Name: in situ visualization of axon growth and growth cone dynamics in acute ex vivo embryonic brain slice cultures
Uploaded: 2021-10-14T15:00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures at JoVE.com

Vi vil takke Maria Eugenia Bernis for å ha fotografert prosedyrene. Vi takker også Emily Burnside, Emily Handley, Thorben Pietralla, Max Schelski og Sina Stern for å ha lest og diskutert manuskriptet. Vi er takknemlige for våre fremragende tekniske assistenter, Jessica Gonyer, Blanca Randel og Anh-Tuan Pham. Vi anerkjenner den verdifulle støtten til DZNE's lysmikroskopanlegg og dyreanlegg. Dette arbeidet ble støttet av Deutsche Forschungsgesellschaft (DFG), International Foundation for Research in Paraplegia (IRP) og Wings for Life (til F.B). F.B. er medlem av excellence-klyngen ImmunoSensation2, SFB-ene 1089 og 1158, og er mottaker av Roger De Spoelberch-prisen.

<ol>
	<li>Schelski, M., Bradke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+polarization:+From+spatiotemporal+signaling+to+cytoskeletal+dynamics.">Neuronal polarization: From spatiotemporal signaling to cytoskeletal dynamics.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 84, 11-28 (2017).</li><li>Lowery, L. A., Van Vactor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+trip+of+the+tip:+understanding+the+growth+cone+machinery.">The trip of the tip: understanding the growth cone machinery.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 10 (5), 332-343 (2009).</li><li>Stoeckli, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+axon+guidance:+are+we+nearly+there+yet.">Understanding axon guidance: are we nearly there yet.</a> Development. 145 (10), (2018).</li><li>Bradke, F., Dotti, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+local+actin+instability+in+axon+formation.">The role of local actin instability in axon formation.</a> Science. 283 (5409), 1931-1934 (1999).</li><li>Neukirchen, D., Bradke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+linker+proteins+regulate+neuronal+polarization+through+microtubule+and+growth+cone+dynamics.">Cytoplasmic linker proteins regulate neuronal polarization through microtubule and growth cone dynamics.</a> Journal of Neuroscience. 31 (4), 1528-1538 (2011).</li><li>Witte, H., Bradke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+cytoskeleton+during+neuronal+polarization.">The role of the cytoskeleton during neuronal polarization.</a> Current Opinion in Neurobiology. 18 (5), 479-487 (2008).</li><li>Witte, H., Neukirchen, D., Bradke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+stabilization+specifies+initial+neuronal+polarization.">Microtubule stabilization specifies initial neuronal polarization.</a> Journal of Cell Biology. 180 (3), 619-632 (2008).</li><li>Nichol, R. H., Catlett, T. S., Onesto, M. M., Hollender, D., Gomez, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+elasticity+regulates+cell-type+specific+RHOA+signaling+and+neuritogenesis+of+human+neurons.">Environmental elasticity regulates cell-type specific RHOA signaling and neuritogenesis of human neurons.</a> Stem Cell Reports. 13 (6), 1006-1021 (2019).</li><li>Santos, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+growth+of+CNS+neurons+in+three+dimensions+is+amoeboid+and+independent+of+adhesions.">Axon growth of CNS neurons in three dimensions is amoeboid and independent of adhesions.</a> Cell Reports. 32 (3), 107907 (2020).</li><li>Mitchison, T., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal+dynamics+and+nerve+growth.">Cytoskeletal dynamics and nerve growth.</a> Neuron. 1 (9), 761-772 (1988).</li><li>Lin, C. H., Thompson, C. A., Forscher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal+reorganization+underlying+growth+cone+motility.">Cytoskeletal reorganization underlying growth cone motility.</a> Current Opinion in Neurobiology. 4 (5), 640-647 (1994).</li><li>Myers, J. P., Gomez, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+adhesion+kinase+promotes+integrin+adhesion+dynamics+necessary+for+chemotropic+turning+of+nerve+growth+cones.">Focal adhesion kinase promotes integrin adhesion dynamics necessary for chemotropic turning of nerve growth cones.</a> Journal of Neuroscience. 31 (38), 13585-13595 (2011).</li><li>Turney, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+growth+factor+stimulates+axon+outgrowth+through+negative+regulation+of+growth+cone+actomyosin+restraint+of+microtubule+advance.">Nerve growth factor stimulates axon outgrowth through negative regulation of growth cone actomyosin restraint of microtubule advance.</a> Molecular Biology of the Cell. 27 (3), 500-517 (2016).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurons+derived+from+radial+glial+cells+establish+radial+units+in+neocortex.">Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex.</a> Nature. 409 (6821), 714-720 (2001).</li><li>Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+neurons+arise+in+symmetric+and+asymmetric+division+zones+and+migrate+through+specific+phases.">Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases.</a> Nature Neuroscience. 7 (2), 136-144 (2004).</li><li>Ferent, J., Zaidi, D., Francis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+control+of+radial+glia+proliferation+and+scaffolding+during+cortical+development+and+pathology.">Extracellular control of radial glia proliferation and scaffolding during cortical development and pathology.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 578341 (2020).</li><li>Dent, E. W., Gupton, S. L., Gertler, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+growth+cone+cytoskeleton+in+axon+outgrowth+and+guidance.">The growth cone cytoskeleton in axon outgrowth and guidance.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (3), (2011).</li><li>Dupraz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RhoA+controls+axon+extension+independent+of+specification+in+the+developing+brain.">RhoA controls axon extension independent of specification in the developing brain.</a> Current Biology. 29 (22), 3874-3886 (2019).</li><li>Azzarelli, R., Oleari, R., Lettieri, A., Andre, V., Cariboni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro,+ex+vivo+and+in+vivo+techniques+to+study+neuronal+migration+in+the+developing+cerebral+cortex.">In vitro, ex vivo and in vivo techniques to study neuronal migration in the developing cerebral cortex.</a> Brain Sciences. 7 (5), (2017).</li><li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+brain+slice+cultures:+A+review.">Organotypic brain slice cultures: A review.</a> Neuroscience. 305, 86-98 (2015).</li><li>Namba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pioneering+axons+regulate+neuronal+polarization+in+the+developing+cerebral+cortex.">Pioneering axons regulate neuronal polarization in the developing cerebral cortex.</a> Neuron. 81 (4), 814-829 (2014).</li><li>Shah, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rap1+GTPases+are+master+regulators+of+neural+cell+polarity+in+the+developing+neocortex.">Rap1 GTPases are master regulators of neural cell polarity in the developing neocortex.</a> Cerebral Cortex. 27 (2), 1253-1269 (2017).</li><li>Wiegreffe, C., Feldmann, S., Gaessler, S., Britsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+confocal+imaging+of+migrating+neurons+in+organotypic+slice+culture+of+embryonic+mouse+brain+using+in+utero+electroporation.">Time-lapse confocal imaging of migrating neurons in organotypic slice culture of embryonic mouse brain using in utero electroporation.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), (2017).</li><li>de Anda, F. C., Meletis, K., Ge, X., Rei, D., Tsai, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosome+motility+is+essential+for+initial+axon+formation+in+the+neocortex.">Centrosome motility is essential for initial axon formation in the neocortex.</a> Journal of Neuroscience. 30 (31), 10391-10406 (2010).</li><li>Sakakibara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+centrosome+translocation+and+microtubule+organization+in+neocortical+neurons+during+distinct+modes+of+polarization.">Dynamics of centrosome translocation and microtubule organization in neocortical neurons during distinct modes of polarization.</a> Cerebral Cortex. 24 (5), 1301-1310 (2014).</li><li>Schatzle, P., Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+microtubule+dynamics+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures.">Live imaging of microtubule dynamics in organotypic hippocampal slice cultures.</a> Methods in Cell Biology. 131, 107-126 (2016).</li><li>Qu, X., Kumar, A., Bartolini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+microtubule+dynamics+at+excitatory+presynaptic+boutons+in+primary+hippocampal+neurons+and+acute+hippocampal+slices.">Live imaging of microtubule dynamics at excitatory presynaptic boutons in primary hippocampal neurons and acute hippocampal slices.</a> STAR Protocols. 2 (1), 100342 (2021).</li><li>Tonnesen, J., Katona, G., Rozsa, B., Nagerl, U. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spine+neck+plasticity+regulates+compartmentalization+of+synapses.">Spine neck plasticity regulates compartmentalization of synapses.</a> Nature Neuroscience. 17 (5), 678-685 (2014).</li><li>Buchsbaum, I. Y., Cappello, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+migration+in+the+CNS+during+development+and+disease:+insights+from+in+vivo+and+in+vitro+models.">Neuronal migration in the CNS during development and disease: insights from in vivo and in vitro models.</a> Development. 146 (1), (2019).</li><li>Rigby, M. J., Gomez, T. M., Puglielli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+cell-axonal+growth+cone+interactions+in+neurodevelopment+and+regeneration.">Glial cell-axonal growth cone interactions in neurodevelopment and regeneration.</a> Frontiers in Neuroscience. 14, 203 (2020).</li><li>Barnes, A. P., Polleux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+axon-dendrite+polarity+in+developing+neurons.">Establishment of axon-dendrite polarity in developing neurons.</a> Annual Review of Neuroscience. 32, 347-381 (2009).</li></ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Hvordan vekstkjeglene sanser og reagerer på omgivelsene for å koordinere samtidig aksonforlengelse og veiledning, er fortsatt et spørsmål om debatt 3,18. Banebrytende studier i 2D-substrater ga et glimt inn i de grunnleggende molekylære mekanismene som genererte kreftene som driver vekstkjegledynamikken under axondannelse, utvekst og navigasjon 2,10,11,12,19. Mer nylig viste studier i 3D-matriser hvor mye innflytelse en tredje dimensjon har i oppførselen til vekstkjeglen og følgelig i axonvekst 8,9. Likevel gjenstår de intrikate mekanismene som instruerer vekstkjegledynamikken in vivo å bli grundig undersøkt.
Forberedelse av organotypiske skivekulturer fra IUE- eller EUE-hjerner er mye brukt og godt dokumentert. Det har blitt en gylden standard som gjør det mulig for forskere å få innsikt i utviklingen og oppførselen til nevroner i det levende hjernevevet20,21. Faktisk har denne teknikken blitt brukt i kombinasjon med ulike høyoppløselige avbildningsteknikker for å visualisere spesifikke molekylære prosesser og morfologiske hendelser in situ. Slike studier inkluderer, men er ikke begrenset til axondannelse og forlengelse19,22, kortikale nevronale migrasjon 19,22,23,24, sentrosomdynamikk 25,26, mikrotubuldynamikk27, samt funksjonell dynamikk i før- og postsynaptiske rom28,29.
Denne protokollen tar for seg et gap i eksperimentell nevrobiologi, visualiserer vekstkjegledynamikken ved å utvikle kortikale nevroner in situ, i ex vivo akutte hjerneskivekulturer, og verktøyene for å analysere de oppnådde dataene.
Akutte hjerneskivekulturer ble brukt til å etablere denne protokollen fordi de (1) med litt praksis er enkle å generere; (2) presentere et tilgjengelig system for å studere vekstkjegler innebygd i et kvasi-fullt fysiologisk miljø, men gjennomsiktig nok til å tillate høyoppløselig levende celleavbildning; (3) kan utvides for bruk med et utall transgene muselinjer; (4) kombinert med enten IUE eller EUE, gir praktisk talt ubegrenset potensial til å levere molekylære verktøy for å evaluere ytelsen til vekstkjegler og aksoner in vivo under tap / gevinst av funksjonsregimer, sammen med fluorescerende reportere og cytoskeleton sonder.
Denne metodikken ble beskrevet i sammenheng med både EUE og IUE. Selv om EUE fortsatt var en svært pålitelig metode, resulterte det i en økt forekomst av hjerneskiver som viste et uorganisert RG-nettverk sammenlignet med de som ble oppnådd med IUE som leveringsmetode (figur 4C). Forstyrrelser i RG-rekken påvirker sterkt nevronmigrasjon og mønsteret av axonforlengelse30,31. Dette er nøkkelparametere som forutsier hvor du finner axoner for analyse på et gitt tidspunkt og hvilken type miljø de navigerer i. Hjerneskiver med et betydelig forstyrret RG-nettverk har vanligvis svekket kortikale nevronstratifisering. Dette produserer i sin tur axoner med kaotiske baner. Derfor anbefales det sterkt å kontrollere for RG-nettverkets strukturelle integritet. Interessant nok korrelerer dårlig strukturell integritet med økt alder av den embryonale hjernen. Faktisk ble slike effekter hos yngre E12.5-E13.5 embryoer vanligvis ikke observert19.
Den nåværende protokollen er grundig og grei. Likevel er det noen få kritiske trinn der spesiell forsiktighet og oppmerksomhet må tas for å oppnå optimale resultater. Disse har blitt uttrykkelig notert i protokollen og inkluderer (1) tuning mengden DNA som brukes i elektroporasjonen for å få sparsommerking; (2) unngå skade under utvinning av hjerner; (3) kontrollere temperaturen på agarose under hjernehus; (4) feilsøke den ideelle prosentandelen av agarose for hjerner i en gitt alder; og (5) utvalg av fluoroforer, hvis erfaring følger. Under protokolloptimalisering ble ytelsen til flere fluoroforer i levende celle in situ avbildning testet. Monomeriske GFP-varianter EGFP og NeonGreen for fremstilling av LifeAct- og Lyn-merkede plasmider ble valgt for denne protokollen (figur 5A,B). I tillegg ble RFP-varianten mScarlet testet og funnet svært egnet for dette oppsettet (data ikke vist). Multimerisk tRFP (dimer) og ZsGreen (tetramer) (figur 5C og tilleggsvideo 1, høyre) ble også testet. Disse raskt sammenleggbare super-lyse fluoroforene anbefales når metoden krever rask fluorescerende signalgenerering etter DNA-levering.
En vanlig praksis med å bruke skivekulturer er å bruke skiver fra forskjellige hjerner for å teste kontroll og eksperimentelle forhold. Dette representerer en iboende kilde til uønsket variasjon. Her ble det brukt et uttrykkssystem som muliggjør uavhengig modifikasjon av nærliggende nevroner og reporteres uttrykk for identifikasjon. Merk at i denne demonstrasjonen (figur 5C) var det ingen forskjeller mellom nevroner som uttrykte noen av fluoroforene. Men som et eksempel vil en slik plasmidblanding kombinert med en transgen muselinje som skjuler et Cre-sensitivt gen, merke med tRFP (Dre-sensitive) nevroner som forble som vill type. I kontrast vil ZsGreen (også Cre-sensitive) merke de rekombinerte nevronene. Derfor kan vekstkjegler av de to forskjellige genotypene, og sannsynligvis også fenotyper, studeres side om side samtidig i samme hjerneskive.
Lokalisering av aksoner og vekstkjegler for analyse er et viktig hensyn. Kortikale nevroner polariserer mens de radialt migrerer fra ventrikkelsonen (VZ) mot kortikale platen (CP). I løpet av denne prosessen danner nevroner en ledende prosess (en fremtidig dendrit) og en etterfølgende prosess som vil bli axon, og til slutt bli med banebrytende axoner i mellomsonen (IZ), etablere aksonkanaler32. Derfor, for å fange axonal vekst kjegler, ble avbildning gjort på axonale fibre i IZ, inkludert axoner som forlater CP og tidlig genererte aksoner som allerede er forbundet med axonale bunter; eller til slutt, i fibre som krysser IZ og strekker seg under den (figur 7).
Denne protokollen gjør det mulig å utføre superoppløsningsavbildning av nevroner i organotypiske skiver. Historisk sett var lysspredning et betydelig problem som oppstod ved avbildning av tykke prøver. I løpet av de siste to tiårene har omfattende fremskritt innen optisk teknologi gjort avbildning av tykke prøver mulig. Her ble et langt mål for arbeidsavstand brukt til å visualisere mindre strukturer bedre, for eksempel vekstkjegler. Uunngåelig fanger ikke denne protokollen opp mer detaljerte hendelser som retrograd actin flow eller mikrotubuldynamikk. Langdistansemålet, som krever en lavere numerisk blenderåpning (NA), bevarer informasjon fra tykke skiver. Det var imidlertid også mulig å tilpasse denne protokollen til bruk med mål om kortere arbeidsavstand. Dette krevde en jevn overføring av skiver til en glassbunnet tallerken for å bevare strukturell integritet. Bruk av denne metoden resulterte imidlertid i kortere overlevelse - ~ 15 h - på grunn av tap av gassutveksling (data ikke vist). I motsetning til 2D-kulturer opptar vekstkjegler i 3D et større volum og krever bevegelsesartefaktkompensasjon i z-aksen. For å øke muligheten til å bildevise detaljerte hendelser, må moderne konfektteknologi benyttes. Derfor anbefales det å bruke en hurtigskanning z-stack motor, for eksempel z-Galvo tilgjengelig på svært følsomme konfokale mikroskoper33.
Vær oppmerksom på at denne protokollen presenterer tre hovedbegrensninger. For det første er det ofte utfordrende å kontrollere nivåer av uttrykk / antall uttrykkende celler av en gitt plasmid in vivo. Dette introduserer variasjon mellom alle skiver selv når du opprettholder samme plasmidkonsentrasjon. Derfor må valget av reguleringselementene i uttrykksvektorene som brukes, forhåndsbestemmes med forsiktighet. For det andre er det for øyeblikket ikke mulig å forestille seg detaljerte hendelser ved hjelp av membraninnlegg. Denne andre begrensningen kan overvinnes med de metodologiske oppdateringene som ble foreslått i forrige avsnitt. Til slutt er vekstkjegler svært lysfølsomme og kan raskt bli fotobleached. Derfor kan hyppig avbildning av vekstkjegler, i så lite som 5 minutter ved hjelp av laserskanningsmikroskoper ofte kollapse vekstkjeglene. I denne forbindelse kan ny fremgang i lysarkmikroskopigenererte enheter tilpasses for langsiktig avbildning av hjerneskivene34.
Protokoller av dette som er tenkt å åpne nye forskningsveier, slik at en bedre forståelse av hva som skal til for at en vekstkjegle skal lese og reagere mot et komplekst in vivo-miljø , og enda viktigere, å avdekke mekanikken i dette sofistikerte samspillet.

Nevroner er svært polariserte celler som representerer den grunnleggende beregningsenheten i nervesystemet. De mottar og avgir informasjon som er avhengig av oppdeling av inngangs- og utgangssteder: henholdsvis dendritter og aksoner. Under utviklingen strekker axonene seg mens de navigerer i et utrolig komplekst miljø for å nå destinasjonen. Axon-navigasjon styres av vekstkjeglen, en sensorisk struktur plassert på spissen av den utviklende axonen. Vekstkjeglen er ansvarlig for å oppdage miljøsignaler og oversette dem til den dynamiske romlige omorganiseringen av cytoskjelettet 2,3. De resulterende morfo-mekaniske reaksjonene instruerer vekstkjeglen til å strekke seg eller trekke seg tilbake fra utløsersignalet, noe som fører til spesifikke axonmanøvrer.
Den nåværende forståelsen av axonforlengelse og vekstkjegledynamikk stammer fra studier som evaluerer axonvekst over todimensjonale (2D) substrater 2,4,5,6,7. Disse banebrytende studiene identifiserte sofistikert samspill mellom vekstkjegler og vekstsubstrater og avslørte slående forskjeller avhengig av substrategenskaper som lim og stivhet 8,9. Anført av denne innsikten ble ekstracellulære miljøsignaler hypoteset for å diktere axonvekst, med vekstkjeglen cytoskjelett som utførte denne veksten 2,10,11,12. Spesielt kan nevroner forlenge aksoner i ikke-klebende substrater (f.eks. polyly lysin, poly-ornitin)13. Videre kan substratstivitet påvirke axonvekstraten uavhengig av cellelimkomplekser8. Derfor kan det å studere vekstkjegledynamikk i 2D-substrater alene ikke nøyaktig modellere balansen mellom krefter som oppstår ved samspillet mellom axonale vekstkjegler med fysiologisk relevante tredimensjonale (3D) miljøer, for eksempel de som finnes in vivo.
For å overvinne begrensningene i 2D-analysene har axonvekst og vekstkegledynamikk blitt studert i 3D-matriser 8,9. Disse matrisene utgjør mer fysiologisk kontekst, men tillater likevel å studere celleintrinsiske mekanismer for axonvekst. Det muliggjør vekstkegleundersøkelse på en encellet måte under en rekke forhold og farmakologiske behandlinger9. I slike 3D-miljøer viste axoner distinkt cytoskeletal dynamikk og vokste raskere enn de som ble observert i 2D-dyrkede nevroner9. Disse elegante studiene demonstrerte påvirkningen av en ekstra dimensjon på omorganiseringen av vekstkjeglen cytoskjelett og følgelig på dens oppførsel.
Til tross for tilsynelatende fordeler presentert av 3D-matriser over 2D-overflater for å støtte innfødt nevronutvikling og axonvekst, forblir de et forenklet syntetisk stillas som ikke kan gjenspeile kompleksiteten i dynamikken observert i sentralnervesystemet (CNS) vev. Her ble levering av reporterplasmider av ex utero og i utero-elektroporasjon kombinert med hjernens organotypiske skivekultur og in situ live superoppløsningsavbildning for å analysere vekstkjegledynamikk i en fysiologisk kontekst. Denne metodikken tillater visualisering av å utvikle axoner mens du opplever 3-dimensjonaliteten til in vivo-miljøer og kompleksiteten i dens fysisk-kjemiske sammensetning. Til slutt beskrives brukervennlige prosedyrer for å måle axonvekst og vekstkjegledynamikk ved hjelp av vanlig lisensiert og offentlig tilgjengelig programvare.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adson Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11006-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21202</td>
			<td>Goat Anti-Mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21236</td>
			<td>Goat Anti-Mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Vimentin antibody</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>V2258-.2ML</td>
			<td>Monoclonal mouse, clone LN-6, ascites fluid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>3864154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biozym Sieve GP Agarose</td>
			<td>Biozyme</td>
			<td>850080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Braunol, Spr&#252;hflasche</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>3864073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine (Temgesic)</td>
			<td>GEHE Pharma</td>
			<td>345928</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMZ unevirsal electrode puller</td>
			<td>Zeitz</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric razor</td>
			<td>Andes</td>
			<td>NA</td>
			<td>ProClip UltraEdge Super 2-Speed model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enrofloxacin (Baytril)</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>3543238</td>
			<td>2,5% (wt/vol)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf microloader pipette tips</td>
			<td>FischerScientific</td>
			<td>10289651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green FCF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7252-5G</td>
			<td>Dye content &#8805; 85 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji 2.1.0</td>
			<td>NIH</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji/downloads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-09</td>
			<td>ToughCut/Straight/9cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroDish Cell Culture Dish</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>FD5040-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount Aqueous Mounting Medium</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>F4680-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>MedPex</td>
			<td>3705391</td>
			<td>5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14025092</td>
			<td>calcium, magnesium, no phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Pan-Biotech</td>
			<td>P30-0711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris 9.7.2</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://imaris.oxinst.com/products/imaris-for-neuroscientists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Virbac</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotonic saline solution</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>8609261</td>
			<td>0.90%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica VT1200 S vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14048142066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 880 with Airyscan</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metacam</td>
			<td>Venusberg Apotheke</td>
			<td>8890217</td>
			<td>5 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>Janvier Labs</td>
			<td>NA</td>
			<td>C57BL/6JRj</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Adson Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11018-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Storage Jar</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>E210</td>
			<td>&#160;16.16.27</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/p/excel/cfq7ttc0k7dx?activetab=pivot:overviewtab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell Cell Culture Insert</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td>30&#160;mm, hydrophilic PTFE, 0.4&#160;&#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moria Perforated Spoons</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10370-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moria Spoon</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10321-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium, minus phenol red</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12348017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neuropan-2 supplement</td>
			<td>Pan-Biotech</td>
			<td>P07-11010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab138478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olsen-Hegar Needle Holder with Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Tub-alpha-1-Dre</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>133925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Tub-alpha-1-iCre</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>133924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Tub-alpha-1-LifeAct-GFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>175437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52858-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3813-10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCAG-lox-rox-STOP-rox-tRFP-lox-Lyn-ZsGreen</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>175438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCAG-lox-STOP-lox-Lyn-mNeonGreen</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>175257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoNozzle Kit v2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>5430-ALL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum Tweezertrodes</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>45-0487</td>
			<td>1 mm / 3 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAGEN Maxi kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reflex wound closure Clip</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500344-10</td>
			<td>7 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sekundenkleber Pattex Mini Trio</td>
			<td>Lyreco</td>
			<td>4722659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square wave electroporation system ECM830</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>W3 45-0052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile gauze</td>
			<td>Braun Askina</td>
			<td>9031216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile lubricant eye ointment</td>
			<td>Bayer Vital</td>
			<td>PZN1578675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile surgical gloves</td>
			<td>Sempermed</td>
			<td>14C0451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4621.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supramid 5-0 surgical silk sutures</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin-wall glass capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW100-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide 8 Well Glass Bottom</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80827</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ visualization of axon growth and growth cone dynamics in acute ex vivo embryonic brain slice cultures

Under nevronutvikling navigerer axoner i det kortikale miljøet for å nå sine endelige destinasjoner og etablere synaptiske forbindelser. Vekstkjegler - de sensoriske strukturene som ligger på de distale spissene for å utvikle axoner - utfør denne prosessen. Å studere strukturen og dynamikken i vekstkjeglen er avgjørende for å forstå axonal utvikling og samspillet med det omkringliggende sentralnervesystemet (CNS) som gjør det mulig å danne nevrale kretser. Dette er viktig ved utarbeidelse av metoder for å reintegrere aksoner i nevrale kretser etter skade i grunnleggende forskning og prekliniske sammenhenger. Så langt er den generelle forståelsen av vekstkjegledynamikk først og fremst basert på studier av nevroner dyrket i to dimensjoner (2D). Selv om det utvilsomt er grunnleggende for den nåværende kunnskapen om vekstkjeglestrukturelle dynamikker og respons på stimuli, fremstiller 2D-studier feilaktig det fysiologiske tredimensjonale (3D) miljøet som oppstår av nevronale vekstkjegler i intakt CNS-vev. Mer nylig ble kollagengeler brukt for å overvinne noen av disse begrensningene, noe som muliggjør undersøkelse av nevronutvikling i 3D. Imidlertid mangler både syntetiske 2D- og 3D-miljøer signalsignaler i CNS-vev, som styrer forlengelsen og pathfinding av å utvikle axoner. Denne protokollen gir en metode for å studere axoner og vekstkjegler ved hjelp av organotypiske hjerneskiver, der utviklende axoner møter fysiologisk relevante fysiske og kjemiske signaler. Ved å kombinere finjustert i utero og ex utero elektroporasjon for å sparsomt levere fluorescerende reportere sammen med superoppløselig mikroskopi, presenterer denne protokollen en metodisk rørledning for visualisering av axon- og vekstkjegledynamikk in situ. Videre er en detaljert verktøykassebeskrivelse av analysen av langsiktige og live-celle bildedata inkludert.

Representative resultater oppnådd med den beskrevne metodearbeidsflyten vises. E15,5 mus ble brukt i den nåværende demonstrasjonen, selv om denne protokollen lett kan tilpasses nesten alle embryonale aldre fra E11 til slutten av E17. I denne protokollen, enten ex utero elektroporasjon (EUE; Figur 2A, 2C-I) eller i utero-elektroporasjon (IUE; Figur 2B,C og 2J-Q) ble brukt til å levere plasmider inn i stamcellene som fôret de laterale ventriklene. Disse forfedrene er kilden til fremtidige kortikale projiserende nevroner (CPN) 15,16. Plasmidblandinger ble forberedt på å drive sparsomt nevronspesifikk uttrykk for enten membran-målrettet (Lyn)-mNeonGreen (figur 1A) eller LifeAct-forbedret (E)GFP (figur 1B) for å evaluere henholdsvis den generelle oppførselen og aktindynamikken i vekstkjegler. Videre ble en plasmidblanding med sikte på å merke individuelle nevroner med enten turbo(t)-RFP eller zoanthus sp. (Zs) grønt fluorescerende protein (ZsGreen) (figur 1C) inkludert. Dette letter overvåkingen av vekstkjegleadferd fra uavhengige nærliggende nevroner.
Hjerne disseksjon fra elektroporerte embryoer er et avgjørende skritt som må utføres nøye for å oppnå skiver av høy kvalitet, og bevare den opprinnelige hjernestrukturen. Disseksjonsinstrumenter og vibratom ble tilberedt på forhånd og nøye etanolsterilisert (figur 3A,B). Deretter ble hodene til elektroporerte embryoer forsiktig dissekert og hjernene ble ekstrahert. Her vises representativ disseksjon av hjerner fra embryoene utsatt for EUE på E15 (figur 3C-F) og E12.5 (figur 3G-J). Hjernene er umiddelbart innkapslet i en agarosematrise, skiver og plassert på PTFE membraninnlegg i en bunnglassfat for inkubasjon (figur 3K-M).
Helsestatusen til hjerneskiver er et viktig poeng for kontroll for å sikre pålitelige resultater. En visuell inspeksjon for eventuell forurensning ble utført daglig. I tillegg, når kulturen ble ferdigstilt, blir hjerneskivene festet og utsatt for immunhiistokjemi. Her ble 4′,6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) brukt til å kontrollere den generelle cellulære organisasjonen og vimentinfargingen for å avsløre glial organisering; spesielt radial glia (RG) stillas. Vanligvis viser vellykket dyrkede hjerneskiver avledet fra enten IUE eller EUE normal cellulær distribusjon som avslørt av DAPI og et noe organisert utvalg av RG med apically-orienterte pial-kontaktende prosesser17 (figur 4A, B henholdsvis). Av og til observeres merkede forstyrrelser i RG-stillaset i dyrkede hjerneskiver, spesielt hos de som er avledet fra EUE-elektroporasjon (figur 4C). Hjerneskiver med ekstremt uorganisert RG stillas viser nedsatt nevronmigrasjon og defekt axonvekst (ikke vist). Derfor er kontroll av RG-stillaset en enkel postkulturmetode for å sortere dataene hentet fra pålitelige hjerneskiver.
Hjerneskiver avledet fra enten IUE eller EUE med Lyn-mNeonGreen-uttrykkende plasmidblanding resulterer i lignende sparsom nevronmerking. En representativ pyramidal CPN som uttrykker Lyn-mNeonGreen og den dynamiske oppførselen til vekstkjeglen, vises som et eksempel (figur 5A og tilleggsvideo 1 øverst til venstre). I tillegg ble nevroner merket ved hjelp av en plasmid som uttrykte en aktinsonde for å analysere aktindynamikk av axonal vekstkjegler in situ (figur 5B og supplerende video 1 nederst til venstre). In situ eksperimenter ble også utført med en dual-Cre / Dre fluorophore-uttrykkende plasmid design (figur 1C og supplerende video 1, høyre). tRFP- eller ZsGreen-fluoroforer i denne plasmiden kan aktiveres spesifikt og individuelt av henholdsvis Dre- eller Cre-rekombininaer i nærliggende nevroner (figur 5C). Denne eksperimentelle line-up tillater side-ved-side analyse av vekst kjegler fra kontroll nevroner med nærliggende modifiserte nevroner (et gitt tap eller gevinst av funksjon). Dette omgår variasjoner som oppstår ved bruk av forskjellige skiver for å teste kontroll og eksperimentelle forhold.
Kymografier generert fra den innspilte filmen ble analysert, hvorfra dynamiske vekstparametere som fremspringende aktivitet over tid og vekstlengde lett kan oppnås (figur 6A). Vær oppmerksom på at en enkel justering i tidsoppløsningen til tidsforløpet tillater måling av axonforlengelseshastighet i 2 timer (figur 6A). Videre kan variasjonen av vekstkjeglevolum over tid-et mål på generell vekst kjegle dynamisk aktivitet-lett oppnås, i dette tilfellet med lisensiert programvare (Figur 6B og Figur 6E, F). Dette kan brukes til å evaluere hastigheten på aktin tredemølle og balansen mellom filopodia / lamellipodia under vekstkjegle utforske aktivitet.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig01.jpg"> Figur 1: Ordninger av plasmidene som brukes i protokollen. (A) pCAG-lox-STOP-lox-Lyn-mNeonGreen. (B) p-Tub-alfa-1-LifeAct-GFP. (C) pCAG-lox-rox-STOP-rox-tRFP-pA-lox-ZsGreen-pA. Relevant informasjon om plasmidkomponenter og fluoroforens opprinnelse finnes i boksene. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig02.jpg"> Figur 2: Arbeidsflyt av ex utero og i utero-elektroporasjon av E15,5 mus. (A) Oppsett av kirurgistasjon for eks utero-elektroporasjon. (B) Oppsett av kirurgistasjon for i utero-elektroporasjon. (C) Livmorhorn trukket utenfor bukhulen til den bedøvede musen. (D) Utvinning av et embryo fra livmorsekken. (E) Embryooffer ved fullstendig ryggmargstranseksjon via et diagonalt snitt; vær oppmerksom på at halshugging ble unngått. (F) Plassering av embryo i holderen og injisert med DNA/Fast Green-blanding i venstre lateral ventrikel. (G,H) Plasser embryoets hode mellom platina pinsettelektroder med katoden (rød pil) over cortexen i en 60° vinkel. (I) Plassering av embryoets armer (svarte piler) utenfor holderen for å forhindre glidning av embryoet under prosedyren. (J) Rotasjon av embryoet inne i livmorsekken for å eksponere hodet. (K,L) Injeksjon av DNA/Fast Green-blanding i embryoets laterale ventrikler gjennom livmorveggen. (M) Plasser embryoets hode mellom platina pinsettelektroder med en katode (rød pil) over cortexen i en 60° vinkel. (N) Suturert muskel snitt via løping låse sutur. (O) Suturert hudinnsnitt via en avbrutt sutur. (P) Sikring av såret ved hjelp av kirurgiske sårklemmer og desinfeksjon ved hjelp av betadin. (Q) Plassering av musen i gjenopprettingsburet med langt infrarødt varmelys. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig03.jpg"> Figur 3: Ekstraksjon av E15,5 og E12,5 hjerner og organotypisk skivekulturprosedyre. (A) Verktøy som brukes til hjernens ekstraksjonsprosedyre. (B) Oppsett av organotypisk kulturstasjon. (C-F) Ekstraksjon av E15,5 hjerne. (G-J) Ekstraksjon av E12.5 hjerne. Prikkede linjer uthever plasseringen av snitt. Røde piler peker på retningen for å trekke med tang. (K) Legge inn hjernen i en 3 cm tallerken som inneholder 3% lav smelte agarose, slik at en 1-2 mm agarose avstand gap under hjernen. (L) Innsamling av 150 μm hjerneskive. (M) Plassering av hjerneskiver på PTFE membraninnlegg immobilisert i en 35 mm tallerken ved hjelp av parafinfilm (blå pil). Rød stjernemarkering indikerer en gitt hjerneskivesamling fra vibratom (L) og overføringen til PTFE-membranen (M). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig04.jpg"> Figur 4: Konservert radial glialcellestruktur i sunne organotypiske skiver. Konfokale bilder av E17,5 hjerneskiver som avslører RG-matrise (vimentin, grønn) og generell celleorganisasjon (DAPI, magenta) etter IUE (A) og EUE (B, C). Legg merke til de sterke forstyrrelsene i RG-rekken som av og til kan skyldes EUE (C). Forstørrelser tilsvarer de røde stiplede rammene i hovedfiguren: skalastenger, 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig04large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig05.jpg"> Figur 5: In situ visualisering av vekstkjegledynamikken i akutte organotypiske skiver. (A,B) Nevroner og deres tilsvarende vekstkjegler merket med henholdsvis Lyn-mNeonGreen og LifeAct-GFP. Rød stjerne markerer vekstkjegle av Lyn-mNeonGreen som uttrykker nevron. Blå stjerne som markerer vekstkjegle av LifeAct-GFP som uttrykker nevron. (C) Nærliggende nevroner merket med det doble plasmidsystemet som inneholder tRFP (magenta) og ZsGreen (grønn) og deres tilsvarende vekstkjegler. Vekstkjegler avbildet (høyre) var utenfor den fangede rammen (venstre), oppnådd kort tid etter å ha oppnådd vekstkjeglen tidsforløp; skalastenger, 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig05large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig6v2.jpg"> Figur 6: Analyse av axonveksthastighet og vekstkeglevolum. (A) Axon-sporing på en nevron som uttrykker Lyn-mNeonGreen (øverst) og den tilsvarende kymografen (nedenfor) generert ved hjelp av ImageJ. (B) Rekonstruksjon av z-stack video av vekstkjegle ved hjelp av bildeanalyseprogramvaren (øverst) og den samme vekstkjeglen uthevet ved hjelp av overflatemålingsverktøyet (nedenfor). (C) Grafer som viser endringer i veksthastighet over tid for flere aksoner. (D) Gjennomsnittlig veksthastighet for aksoner kvantifiseres i (C). (E) Graf som viser endringene i vekstkjeglevolumet over tid. (F) Gjennomsnittlig volum av vekstkjegler kvantifiseres i (E); skala bar, 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig6v2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig07.jpg"> Figur 7: Radial migrasjon og nevronal polarisering av pyramidale kortikale nevroner. Diagram som illustrerer utvikling av pyramidale kortikale nevroner (rosa) som migrerer radialt fra den germinale ventrikulære sonen (VZ) mot piaoverflaten. Styrt av radiale gliaprosesser (grå), migrerende polariserte nevroner etablerer en ledende prosess, fremtidig dendrit og etterfølgende prosess, fremtidig axon, som fortsetter å strekke seg nedover mot mellomsonen (IZ). Stiplede røde bokser representerer de kortikale områdene der vekstkjegler ble avbildet. Spesielt i IZ, subventricular sone (SVZ), eller sammenføyning axon bunter (grønn). Illustrasjonen ble laget med et nettbasert verktøy, BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig07large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Plasmid</td>
			<td>Konsentrasjon (μg/μL)</td>
			<td>Tiltenkt bruk</td>
		</tr>
<tr>
<td>pCAG-lox-STOP-lox-Lyn-mNeonGreen</td>
			<td>0.25</td>
			<td rowspan="3">Merking av membran målrettet protein (Lyn)</td>
		</tr>
<tr>
<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>p-Tub-alfa-1-iCre</td>
			<td>0.08</td>
		</tr>
<tr>
<td>p-Tub-alfa-1-LifeAct-GFP</td>
			<td>0.125</td>
			<td>Filamentøs aktin (F-aktin) merking i vekstkjegler</td>
		</tr>
<tr>
<td>pCAG-lox-rox-STOP-rox-tRFP-lox-Lyn-ZsGreen</td>
			<td>1</td>
			<td rowspan="5">Uavhengig merking av to populasjoner av nærliggende nevroner</td>
		</tr>
<tr>
<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>p-Tub-alfa-1-iCre</td>
			<td>0.004</td>
		</tr>
<tr>
<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>p-Kar-alfa-1-Dre</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: Liste over plasmider som brukes i protokollen. Navn, konsentrasjon og tiltenkt bruk av hver brukte plasmid.
Supplerende video 1: In situ visualisering av vekstkjegledynamikken i akutte organotypiske skiver. Dynamikken i vekstkjegler merket med Lyn-mNeonGreen (øverst til venstre) og LifeAct-GFP (nederst til venstre). Nærliggende vekstkjegler er differensialt merket med det doble plasmidsystemet som inneholder tRFP (magenta, øverst til høyre) og ZsGreen (grønn; nederst til høyre). Bildeintervall, 2,5 s. Skalalinjer, 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/Supplementary_Video_1.mp4" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures at JoVE.com

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

Denne protokollen viser en enkel og robust metode for å studere in situ axon vekst og vekst kjegle dynamikken. Den beskriver hvordan man tilbereder eks vivo fysiologisk relevante akutte hjerneskiver og gir en brukervennlig analyserørledning.

In situ Visualisering av Axon vekst og vekst kjegledynamikk i akutte Ex Vivo embryonale hjerneskivekulturer

During neuronal development, axons navigate the cortical environment to reach their final destinations and establish synaptic connections. Growth cones ...

Hvordan axoner navigerer i den komplekse sentralnervesystemmatrisen er et grunnleggende spørsmål i nevrobiologi. Denne protokollen gjør det mulig å studere axonvekst og vekstkegledynamikk i det fysiologiske miljøet med høyoppløselig avbildning. Denne protokollen beskriver en brukervennlig ende-til-ende-rørledning for levering av DNA i musens embryonale hjerne, preparater for organotypiske skiver av høy kvalitet og en trinnvis guide for bildeanskaffelse og analyse.Selv om den opprinnelig ble designet for å studere axondynamikk i det embryonale sentralnervesystemet, kan denne protokollen justeres for å muliggjøre organotypisk kultur og visualisering av axonplastisitet etter traumatiske eller patologiske forhold. Protokollen i seg selv er relativt grei. Å oppnå sin første merking og bevaring av hjernestrukturer er imidlertid kritiske punkter.Derfor krever elektroporasjon, hjerneavhandling og kuttetrinn ekstra forsiktighet. Å demonstrere prosedyren vil være nyttig, og doktorgradsstudenten er fra Brackets laboratorium. Etter bedøvelse av en gravid kvinnelig mus, gjør et snitt for å trekke ut begge livmorhornene ved hjelp av en bomullsknopp gjennomvåt i varm saltvann eller tang, forsiktig gripe mellomrommene mellom embryoene.Plasser deretter embryoene på våt gasbind. Etter å ha kuttet opp livmorsekken, fjern hvert embryo. Legg embryoene i en 10 centimeter tallerken som inneholder HBSS supplert med glukose på is.For ex utero elektroporasjon, plukk opp et embryo og legg det i holderen. Sett deretter glasskapillæren som inneholder DNA-en raskt grønn blanding gjennom embryoskallen inn i lateral ventrikelen, og injiser to til tre mikroliter av DNA-plasmidblandingen i hver ventrikel. Hold deretter embryoets hode mellom platina pinsettelektroder i riktig vinkel for å målrette mot ønsket hjerneområde, med katoden vendt mot området der DNA-overføringen er ment.For i utero elektroporasjon, etter å ha trukket ut livmorhornene og plassert embryoene på en våt gasbind som vist tidligere, bruk fingertupper for å forsiktig rotere embryoet inne i livmoren til de lambdoidale og saggitale suturene er plassert. Sett deretter glasskapillæren som inneholder DNA-en raskt grønn blanding gjennom livmorveggen og embryoskallen inn i lateral ventrikelen, og injiser to til tre mikroliter av DNA-plasmidblandingen i enten en eller begge ventriklene etter ønske med maksimalt to mikroliter per ventrikel. Etter injeksjonen, hold embryoets hode mellom platina pinsettelektroder i riktig vinkel for å målrette ønsket hjerneområde med katoden vendt mot området der DNA-overføringen er ment.Når alle nødvendige embryoer er elektroporated, bruk en saltvann gjennomvåt bomullspinne for å forsiktig plassere livmorhornene tilbake inne i bukhulen. Suturer muskel- og hudinnsnittene ved hjelp av 5-0 suturmateriale, fest såret ved hjelp av suturklemmer, og desinfiser såret ved å sprøyte det med betadin. Plasser musen tilbake i gjenopprettingsburet og hold varmen ved hjelp av et langt infrarødt varmelys i minst 20 minutter etter bebreidelse.Fest embryoets hode under et disseksjonsmikroskop. Fjern deretter huden i skallen ved å kutte langs midtlinjen fra bunnen av hodet mot nesen. Skrell huden i skallen sidelengs og gjør et stort nok gap for hjernen å bli utskilt.Deretter, for å fjerne hjernen, sett inn den lukkede spissen av steril disseksjonssaks som starter under den olfaktoriske pæren og beveger seg mot hjernestammen. Klipp deretter av hjernestammen og trim mange løse biter av meninger rundt hjernen. Bruk en perforert skje, plukk opp hjernen og fjern overflødig væske ved å dabbe bunnen av skjeen mot tørt vevspapir.Legg deretter hjernen i en agaroserett på is. Deretter blander du agarose i 10 sekunder for jevn kjøling, manøvrerer deretter hjernen til midten av parabolen og plasserer den horisontalt med dorsalsiden opp og sikrer at den er helt dekket med agarose fra alle retninger. Plukk forsiktig opp agaroseblokken fra Vibratome-arbeidsstasjonen og tørk bunnen ved å dabbe mot silkepapir.Plasser deretter blokken på det limte området av prøveholderen med rostralsiden av hjernen vendt opp, og legg prøveholderen på is. La limet tørke i ett minutt. Klipp hjernen i koronalskiver i en vinkel på 15 grader.Deretter bruker du rene spateler, samler hjerneskivene og legger dem på en PTFE-membran immobilisert i en 35 millimeter glassbunnsfat ved hjelp av Parrafin. Samle opptil fem hjerneskiver per membran. Deretter fjerner du den overskytende HBSS-glukoseløsningen fra rundt skivene på membranen og lar skivene være halvtørre, og tilsett deretter 500 mikroliter forhåndsvarslet stykkemedier direkte til rommet under membranen og inkubere skivene ved 35 grader Celsius med 5% karbondioksid.For avbildning axon vekst, finn en cortex region med lav til middels celle tetthet. Mens for avbildning vekst kjegle dynamikken, finne en vekst kjegle i cortex umiddelbar sone eller subventricular sone. Deretter definerer du en Z-stakkstørrelse.For axonvekst i en stor Z-stabel, angi en trinnstørrelse på to mikrometer og for vekstkjegler i en mindre Z-stabel, angi en trinnstørrelse på ett mikrometer. For dataanalyse åpner du bildefilen i Fiji ved å klikke på fil, deretter åpne og velge bildet. Få maksimal intensitetsprojeksjon av tidsforløpet ved å klikke på bildet, etterfulgt av stabler, Z-projeksjon og maksimal intensitetsprojeksjon.Gå gjennom tidsforløpet og finn en voksende axon. Når den er plassert, tegn en linje gjennom den voksende axonen, fra spissen av axonen i den første rammen og følg axonen gjennom hele tidsforløpet. Deretter synger du plugin kymo re-slice bredt.Angi skalaen til kymografien ved å gå til bilde, deretter egenskaper. Når du har satt avstanden i mikrometre, pikselbredde og tid i sekunder eller minutter og pikselhøyde, går du for å analysere og klikke mål. Hvis du vil måle volumet av vekstkjeglen, åpner du bildefilen i bildeanalyseprogramvaren ved å klikke fil, åpne og velge filen du er interessert i.Velg deretter veiviseren for å legge til nye overflater i trinn én, under algoritmeinnstillinger, velg segment bare et interesseområde, og beskjær rammen i trinn to for å passe til hele vekstkjeglen i alle rammer. Neste i trinn tre, hold terskelen til absolutt intensitet og i trinn fire, sørg for at hele vekstkjegleområdet er terskel. Deretter velger du antall voxels LMG til én under filtertype i trinn fem.Velg utfør-knappen for å utføre alle opprettingstrinnene og avslutte veiviseren for å legge til nye overflater. Til slutt, i statistikkfanen øverst i veiviservinduet, velger du bestemte verdier og volum under den detaljerte fanen. Vanligvis viser vellykket dyrkede hjerneskiver avledet fra enten i utero eller ex utero-elektroporasjon normal cellulær distribusjon og et organisert utvalg av radial glia med apically-orientert pilo-kontaktprosesser.Noen ganger observeres en ex utero-elektroporasjon merket forstyrrelser i radial glial stillas og kultivert hjerneskiver, noe som gjør denne kontrollen farging anbefales. En representativ pyramidal kortikale projiserer nevron som uttrykker Lyn-mNeonGreen og den dynamiske oppførselen til vekstkjeglen er vist her. I tillegg ble nevroner merket ved hjelp av en plasmid som uttrykte aktinsonde for å analysere aktindynamikk av axonal vekstkjegler in situ.In situ eksperimenter ble også utført med en dual cre dre fluorophore uttrykker plasmid design, hvor tRFP eller ZsGreen fluorophores kan være spesielt og individuelt aktivert av enten dre eller cre recombinases, henholdsvis i nærliggende nevroner. Fra kymografer oppnås dynamiske vekstparametere som veksthastighet for flere axoner og vekstkeglevolum over tid. Dette kan brukes til å evaluere hastigheten på aktin tredemølle og balansen mellom filopodia og lamellapodia under vekst kjegle utforske aktivitet.Det er viktig å opprettholde hjernestrukturen og finjustere plasmidkonsentrasjoner for å oppnå sparsom merking. Dette er avgjørende for nøyaktig visualisering av aksoner og vekstkjegler i cortex. Avhengig av utvalgte plasmaer og genetisk bakgrunn, tillater denne protokollen brukere å endre nevroner eller miljøet der de vokser, noe som gir mulighet for et bredt spekter av studier.Ved å muliggjøre høyoppløselig tilgang til nevroner in situ, gjør denne teknikken det mulig for nevrologer å forhøre det dynamiske samspillet mellom vekstkjegler og sentralnervesystemets beregninger både på morfologiske og molekylære nivåer.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output.  During development, this activity is important for the ...

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

Metoder for å studere nevrale morphogenesis:<em&gt; Ex vivo</em&gt; RNAi electroporation i Embryonic murin Cerebral Cortex

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Funksjonell Bildediagnostiske Bruke Ultrasonic blod-hjerne barrieren avbrudd og mangan forbedret MR

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinvlerina: An<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Approach to Measure Region spesifikke Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neuroner

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Ex vivo tilbe Intakt Vomeronasal orgel og tilbehør luktelappen

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

Organotypic skive kulturer til å studere oligodendrocyte Dynamics og myelinisering

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

Slice It Hot: Acute Adult Brain Slicing in Physiological Temperature

Slice It Hot: Akutt Adult Brain Slicing i Fysiologisk Temperatur

Here we present a protocol for preparation of acute brain slices. This procedure is a critical element for electrophysiological patch-clamp experiments ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

Luktsystemet som en modell for å studere aksonal vekst mønstre og morfologi<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imaging Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dynamics i Cone fotoreseptor Axon terminaler Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Samtidig<em&gt; Ex vivo</em&gt; Funksjonell testing av to netthinne etter<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogrammet System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...