Name: in situ visualization of axon growth and growth cone dynamics in acute ex vivo embryonic brain slice cultures
Uploaded: 2021-10-14T15:00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures at JoVE.com

Мы хотели бы поблагодарить Марию Евгению Бернис за фотографирование процедур. Мы также благодарим Эмили Бернсайд, Эмили Хэндли, Торбена Пьетраллу, Макса Шелски и Сину Стерн за чтение и обсуждение рукописи. Мы благодарны нашим выдающимся техническим помощникам Джессике Гоньер, Бланке Рэндел и Ань-Туан Фаму. Мы признаем ценную поддержку установки светового микроскопа DZNE и установки для животных. Эта работа была поддержана Deutsche Forschungsgesellschaft (DFG), Международным фондом исследований параплегии (IRP) и Wings for Life (до F.B). Ф.B. является членом кластера передового опыта ImmunoSensation2, SFBs 1089 и 1158, и является лауреатом премии Роджера Де Споэльберха.

<ol>
	<li>Schelski, M., Bradke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+polarization:+From+spatiotemporal+signaling+to+cytoskeletal+dynamics.">Neuronal polarization: From spatiotemporal signaling to cytoskeletal dynamics.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 84, 11-28 (2017).</li><li>Lowery, L. A., Van Vactor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+trip+of+the+tip:+understanding+the+growth+cone+machinery.">The trip of the tip: understanding the growth cone machinery.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 10 (5), 332-343 (2009).</li><li>Stoeckli, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+axon+guidance:+are+we+nearly+there+yet.">Understanding axon guidance: are we nearly there yet.</a> Development. 145 (10), (2018).</li><li>Bradke, F., Dotti, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+local+actin+instability+in+axon+formation.">The role of local actin instability in axon formation.</a> Science. 283 (5409), 1931-1934 (1999).</li><li>Neukirchen, D., Bradke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+linker+proteins+regulate+neuronal+polarization+through+microtubule+and+growth+cone+dynamics.">Cytoplasmic linker proteins regulate neuronal polarization through microtubule and growth cone dynamics.</a> Journal of Neuroscience. 31 (4), 1528-1538 (2011).</li><li>Witte, H., Bradke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+cytoskeleton+during+neuronal+polarization.">The role of the cytoskeleton during neuronal polarization.</a> Current Opinion in Neurobiology. 18 (5), 479-487 (2008).</li><li>Witte, H., Neukirchen, D., Bradke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+stabilization+specifies+initial+neuronal+polarization.">Microtubule stabilization specifies initial neuronal polarization.</a> Journal of Cell Biology. 180 (3), 619-632 (2008).</li><li>Nichol, R. H., Catlett, T. S., Onesto, M. M., Hollender, D., Gomez, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+elasticity+regulates+cell-type+specific+RHOA+signaling+and+neuritogenesis+of+human+neurons.">Environmental elasticity regulates cell-type specific RHOA signaling and neuritogenesis of human neurons.</a> Stem Cell Reports. 13 (6), 1006-1021 (2019).</li><li>Santos, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+growth+of+CNS+neurons+in+three+dimensions+is+amoeboid+and+independent+of+adhesions.">Axon growth of CNS neurons in three dimensions is amoeboid and independent of adhesions.</a> Cell Reports. 32 (3), 107907 (2020).</li><li>Mitchison, T., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal+dynamics+and+nerve+growth.">Cytoskeletal dynamics and nerve growth.</a> Neuron. 1 (9), 761-772 (1988).</li><li>Lin, C. H., Thompson, C. A., Forscher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal+reorganization+underlying+growth+cone+motility.">Cytoskeletal reorganization underlying growth cone motility.</a> Current Opinion in Neurobiology. 4 (5), 640-647 (1994).</li><li>Myers, J. P., Gomez, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+adhesion+kinase+promotes+integrin+adhesion+dynamics+necessary+for+chemotropic+turning+of+nerve+growth+cones.">Focal adhesion kinase promotes integrin adhesion dynamics necessary for chemotropic turning of nerve growth cones.</a> Journal of Neuroscience. 31 (38), 13585-13595 (2011).</li><li>Turney, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+growth+factor+stimulates+axon+outgrowth+through+negative+regulation+of+growth+cone+actomyosin+restraint+of+microtubule+advance.">Nerve growth factor stimulates axon outgrowth through negative regulation of growth cone actomyosin restraint of microtubule advance.</a> Molecular Biology of the Cell. 27 (3), 500-517 (2016).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurons+derived+from+radial+glial+cells+establish+radial+units+in+neocortex.">Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex.</a> Nature. 409 (6821), 714-720 (2001).</li><li>Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+neurons+arise+in+symmetric+and+asymmetric+division+zones+and+migrate+through+specific+phases.">Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases.</a> Nature Neuroscience. 7 (2), 136-144 (2004).</li><li>Ferent, J., Zaidi, D., Francis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+control+of+radial+glia+proliferation+and+scaffolding+during+cortical+development+and+pathology.">Extracellular control of radial glia proliferation and scaffolding during cortical development and pathology.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 578341 (2020).</li><li>Dent, E. W., Gupton, S. L., Gertler, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+growth+cone+cytoskeleton+in+axon+outgrowth+and+guidance.">The growth cone cytoskeleton in axon outgrowth and guidance.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (3), (2011).</li><li>Dupraz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RhoA+controls+axon+extension+independent+of+specification+in+the+developing+brain.">RhoA controls axon extension independent of specification in the developing brain.</a> Current Biology. 29 (22), 3874-3886 (2019).</li><li>Azzarelli, R., Oleari, R., Lettieri, A., Andre, V., Cariboni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro,+ex+vivo+and+in+vivo+techniques+to+study+neuronal+migration+in+the+developing+cerebral+cortex.">In vitro, ex vivo and in vivo techniques to study neuronal migration in the developing cerebral cortex.</a> Brain Sciences. 7 (5), (2017).</li><li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+brain+slice+cultures:+A+review.">Organotypic brain slice cultures: A review.</a> Neuroscience. 305, 86-98 (2015).</li><li>Namba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pioneering+axons+regulate+neuronal+polarization+in+the+developing+cerebral+cortex.">Pioneering axons regulate neuronal polarization in the developing cerebral cortex.</a> Neuron. 81 (4), 814-829 (2014).</li><li>Shah, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rap1+GTPases+are+master+regulators+of+neural+cell+polarity+in+the+developing+neocortex.">Rap1 GTPases are master regulators of neural cell polarity in the developing neocortex.</a> Cerebral Cortex. 27 (2), 1253-1269 (2017).</li><li>Wiegreffe, C., Feldmann, S., Gaessler, S., Britsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+confocal+imaging+of+migrating+neurons+in+organotypic+slice+culture+of+embryonic+mouse+brain+using+in+utero+electroporation.">Time-lapse confocal imaging of migrating neurons in organotypic slice culture of embryonic mouse brain using in utero electroporation.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), (2017).</li><li>de Anda, F. C., Meletis, K., Ge, X., Rei, D., Tsai, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosome+motility+is+essential+for+initial+axon+formation+in+the+neocortex.">Centrosome motility is essential for initial axon formation in the neocortex.</a> Journal of Neuroscience. 30 (31), 10391-10406 (2010).</li><li>Sakakibara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+centrosome+translocation+and+microtubule+organization+in+neocortical+neurons+during+distinct+modes+of+polarization.">Dynamics of centrosome translocation and microtubule organization in neocortical neurons during distinct modes of polarization.</a> Cerebral Cortex. 24 (5), 1301-1310 (2014).</li><li>Schatzle, P., Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+microtubule+dynamics+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures.">Live imaging of microtubule dynamics in organotypic hippocampal slice cultures.</a> Methods in Cell Biology. 131, 107-126 (2016).</li><li>Qu, X., Kumar, A., Bartolini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+microtubule+dynamics+at+excitatory+presynaptic+boutons+in+primary+hippocampal+neurons+and+acute+hippocampal+slices.">Live imaging of microtubule dynamics at excitatory presynaptic boutons in primary hippocampal neurons and acute hippocampal slices.</a> STAR Protocols. 2 (1), 100342 (2021).</li><li>Tonnesen, J., Katona, G., Rozsa, B., Nagerl, U. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spine+neck+plasticity+regulates+compartmentalization+of+synapses.">Spine neck plasticity regulates compartmentalization of synapses.</a> Nature Neuroscience. 17 (5), 678-685 (2014).</li><li>Buchsbaum, I. Y., Cappello, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+migration+in+the+CNS+during+development+and+disease:+insights+from+in+vivo+and+in+vitro+models.">Neuronal migration in the CNS during development and disease: insights from in vivo and in vitro models.</a> Development. 146 (1), (2019).</li><li>Rigby, M. J., Gomez, T. M., Puglielli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+cell-axonal+growth+cone+interactions+in+neurodevelopment+and+regeneration.">Glial cell-axonal growth cone interactions in neurodevelopment and regeneration.</a> Frontiers in Neuroscience. 14, 203 (2020).</li><li>Barnes, A. P., Polleux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+axon-dendrite+polarity+in+developing+neurons.">Establishment of axon-dendrite polarity in developing neurons.</a> Annual Review of Neuroscience. 32, 347-381 (2009).</li></ol>

Авторам нечего раскрывать.

Как растущие конусы чувствуют и реагируют на окружающую их среду, чтобы координировать одновременное расширение аксона и руководство, все еще является предметом споров 3,18. Новаторские исследования в области 2D-субстратов дали представление о фундаментальных молекулярных механизмах, генерирующих силы, которые управляют динамикой конуса роста во время формирования аксонов, роста и навигации 2,10,11,12,19. Совсем недавно исследования в 3D-матрицах показали, какое влияние третье измерение оказывает на поведение конуса роста и, следовательно, на рост аксона 8,9. Тем не менее, сложные механизмы, инструктирующие динамику конуса роста in vivo, еще предстоит тщательно изучить.
Получение оловоорганических культур срезов из мозга IUE или EUE широко используется и хорошо документировано. Он стал золотым стандартом, позволяющим ученым получить представление о развитии и поведении нейронов в живой мозговой ткани20,21. Действительно, этот метод был успешно использован в сочетании с различными методами визуализации с высоким разрешением для визуализации конкретных молекулярных процессов и морфологических событий in situ. Такие исследования включают, но не ограничиваются ими, образование и расширение аксонов19,22, миграцию корковых нейронов 19,22,23,24, динамику центросом 25,26, динамику микротрубочек27, а также функциональную динамику пре- и постсинаптических компартментов28,29.
Этот протокол устраняет пробел в экспериментальной нейробиологии, визуализируя динамику конуса роста развития корковых нейронов in situ, in ex vivo острых культур среза мозга и инструменты для анализа полученных данных.
Для создания этого протокола использовались культуры острых срезов мозга, потому что они (1) с некоторой практикой легко генерируются; (2) представлять доступную систему для изучения колбочек роста, встроенных в квази-полностью физиологическую среду, но достаточно прозрачную, чтобы обеспечить визуализацию живых клеток с высоким разрешением; (3) может быть расширен для его использования с помощью множества трансгенных линий мыши; (4) в сочетании с IUE или EUE обеспечивают практически неограниченный потенциал для предоставления молекулярных инструментов для оценки производительности ростовых конусов и аксонов in vivo при потере/усилении функциональных режимов, наряду с флуоресцентными репортерами и зондами цитоскелета.
Эта методология была описана в контексте как EUE, так и IUE. Несмотря на то, что EUE по-прежнему является высоконадежным методом, он привел к увеличению частоты срезов мозга, показывающих дезорганизованную сеть RG по сравнению с теми, которые были получены с помощью IUE в качестве метода доставки (рисунок 4C). Нарушения в массиве RG сильно влияют на миграцию нейронов и характер удлинения аксона30,31. Это ключевые параметры, которые предсказывают, где найти аксоны для анализа в данный момент времени и тип среды, в которой они ориентируются. Срезы мозга со значительно нарушенной сетью RG обычно имеют нарушенную стратификацию корковых нейронов. Это, в свою очередь, производит аксоны с хаотичными траекториями. Поэтому настоятельно рекомендуется контролировать структурную целостность сети RG. Интересно, что плохая структурная целостность коррелирует с увеличением возраста эмбрионального мозга. Действительно, такие эффекты у молодых эмбрионов E12.5-E13.5 обычно не наблюдались19.
Настоящий протокол является тщательным и простым. Тем не менее, есть несколько критических шагов, где необходимо проявлять особую осторожность и внимание для получения оптимальных результатов. Они были четко отмечены в протоколе и включают (1) настройку количества ДНК, используемой в электропорации, для получения разреженной маркировки; (2) предотвращение повреждений во время извлечения мозга; (3) контроль температуры агарозы во время оболочки мозга; (4) устранение идеального процента агарозы для мозга данного возраста; и 5) отбор флуорофоров, опыт которых следует. Во время оптимизации протокола была проверена производительность нескольких флуорофоров в визуализации живых клеток in situ. Для этого протокола были выбраны мономерные варианты GFP EGFP и NeonGreen для получения плазмид, помеченных LifeAct и Lyn (рисунок 5A,B). Кроме того, был протестирован вариант RFP mScarlet, который был признан очень подходящим для этой установки (данные не показаны). Также были протестированы многомерные tRFP (димер) и ZsGreen (тетрамер) (рисунок 5C и дополнительное видео 1, справа). Эти быстро складывающиеся сверхяркие флуорофоры рекомендуются, когда метод требует быстрой генерации флуоресцентного сигнала после доставки ДНК.
Обычной практикой в использовании культур срезов является использование срезов из разных мозгов для тестирования контрольных и экспериментальных условий. Это представляет собой неотъемлемый источник нежелательной изменчивости. Здесь была использована система экспрессии, позволяющая независимо модифицировать соседние нейроны и экспрессию репортеров для идентификации. Обратите внимание, что в этой демонстрации (рисунок 5C) не было различий между нейронами, экспрессирующими любой из флуорофоров. Однако, например, такая плазмидная смесь в сочетании с трансгенной линией мыши, содержащей Cre-чувствительный ген, будет маркироваться нейронами tRFP (Dre-sensitive), которые остались диким типом. Напротив, ZsGreen (также Cre-чувствительный) будет маркировать рекомбинированные нейроны. Следовательно, ростовые колбочки двух разных генотипов и, вероятно, также фенотипов могут быть изучены бок о бок одновременно в одном и том же срезе мозга.
Локализация аксонов и конусов роста для анализа является важным соображением. Корковые нейроны поляризуются, радиально мигрируя из желудочковой зоны (VZ) к кортикальной пластине (CP). Во время этого процесса нейроны образуют ведущий процесс (будущий дендррит) и замыкающий процесс, который станет аксоном, в конечном итоге присоединяясь к новаторским аксонам в промежуточной зоне (IZ), создавая аксонные тракты32. Поэтому для захвата аксональных конусов роста проводилась визуализация аксональных волокон в ИЗ, включая аксоны, выходящие из CP, и рано сгенерированные аксоны, уже связанные с аксональными пучками; или, в конце концов, в волокнах, которые пересекают ИЗ и простираются под ним (рисунок 7).
Этот протокол позволяет выполнять визуализацию нейронов сверхвысокого разрешения в органотипических срезах. Исторически сложилось так, что рассеяние света было значительной проблемой, с которой сталкивались при визуализации толстых образцов. За последние два десятилетия обширные достижения в области оптических технологий сделали возможным получение изображений толстых образцов. Здесь цель на большом рабочем расстоянии использовалась для лучшей визуализации небольших структур, таких как конусы роста. Неизбежно, этот протокол не фиксирует более подробные события, такие как ретроградный поток актина или динамика микротрубочек. Объектив большого рабочего расстояния, который требует более низкой числовой апертуры (NA), сохраняет информацию из толстых срезов. Однако этот протокол также можно было адаптировать для использования с целью сокращения рабочего расстояния. Для этого требовалась плавная переноска ломтиков в блюдо со стеклянным дном для сохранения структурной целостности. Однако использование этого метода привело к более короткой выживаемости - ~ 15 ч - из-за потери газообмена (данные не показаны). В отличие от 2D-культур, ростовые конусы в 3D занимают больший объем и требуют компенсации движения-артефакта по оси Z. Чтобы повысить способность к детальному изображению событий, необходимо использовать современные конфокальные технологии. Поэтому рекомендуется использовать быстро сканирующий z-стековый двигатель, такой как z-Galvo, доступный на высокочувствительных конфокальных микроскопах33.
Следует отметить, что этот протокол представляет собой три основных ограничения. Во-первых, часто бывает сложно контролировать уровни экспрессии / количество экспрессирующих клеток любой данной плазмиды in vivo. Это приводит к изменчивости между всеми срезами даже при поддержании одинаковой концентрации плазмид. Поэтому выбор регуляторных элементов в используемых векторах выражений должен быть предопределен с осторожностью. Во-вторых, визуализация подробных событий с помощью мембранных вставок в настоящее время невозможна. Это второе ограничение может быть преодолено с помощью методологических обновлений, предложенных в предыдущем пункте. Наконец, ростовые конусы очень светочувствительны и могут быстро стать фотоотбеленными. Поэтому частая визуализация колбочек роста в течение всего 5 минут с помощью лазерных сканирующих микроскопов часто может разрушить колбочки роста. В связи с этим новые достижения в устройствах, генерируемых световой микроскопией, могут быть адаптированы для долгосрочной визуализации срезов мозга34.
Подобные протоколы предназначены для открытия новых исследовательских направлений, позволяя лучше понять, что требуется для того, чтобы конус роста считывал и реагировал на сложную среду in vivo , и, что более важно, разгадывал механику этого сложного взаимодействия.

Нейроны представляют собой сильно поляризованные клетки, которые представляют собой основную вычислительную единицу в нервной системе. Они получают и излучают информацию, которая опирается на разделение входных и выходных участков: дендритов и аксонов, соответственно1. Во время разработки аксоны расширяются, ориентируясь в невероятной сложной среде, чтобы достичь места назначения. Аксонная навигация направляется конусом роста, сенсорной структурой, расположенной на кончике развивающегося аксона. Конус роста отвечает за обнаружение сигналов окружающей среды и перевод их в динамическую пространственную реорганизацию своего цитоскелета 2,3. Полученные морфомеханические реакции инструктируют конус роста расширяться или втягиваться от триггерного сигнала, что приводит к специфическим маневрам аксона.
Современное понимание динамики расширения и роста конуса аксона проистекает из исследований, оценивающих рост аксонов над двумерными (2D) субстратами 2,4,5,6,7. Эти новаторские исследования выявили сложное взаимодействие между колбочками роста и субстратами роста и выявили поразительные различия, зависящие от характеристик субстрата, таких как адгезивность и жесткость 8,9. Во главе с этими выводами были выдвинуты гипотезы о том, что внеклеточные сигналы окружающей среды диктуют рост аксонов, причем цитоскелет конуса роста выполняет этот рост 2,10,11,12. Примечательно, что нейроны могут расширять аксоны в неадгезивных субстратах (например, полилизин, полиорнитин)13. Кроме того, жесткость подложки может влиять на скорость роста аксона независимо от клеточных адгезивных комплексов8. Следовательно, изучение динамики конуса роста в 2D-субстратах само по себе не может точно смоделировать баланс сил, возникающий в результате взаимодействия конусов роста аксонов с физиологически значимыми трехмерными (3D) средами, такими как те, которые обнаружены in vivo.
Для преодоления ограничений 2D-анализов в 3D-матрицах 8,9 были изучены рост аксонов и динамика конуса роста. Эти матрицы представляют собой более физиологический контекст, но позволяют изучать клеточные механизмы роста аксонов. Это позволяет исследовать конус роста одноклеточным способом в различных условиях и фармакологических методах лечения9. В таких 3D-средах аксоны демонстрировали отчетливую динамику цитоскелета и росли быстрее, чем те, которые наблюдались в 2D-культивируемых нейронах9. Эти изящные исследования продемонстрировали влияние дополнительного измерения на реорганизацию цитоскелета ростового конуса и, следовательно, на его поведение.
Несмотря на очевидные преимущества, предоставляемые 3D-матрицами по сравнению с 2D-поверхностями в поддержке развития нейронов и роста аксонов, они остаются упрощенным синтетическим каркасом, который не может отражать сложность динамики, наблюдаемой в ткани центральной нервной системы (ЦНС). Здесь доставка репортерных плазмид ex utero и in utero электропорация сочеталась с органотипической культурой среза мозга и визуализацией in situ с живым сверхвысоким разрешением для анализа динамики конуса роста в физиологическом контексте. Данная методика позволяет визуализировать развивающиеся аксоны при ощущении 3-мерности среды in vivo и сложности ее физико-химического состава. Наконец, описаны удобные для пользователя процедуры измерения роста аксонов и динамики конуса роста с использованием общелицензионного и общедоступного программного обеспечения.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adson Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11006-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21202</td>
			<td>Goat Anti-Mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21236</td>
			<td>Goat Anti-Mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Vimentin antibody</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>V2258-.2ML</td>
			<td>Monoclonal mouse, clone LN-6, ascites fluid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>3864154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biozym Sieve GP Agarose</td>
			<td>Biozyme</td>
			<td>850080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Braunol, Spr&#252;hflasche</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>3864073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine (Temgesic)</td>
			<td>GEHE Pharma</td>
			<td>345928</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMZ unevirsal electrode puller</td>
			<td>Zeitz</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric razor</td>
			<td>Andes</td>
			<td>NA</td>
			<td>ProClip UltraEdge Super 2-Speed model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enrofloxacin (Baytril)</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>3543238</td>
			<td>2,5% (wt/vol)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf microloader pipette tips</td>
			<td>FischerScientific</td>
			<td>10289651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green FCF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7252-5G</td>
			<td>Dye content &#8805; 85 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji 2.1.0</td>
			<td>NIH</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji/downloads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-09</td>
			<td>ToughCut/Straight/9cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroDish Cell Culture Dish</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>FD5040-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount Aqueous Mounting Medium</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>F4680-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>MedPex</td>
			<td>3705391</td>
			<td>5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14025092</td>
			<td>calcium, magnesium, no phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Pan-Biotech</td>
			<td>P30-0711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris 9.7.2</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://imaris.oxinst.com/products/imaris-for-neuroscientists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Virbac</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotonic saline solution</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>8609261</td>
			<td>0.90%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica VT1200 S vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14048142066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 880 with Airyscan</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metacam</td>
			<td>Venusberg Apotheke</td>
			<td>8890217</td>
			<td>5 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>Janvier Labs</td>
			<td>NA</td>
			<td>C57BL/6JRj</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Adson Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11018-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Storage Jar</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>E210</td>
			<td>&#160;16.16.27</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/p/excel/cfq7ttc0k7dx?activetab=pivot:overviewtab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell Cell Culture Insert</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td>30&#160;mm, hydrophilic PTFE, 0.4&#160;&#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moria Perforated Spoons</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10370-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moria Spoon</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10321-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium, minus phenol red</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12348017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neuropan-2 supplement</td>
			<td>Pan-Biotech</td>
			<td>P07-11010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab138478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olsen-Hegar Needle Holder with Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Tub-alpha-1-Dre</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>133925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Tub-alpha-1-iCre</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>133924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Tub-alpha-1-LifeAct-GFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>175437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52858-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3813-10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCAG-lox-rox-STOP-rox-tRFP-lox-Lyn-ZsGreen</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>175438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCAG-lox-STOP-lox-Lyn-mNeonGreen</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>175257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoNozzle Kit v2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>5430-ALL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum Tweezertrodes</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>45-0487</td>
			<td>1 mm / 3 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAGEN Maxi kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reflex wound closure Clip</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500344-10</td>
			<td>7 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sekundenkleber Pattex Mini Trio</td>
			<td>Lyreco</td>
			<td>4722659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square wave electroporation system ECM830</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>W3 45-0052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile gauze</td>
			<td>Braun Askina</td>
			<td>9031216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile lubricant eye ointment</td>
			<td>Bayer Vital</td>
			<td>PZN1578675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile surgical gloves</td>
			<td>Sempermed</td>
			<td>14C0451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4621.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supramid 5-0 surgical silk sutures</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin-wall glass capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW100-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide 8 Well Glass Bottom</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80827</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ visualization of axon growth and growth cone dynamics in acute ex vivo embryonic brain slice cultures

Во время развития нейронов аксоны перемещаются по корковой среде, чтобы достичь своих конечных пунктов назначения и установить синаптические связи. Ростовые конусы - сенсорные структуры, расположенные на дистальных кончиках развивающихся аксонов - выполняют этот процесс. Изучение структуры и динамики конуса роста имеет решающее значение для понимания аксонального развития и взаимодействий с окружающей центральной нервной системой (ЦНС), которые позволяют ей формировать нейронные цепи. Это важно при разработке методов реинтеграции аксонов в нейронные цепи после травмы в фундаментальных исследованиях и доклинических контекстах. До сих пор общее понимание динамики конуса роста в первую очередь основано на исследованиях нейронов, культивируемых в двух измерениях (2D). Хотя 2D-исследования, несомненно, имеют основополагающее значение для современных знаний о структурной динамике конуса роста и реакции на стимулы, они искажают физиологическую трехмерную (3D) среду, с которой сталкиваются конусы роста нейронов в неповрежденной ткани ЦНС. Совсем недавно коллагеновые гели были использованы для преодоления некоторых из этих ограничений, что позволило исследовать развитие нейронов в 3D. Тем не менее, как синтетические 2D, так и 3D-среды не имеют сигнальных сигналов в ткани ЦНС, которые направляют расширение и поиск пути развивающихся аксонов. Этот протокол обеспечивает метод изучения аксонов и колбочек роста с использованием органотипических срезов мозга, где развивающиеся аксоны сталкиваются с физиологически значимыми физическими и химическими сигналами. Сочетая тонко настроенную внутриутробную и внеутробную электропорацию для редкой доставки флуоресцентных репортеров вместе с микроскопией со сверхвысоким разрешением, этот протокол представляет собой методологический конвейер для визуализации динамики аксона и конуса роста in situ. Кроме того, включено подробное описание анализа данных визуализации долгосрочных и живых клеток.

Watch this Scientific Journal Video about In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures at JoVE.com

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

Этот протокол демонстрирует простой и надежный метод изучения роста аксона in situ и динамики конуса роста. Он описывает, как подготовить ex vivo физиологически значимые острые срезы мозга и предоставляет удобный для пользователя конвейер анализа.

На месте Визуализация роста аксонов и динамики конуса роста в культурах эмбриональных срезов мозга Ex vivo

During neuronal development, axons navigate the cortical environment to reach their final destinations and establish synaptic connections. Growth cones ...

Как аксоны ориентируются в сложной матрице центральной нервной системы, является фундаментальным вопросом в нейробиологии. Этот протокол позволяет изучать рост аксонов и динамику конуса роста в физиологической среде с помощью изображений с высоким разрешением. Этот протокол описывает удобный для пользователя сквозной конвейер для доставки ДНК в эмбриональный мозг мыши, подготовку к высококачественным органотипическим срезам и пошаговое руководство по получению и анализу изображений.Хотя первоначально этот протокол был разработан для изучения динамики аксонов в эмбриональной центральной нервной системе, он может быть скорректирован, чтобы обеспечить органотипическую культуру и визуализацию пластичности аксона после травматических или патологических состояний. Сам протокол относительно прост. Однако достижение его первой маркировки и сохранение структур мозга являются критическими точками.Поэтому этапы электропорации, рассечения мозга и нарезки требуют дополнительной осторожности. Демонстрация процедуры будет полезной, и докторант из лаборатории Брекета. После обезболивания беременной самки мыши сделайте разрез, чтобы вытащить оба рога матки с помощью ватной палочки, смоченной в теплом физиологическом растворе или щипцах, осторожно захватив промежутки между эмбрионами.Затем поместите эмбрионы на влажную марлю. После разрезания маточного мешка удалите каждый эмбрион. Поместите эмбрионы в 10-сантиметровую посуду, содержащую HBSS, дополненную глюкозой на льду.Для внутриутробной электропорации возьмите эмбрион и поместите его в держатель. Затем осторожно вставьте стеклянный капилляр, содержащий быструю зеленую смесь ДНК, через череп эмбриона в боковой желудочек и введите два-три микролитра плазмидной смеси ДНК в каждый желудочек. Затем удерживайте голову эмбриона между платиновыми электродами пинцета под соответствующим углом, чтобы нацелиться на желаемую область мозга, при этом катод обращен к области, где предназначен перенос ДНК.Для внутриутробной электропорации, после вытаскивания рогов матки и размещения эмбрионов на влажной марле, как показано ранее, используйте кончики пальцев, чтобы осторожно вращать эмбрион внутри матки до тех пор, пока не будут расположены лямбдоидальные и саггитальные швы. Затем осторожно вставьте стеклянный капилляр, содержащий быструю зеленую смесь ДНК, через стенку матки и череп эмбриона в боковой желудочек и введите два-три микролитра плазмидной смеси ДНК в один или оба желудочка по желанию максимум двумя микролитрами на желудочек. После инъекции удерживайте голову эмбриона между платиновыми электродами пинцета под соответствующим углом, чтобы нацелиться на нужную область мозга катодом, обращенным к области, где предназначен перенос ДНК.После того, как все необходимые эмбрионы будут электропорированы, используйте пропитанную физиологическим раствором ватную палочку, чтобы аккуратно поместить рога матки обратно в брюшную полость. Зашить мышечные и кожные разрезы с помощью 5-0 шовного материала, затем закрепить рану с помощью шовных зажимов и продезинфицировать рану, опрыскивая ее бетадином. Поместите мышь обратно в клетку для восстановления и поддерживайте тепло с помощью дальнего инфракрасного согревающего света в течение не менее 20 минут после процедуры.Зафиксируйте голову эмбриона под рассеченным микроскопом. Затем удалите кожу в черепе, разрезав вдоль средней линии, начиная от основания головы к носу. Очистите кожу черепа сбоку, создав достаточно большой зазор для иссечения мозга.Далее для удаления мозга вводят закрытый кончик стерильного рассечения ножницами, начиная с обонятельной луковицы и двигаясь в сторону ствола мозга. Затем отрежьте ствол мозга и обрежьте много свободных кусков мозговых оболочек вокруг мозга. Используя перфорированную ложку, поднимите мозг и удалите лишнюю жидкость, обмакнув дно ложки в сухую папиросную бумагу.Затем поместите мозг в блюдо с агарозой на льду. Затем, используя меньшую ложку, смешайте агарозу в течение 10 секунд для равномерного охлаждения, затем маневрируйте мозгом до середины блюда, помещая его горизонтально спинной стороной вверх и следя за тем, чтобы оно было полностью покрыто агарозой со всех сторон. Осторожно поднимите блок агарозы с рабочей станции Vibratome и высушите дно, обмакнув папиросную бумагу.Затем поместите блок на склеенную область держателя образца ростральной стороной мозга вверх и положите держатель образца на лед. Дайте клею высохнуть в течение одной минуты. Разрезать мозг на корональные срезы под углом 15 градусов.Затем, используя чистые шпатели, соберите ломтики мозга и поместите их на мембрану из ПТФЭ, иммобилизованную в 35-миллиметровую стеклянную нижнюю посуду с использованием Паррафина. Соберите до пяти срезов мозга на мембрану. Затем, используя пипетку 200 микролитров, удалите избыток раствора глюкозы HBSS вокруг ломтиков на мембране, оставив ломтики полусухими, затем добавьте 500 микролитров предварительно расплавленной среды срезов непосредственно в пространство под мембраной и инкубируйте ломтики при 35 градусах Цельсия с 5% углекислым газом.Для визуализации роста аксона найдите область коры с низкой и средней плотностью клеток. В то время как для визуализации динамики конуса роста найдите конус роста в непосредственной зоне коры или субвентрикулярной зоне. Затем определите размер стека Z.Для роста аксона в большом стеке Z установите размер шага в два микрометра, а для конусов роста в меньшем стеке Z установите размер шага в один микрометр. Для анализа данных откройте файл изображения на Фиджи, щелкнув файл, затем откройте и выберите изображение. Получите проекцию максимальной интенсивности временного интервала, щелкнув по изображению, за которым следуют стеки, Z-проекция и проекция максимальной интенсивности.Пройдите через временной интервал и найдите растущий аксон. После обнаружения проведите линию через растущий аксон, начиная с кончика аксона в первом кадре и следуя за аксоном на протяжении всего временного интервала. Далее спойте плагин kymo re-slice wide.Установите масштаб кимографа, перейдя к изображению, затем к свойствам. После установки расстояния в микрометрах, ширины пикселя и времени в секундах или минутах, а также высоты пикселя перейдите к анализу и нажмите измерить. Чтобы измерить объем конуса роста, откройте файл изображения в программном обеспечении для анализа изображений, щелкнув файл, откройте и выберите интересующий файл.Затем выберите мастер добавления новых поверхностей на первом шаге, в разделе Параметры алгоритма выберите сегментировать только интересующую область, а на втором шаге обрежьте кадр, чтобы он соответствовал всему конусу роста во всех кадрах. Далее на третьем шаге поддерживайте пороговое значение до абсолютной интенсивности, а на четвертом этапе убедитесь, что вся область конуса роста является пороговой. Затем на пятом шаге в разделе Тип фильтра выберите количество вокселей LMG к единице.Нажмите кнопку выполнить, чтобы выполнить все шаги создания и завершить работу мастера добавления новых поверхностей. Наконец, на вкладке статистика в верхней части окна мастера выберите конкретные значения и объем под подробной вкладкой. Как правило, успешно культивируемые срезы мозга, полученные из внутриутробной или внеутробной электропорации, показывают нормальное клеточное распределение и организованный массив радиальной глии с апикально ориентированными пилоконтактными процессами.Иногда при внеутробной электропорации наблюдаются заметные нарушения в радиальных глиальных лесах и культивируемых срезах мозга, что делает это контрольное окрашивание рекомендуемым. Здесь показан репрезентативный пирамидальный проецирующий нейрон, экспрессирующий Lyn-mNeonGreen, и динамическое поведение его ростового конуса. Кроме того, нейроны были помечены с использованием плазмидного экспрессирующего актинового зонда для анализа динамики актина аксональных колбочек роста in situ.Эксперименты in situ также проводились с двойным флуорофором cre dre, экспрессирующим плазмидную конструкцию, где флуорофоры tRFP или ZsGreen могли быть специфически и индивидуально активированы рекомбиназами dre или cre соответственно в соседних нейронах. Из кимографов легко получить динамические параметры роста, такие как скорость роста для нескольких аксонов и объем конуса роста с течением времени. Это может быть использовано для оценки скорости беговой дорожки актина и баланса между филоподиями и ламеллаподиями во время активности исследования конуса роста.Важно поддерживать структуру мозга и точно настраивать концентрации плазмид для достижения разреженной маркировки. Это имеет решающее значение для точной визуализации аксонов и колбочек роста в коре головного мозга. В зависимости от выбранной плазмы и генетического фона этот протокол позволяет пользователям модифицировать нейроны или среду, в которой они растут, что позволяет проводить широкий спектр исследований.Обеспечивая доступ к нейронам in situ с высоким разрешением, этот метод позволяет нейробиологам исследовать динамическое взаимодействие между колбочками роста и показателями центральной нервной системы как на морфологическом, так и на молекулярном уровнях.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

Multi-электрод массив записей из нейронов Лавины в органотипической культур

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output.  During development, this activity is important for the ...

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

Методы изучения морфогенеза нейронов:<em&gt; Ex естественных условиях</em&gt; RNAi Электропорация в эмбриональной коры головного мозга мышей

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Функциональные нейровизуализации с использованием ультразвуковых Гематоэнцефалический Разрушение барьеров и марганца-МРТ

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Мозг Slice Биотинилирование:<em&gt; Экс Vivo</em&gt; Подход к Измерьте Регион-специфический плазменным мембранный белок с торговлей взрослых нейронов

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Экс Vivo Препараты неповрежденной вомероназального органа и аксессуаров обонятельная луковица

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

Органотипической срез культуры для изучения олигодендроцит Динамика и миелинизации

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

Slice It Hot: Acute Adult Brain Slicing in Physiological Temperature

Slice It Hot: Острая взрослом мозге нарезки в физиологической температуре

Here we present a protocol for preparation of acute brain slices. This procedure is a critical element for electrophysiological patch-clamp experiments ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

Обонятельная система как модель для изучения характера роста аксонов и морфология<em&gt; В Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Са изображений<sup&gt; 2+</sup&gt; Динамика колбочек аксонов мыши Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Одновременный<em&gt; Экс естественных условиях</em&gt; Функциональное тестирование двух сетчатки по<em&gt; В естественных условиях</em&gt; Система электроретинограммы

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...