In situ Visualisering av Axon vekst og vekst kjegledynamikk i akutte Ex Vivo embryonale hjerneskivekulturer

Hvordan axoner navigerer i den komplekse sentralnervesystemmatrisen er et grunnleggende spørsmål i nevrobiologi. Denne protokollen gjør det mulig å studere axonvekst og vekstkegledynamikk i det fysiologiske miljøet med høyoppløselig avbildning. Denne protokollen beskriver en brukervennlig ende-til-ende-rørledning for levering av DNA i musens embryonale hjerne, preparater for organotypiske skiver av høy kvalitet og en trinnvis guide for bildeanskaffelse og analyse.

Selv om den opprinnelig ble designet for å studere axondynamikk i det embryonale sentralnervesystemet, kan denne protokollen justeres for å muliggjøre organotypisk kultur og visualisering av axonplastisitet etter traumatiske eller patologiske forhold. Protokollen i seg selv er relativt grei. Å oppnå sin første merking og bevaring av hjernestrukturer er imidlertid kritiske punkter.

Derfor krever elektroporasjon, hjerneavhandling og kuttetrinn ekstra forsiktighet. Å demonstrere prosedyren vil være nyttig, og doktorgradsstudenten er fra Brackets laboratorium. Etter bedøvelse av en gravid kvinnelig mus, gjør et snitt for å trekke ut begge livmorhornene ved hjelp av en bomullsknopp gjennomvåt i varm saltvann eller tang, forsiktig gripe mellomrommene mellom embryoene.

Plasser deretter embryoene på våt gasbind. Etter å ha kuttet opp livmorsekken, fjern hvert embryo. Legg embryoene i en 10 centimeter tallerken som inneholder HBSS supplert med glukose på is.

For ex utero elektroporasjon, plukk opp et embryo og legg det i holderen. Sett deretter glasskapillæren som inneholder DNA-en raskt grønn blanding gjennom embryoskallen inn i lateral ventrikelen, og injiser to til tre mikroliter av DNA-plasmidblandingen i hver ventrikel. Hold deretter embryoets hode mellom platina pinsettelektroder i riktig vinkel for å målrette mot ønsket hjerneområde, med katoden vendt mot området der DNA-overføringen er ment.

For i utero elektroporasjon, etter å ha trukket ut livmorhornene og plassert embryoene på en våt gasbind som vist tidligere, bruk fingertupper for å forsiktig rotere embryoet inne i livmoren til de lambdoidale og saggitale suturene er plassert. Sett deretter glasskapillæren som inneholder DNA-en raskt grønn blanding gjennom livmorveggen og embryoskallen inn i lateral ventrikelen, og injiser to til tre mikroliter av DNA-plasmidblandingen i enten en eller begge ventriklene etter ønske med maksimalt to mikroliter per ventrikel. Etter injeksjonen, hold embryoets hode mellom platina pinsettelektroder i riktig vinkel for å målrette ønsket hjerneområde med katoden vendt mot området der DNA-overføringen er ment.

Når alle nødvendige embryoer er elektroporated, bruk en saltvann gjennomvåt bomullspinne for å forsiktig plassere livmorhornene tilbake inne i bukhulen. Suturer muskel- og hudinnsnittene ved hjelp av 5-0 suturmateriale, fest såret ved hjelp av suturklemmer, og desinfiser såret ved å sprøyte det med betadin. Plasser musen tilbake i gjenopprettingsburet og hold varmen ved hjelp av et langt infrarødt varmelys i minst 20 minutter etter bebreidelse.

Fest embryoets hode under et disseksjonsmikroskop. Fjern deretter huden i skallen ved å kutte langs midtlinjen fra bunnen av hodet mot nesen. Skrell huden i skallen sidelengs og gjør et stort nok gap for hjernen å bli utskilt.

Deretter, for å fjerne hjernen, sett inn den lukkede spissen av steril disseksjonssaks som starter under den olfaktoriske pæren og beveger seg mot hjernestammen. Klipp deretter av hjernestammen og trim mange løse biter av meninger rundt hjernen. Bruk en perforert skje, plukk opp hjernen og fjern overflødig væske ved å dabbe bunnen av skjeen mot tørt vevspapir.

Legg deretter hjernen i en agaroserett på is. Deretter blander du agarose i 10 sekunder for jevn kjøling, manøvrerer deretter hjernen til midten av parabolen og plasserer den horisontalt med dorsalsiden opp og sikrer at den er helt dekket med agarose fra alle retninger. Plukk forsiktig opp agaroseblokken fra Vibratome-arbeidsstasjonen og tørk bunnen ved å dabbe mot silkepapir.

Plasser deretter blokken på det limte området av prøveholderen med rostralsiden av hjernen vendt opp, og legg prøveholderen på is. La limet tørke i ett minutt. Klipp hjernen i koronalskiver i en vinkel på 15 grader.

Deretter bruker du rene spateler, samler hjerneskivene og legger dem på en PTFE-membran immobilisert i en 35 millimeter glassbunnsfat ved hjelp av Parrafin. Samle opptil fem hjerneskiver per membran. Deretter fjerner du den overskytende HBSS-glukoseløsningen fra rundt skivene på membranen og lar skivene være halvtørre, og tilsett deretter 500 mikroliter forhåndsvarslet stykkemedier direkte til rommet under membranen og inkubere skivene ved 35 grader Celsius med 5% karbondioksid.

For avbildning axon vekst, finn en cortex region med lav til middels celle tetthet. Mens for avbildning vekst kjegle dynamikken, finne en vekst kjegle i cortex umiddelbar sone eller subventricular sone. Deretter definerer du en Z-stakkstørrelse.

For axonvekst i en stor Z-stabel, angi en trinnstørrelse på to mikrometer og for vekstkjegler i en mindre Z-stabel, angi en trinnstørrelse på ett mikrometer. For dataanalyse åpner du bildefilen i Fiji ved å klikke på fil, deretter åpne og velge bildet. Få maksimal intensitetsprojeksjon av tidsforløpet ved å klikke på bildet, etterfulgt av stabler, Z-projeksjon og maksimal intensitetsprojeksjon.

Gå gjennom tidsforløpet og finn en voksende axon. Når den er plassert, tegn en linje gjennom den voksende axonen, fra spissen av axonen i den første rammen og følg axonen gjennom hele tidsforløpet. Deretter synger du plugin kymo re-slice bredt.

Angi skalaen til kymografien ved å gå til bilde, deretter egenskaper. Når du har satt avstanden i mikrometre, pikselbredde og tid i sekunder eller minutter og pikselhøyde, går du for å analysere og klikke mål. Hvis du vil måle volumet av vekstkjeglen, åpner du bildefilen i bildeanalyseprogramvaren ved å klikke fil, åpne og velge filen du er interessert i.

Velg deretter veiviseren for å legge til nye overflater i trinn én, under algoritmeinnstillinger, velg segment bare et interesseområde, og beskjær rammen i trinn to for å passe til hele vekstkjeglen i alle rammer. Neste i trinn tre, hold terskelen til absolutt intensitet og i trinn fire, sørg for at hele vekstkjegleområdet er terskel. Deretter velger du antall voxels LMG til én under filtertype i trinn fem.

Velg utfør-knappen for å utføre alle opprettingstrinnene og avslutte veiviseren for å legge til nye overflater. Til slutt, i statistikkfanen øverst i veiviservinduet, velger du bestemte verdier og volum under den detaljerte fanen. Vanligvis viser vellykket dyrkede hjerneskiver avledet fra enten i utero eller ex utero-elektroporasjon normal cellulær distribusjon og et organisert utvalg av radial glia med apically-orientert pilo-kontaktprosesser.

Noen ganger observeres en ex utero-elektroporasjon merket forstyrrelser i radial glial stillas og kultivert hjerneskiver, noe som gjør denne kontrollen farging anbefales. En representativ pyramidal kortikale projiserer nevron som uttrykker Lyn-mNeonGreen og den dynamiske oppførselen til vekstkjeglen er vist her. I tillegg ble nevroner merket ved hjelp av en plasmid som uttrykte aktinsonde for å analysere aktindynamikk av axonal vekstkjegler in situ.

In situ eksperimenter ble også utført med en dual cre dre fluorophore uttrykker plasmid design, hvor tRFP eller ZsGreen fluorophores kan være spesielt og individuelt aktivert av enten dre eller cre recombinases, henholdsvis i nærliggende nevroner. Fra kymografer oppnås dynamiske vekstparametere som veksthastighet for flere axoner og vekstkeglevolum over tid. Dette kan brukes til å evaluere hastigheten på aktin tredemølle og balansen mellom filopodia og lamellapodia under vekst kjegle utforske aktivitet.

Det er viktig å opprettholde hjernestrukturen og finjustere plasmidkonsentrasjoner for å oppnå sparsom merking. Dette er avgjørende for nøyaktig visualisering av aksoner og vekstkjegler i cortex. Avhengig av utvalgte plasmaer og genetisk bakgrunn, tillater denne protokollen brukere å endre nevroner eller miljøet der de vokser, noe som gir mulighet for et bredt spekter av studier.

Ved å muliggjøre høyoppløselig tilgang til nevroner in situ, gjør denne teknikken det mulig for nevrologer å forhøre det dynamiske samspillet mellom vekstkjegler og sentralnervesystemets beregninger både på morfologiske og molekylære nivåer.