervolgens schone spatels, verzamel de hersenplakken en plaats ze op een PTFE-membraan geïmmobiliseerd in een 35 millimeter glazen bodemschaal met Parrafin. Verzamel tot vijf hersenschijfjes per membraan. Verwijder vervolgens met behulp van een pipet van 200 microliter de overtollige HBSS-glucoseoplossing rond de plakjes op het membraan en laat de plakjes halfdroog, voeg vervolgens 500 microliter voorgewarmde plakmedia rechtstreeks toe aan de ruimte onder het membraan en incubeer de plakjes bij 35 graden Celsius met 5% koolstofdioxide.

Voor het afbeelden van axongroei, lokaliseer een cortexgebied met een lage tot gemiddelde celdichtheid. Terwijl voor het afbeelden van de dynamiek van de groeikegel, een groeikegel in de onmiddellijke zone of subventriculaire zone van de cortex moet worden gelokaliseerd. Definieer vervolgens een Z-stapelgrootte.

Stel voor axongroei in een grote Z-stack een stapgrootte van twee micrometer in en voor groeikegels in een kleinere Z-stack een stapgrootte van één micrometer. Voor gegevensanalyse opent u het afbeeldingsbestand in Fiji door op bestand te klikken, vervolgens te openen en de afbeelding te selecteren. Verkrijg de maximale intensiteitsprojectie van de timelapse door op de afbeelding te klikken, gevolgd door stapels, Z-projectie en maximale intensiteitsprojectie.

Doorloop de timelapse en lokaliseer een groeiend axon. Eenmaal gelokaliseerd, trek je een lijn door het groeiende axon, beginnend vanaf de punt van het axon in het eerste frame en het axon volgend door de hele timelapse. Zing vervolgens de plug-in kymo re-slice wide.

Stel de schaal van de kymograaf in door naar afbeelding en vervolgens naar eigenschappen te gaan. Nadat u de afstand in micrometers en pixelbreedte en de tijd in seconden of minuten en pixelhoogte hebt ingesteld, gaat u naar analyseren en klikken op meten. Om het volume van de groeikegel te meten, opent u het afbeeldingsbestand in de beeldanalysesoftware door op bestand te klikken, te openen en het gewenste bestand te selecteren.

Selecteer vervolgens de wizard Nieuwe oppervlakken toevoegen in stap één, selecteer onder algoritme-instellingen alleen een interessant gebied segmenteren en in stap twee snijdt u het frame bij zodat het in alle frames op de volledige groeikegel past. Houd vervolgens in stap drie de drempel op absolute intensiteit en zorg er in stap vier voor dat het hele groeikegelgebied wordt gedrempeld. Selecteer vervolgens in stap vijf onder filtertype het aantal voxels LMG op één.

Selecteer de knop Uitvoeren om alle aanmaakstappen uit te voeren en de wizard Nieuwe oppervlakken toevoegen te beëindigen. Selecteer ten slotte op het tabblad Statistieken boven aan het wizardvenster specifieke waarden en volume onder het gedetailleerde tabblad. Typisch, met succes gekweekte hersenplakken afgeleid van ofwel in utero of ex utero elektroporatie vertonen normale cellulaire distributie en een georganiseerde reeks radiale glia met apitisch georiënteerde pilo-contactprocessen.

Af en toe wordt een ex utero elektroporatie waargenomen verstoringen in de radiale gliale steigers en gekweekte hersenplakken waardoor deze controlekleuring aan te bevelen is. Een representatief piramidaal corticale projecterend neuron dat Lyn-mNeonGreen en het dynamische gedrag van zijn groeikegel tot expressie brengt, wordt hier getoond. Bovendien werden neuronen gelabeld met behulp van een plasmide-expressie actinesonde om de actinedynamiek van axonale groeikegels in situ te analyseren.

In situ experimenten werden ook uitgevoerd met een dual cre dre fluorofoor die plasmide-ontwerp tot expressie brengt, waarbij tRFP of ZsGreen fluoroforen specifiek en individueel kunnen worden geactiveerd door dre- of cre-recombinases, respectievelijk in naburige neuronen. Uit kymografen kunnen eenvoudig dynamische groeiparameters zoals groeisnelheid voor verschillende axonen en groeikegelvolume in de loop van de tijd worden verkregen. Dit kan worden gebruikt om de snelheid van actine loopband en de balans tussen filopodia en lamellapodia tijdens groeikegel verkennen activiteit te evalueren.

Het is belangrijk om de hersenstructuur te behouden en plasmideconcentraties te verfijnen om schaarse etikettering te bereiken. Dit is cruciaal voor een nauwkeurige visualisatie van axonen en groeikegels in de cortex. Afhankelijk van de geselecteerde plasma's en genetische achtergrond, stelt dit protocol gebruikers in staat om neuronen of de omgeving waarin ze groeien te wijzigen, waardoor een breed scala aan studies mogelijk is.

Door toegang met hoge resolutie tot neuronen in situ mogelijk te maken, stelt deze techniek neurowetenschappers in staat om de dynamische interactie tussen groeikegels en de metrieken van het centrale zenuwstelsel te ondervragen, zowel op morfologisch als moleculair niveau.