Name: in situ visualization of axon growth and growth cone dynamics in acute ex vivo embryonic brain slice cultures
Uploaded: 2021-10-14T15:00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures at JoVE.com

Vi vill tacka Maria Eugenia Bernis för att hon fotograferade procedurerna. Vi tackar också Emily Burnside, Emily Handley, Thorben Pietralla, Max Schelski och Sina Stern för att ha läst och diskuterat manuskriptet. Vi är tacksamma för våra enastående tekniska assistenter, Jessica Gonyer, Blanca Randel och Anh-Tuan Pham. Vi erkänner det värdefulla stödet från DZNE: s ljusmikroskopanläggning och djuranläggning. Detta arbete stöddes av Deutsche Forschungsgesellschaft (DFG), International Foundation for Research in Paraplegia (IRP) och Wings for Life (till F.B). F.B. är medlem i excellensklustret ImmunoSensation2, SBB 1089 och 1158, och är mottagare av Roger De Spoelberch-priset.

<ol>
	<li>Schelski, M., Bradke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+polarization:+From+spatiotemporal+signaling+to+cytoskeletal+dynamics.">Neuronal polarization: From spatiotemporal signaling to cytoskeletal dynamics.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 84, 11-28 (2017).</li><li>Lowery, L. A., Van Vactor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+trip+of+the+tip:+understanding+the+growth+cone+machinery.">The trip of the tip: understanding the growth cone machinery.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 10 (5), 332-343 (2009).</li><li>Stoeckli, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+axon+guidance:+are+we+nearly+there+yet.">Understanding axon guidance: are we nearly there yet.</a> Development. 145 (10), (2018).</li><li>Bradke, F., Dotti, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+local+actin+instability+in+axon+formation.">The role of local actin instability in axon formation.</a> Science. 283 (5409), 1931-1934 (1999).</li><li>Neukirchen, D., Bradke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+linker+proteins+regulate+neuronal+polarization+through+microtubule+and+growth+cone+dynamics.">Cytoplasmic linker proteins regulate neuronal polarization through microtubule and growth cone dynamics.</a> Journal of Neuroscience. 31 (4), 1528-1538 (2011).</li><li>Witte, H., Bradke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+cytoskeleton+during+neuronal+polarization.">The role of the cytoskeleton during neuronal polarization.</a> Current Opinion in Neurobiology. 18 (5), 479-487 (2008).</li><li>Witte, H., Neukirchen, D., Bradke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+stabilization+specifies+initial+neuronal+polarization.">Microtubule stabilization specifies initial neuronal polarization.</a> Journal of Cell Biology. 180 (3), 619-632 (2008).</li><li>Nichol, R. H., Catlett, T. S., Onesto, M. M., Hollender, D., Gomez, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+elasticity+regulates+cell-type+specific+RHOA+signaling+and+neuritogenesis+of+human+neurons.">Environmental elasticity regulates cell-type specific RHOA signaling and neuritogenesis of human neurons.</a> Stem Cell Reports. 13 (6), 1006-1021 (2019).</li><li>Santos, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+growth+of+CNS+neurons+in+three+dimensions+is+amoeboid+and+independent+of+adhesions.">Axon growth of CNS neurons in three dimensions is amoeboid and independent of adhesions.</a> Cell Reports. 32 (3), 107907 (2020).</li><li>Mitchison, T., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal+dynamics+and+nerve+growth.">Cytoskeletal dynamics and nerve growth.</a> Neuron. 1 (9), 761-772 (1988).</li><li>Lin, C. H., Thompson, C. A., Forscher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal+reorganization+underlying+growth+cone+motility.">Cytoskeletal reorganization underlying growth cone motility.</a> Current Opinion in Neurobiology. 4 (5), 640-647 (1994).</li><li>Myers, J. P., Gomez, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+adhesion+kinase+promotes+integrin+adhesion+dynamics+necessary+for+chemotropic+turning+of+nerve+growth+cones.">Focal adhesion kinase promotes integrin adhesion dynamics necessary for chemotropic turning of nerve growth cones.</a> Journal of Neuroscience. 31 (38), 13585-13595 (2011).</li><li>Turney, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+growth+factor+stimulates+axon+outgrowth+through+negative+regulation+of+growth+cone+actomyosin+restraint+of+microtubule+advance.">Nerve growth factor stimulates axon outgrowth through negative regulation of growth cone actomyosin restraint of microtubule advance.</a> Molecular Biology of the Cell. 27 (3), 500-517 (2016).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurons+derived+from+radial+glial+cells+establish+radial+units+in+neocortex.">Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex.</a> Nature. 409 (6821), 714-720 (2001).</li><li>Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+neurons+arise+in+symmetric+and+asymmetric+division+zones+and+migrate+through+specific+phases.">Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases.</a> Nature Neuroscience. 7 (2), 136-144 (2004).</li><li>Ferent, J., Zaidi, D., Francis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+control+of+radial+glia+proliferation+and+scaffolding+during+cortical+development+and+pathology.">Extracellular control of radial glia proliferation and scaffolding during cortical development and pathology.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 578341 (2020).</li><li>Dent, E. W., Gupton, S. L., Gertler, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+growth+cone+cytoskeleton+in+axon+outgrowth+and+guidance.">The growth cone cytoskeleton in axon outgrowth and guidance.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (3), (2011).</li><li>Dupraz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RhoA+controls+axon+extension+independent+of+specification+in+the+developing+brain.">RhoA controls axon extension independent of specification in the developing brain.</a> Current Biology. 29 (22), 3874-3886 (2019).</li><li>Azzarelli, R., Oleari, R., Lettieri, A., Andre, V., Cariboni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro,+ex+vivo+and+in+vivo+techniques+to+study+neuronal+migration+in+the+developing+cerebral+cortex.">In vitro, ex vivo and in vivo techniques to study neuronal migration in the developing cerebral cortex.</a> Brain Sciences. 7 (5), (2017).</li><li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+brain+slice+cultures:+A+review.">Organotypic brain slice cultures: A review.</a> Neuroscience. 305, 86-98 (2015).</li><li>Namba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pioneering+axons+regulate+neuronal+polarization+in+the+developing+cerebral+cortex.">Pioneering axons regulate neuronal polarization in the developing cerebral cortex.</a> Neuron. 81 (4), 814-829 (2014).</li><li>Shah, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rap1+GTPases+are+master+regulators+of+neural+cell+polarity+in+the+developing+neocortex.">Rap1 GTPases are master regulators of neural cell polarity in the developing neocortex.</a> Cerebral Cortex. 27 (2), 1253-1269 (2017).</li><li>Wiegreffe, C., Feldmann, S., Gaessler, S., Britsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+confocal+imaging+of+migrating+neurons+in+organotypic+slice+culture+of+embryonic+mouse+brain+using+in+utero+electroporation.">Time-lapse confocal imaging of migrating neurons in organotypic slice culture of embryonic mouse brain using in utero electroporation.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), (2017).</li><li>de Anda, F. C., Meletis, K., Ge, X., Rei, D., Tsai, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosome+motility+is+essential+for+initial+axon+formation+in+the+neocortex.">Centrosome motility is essential for initial axon formation in the neocortex.</a> Journal of Neuroscience. 30 (31), 10391-10406 (2010).</li><li>Sakakibara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+centrosome+translocation+and+microtubule+organization+in+neocortical+neurons+during+distinct+modes+of+polarization.">Dynamics of centrosome translocation and microtubule organization in neocortical neurons during distinct modes of polarization.</a> Cerebral Cortex. 24 (5), 1301-1310 (2014).</li><li>Schatzle, P., Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+microtubule+dynamics+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures.">Live imaging of microtubule dynamics in organotypic hippocampal slice cultures.</a> Methods in Cell Biology. 131, 107-126 (2016).</li><li>Qu, X., Kumar, A., Bartolini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+microtubule+dynamics+at+excitatory+presynaptic+boutons+in+primary+hippocampal+neurons+and+acute+hippocampal+slices.">Live imaging of microtubule dynamics at excitatory presynaptic boutons in primary hippocampal neurons and acute hippocampal slices.</a> STAR Protocols. 2 (1), 100342 (2021).</li><li>Tonnesen, J., Katona, G., Rozsa, B., Nagerl, U. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spine+neck+plasticity+regulates+compartmentalization+of+synapses.">Spine neck plasticity regulates compartmentalization of synapses.</a> Nature Neuroscience. 17 (5), 678-685 (2014).</li><li>Buchsbaum, I. Y., Cappello, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+migration+in+the+CNS+during+development+and+disease:+insights+from+in+vivo+and+in+vitro+models.">Neuronal migration in the CNS during development and disease: insights from in vivo and in vitro models.</a> Development. 146 (1), (2019).</li><li>Rigby, M. J., Gomez, T. M., Puglielli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+cell-axonal+growth+cone+interactions+in+neurodevelopment+and+regeneration.">Glial cell-axonal growth cone interactions in neurodevelopment and regeneration.</a> Frontiers in Neuroscience. 14, 203 (2020).</li><li>Barnes, A. P., Polleux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+axon-dendrite+polarity+in+developing+neurons.">Establishment of axon-dendrite polarity in developing neurons.</a> Annual Review of Neuroscience. 32, 347-381 (2009).</li></ol>

Författarna har inget att avslöja.

Hur tillväxtkonerna känner av och reagerar på sin omgivande miljö för att samordna samtidig axonförlängning och vägledning är fortfarande en fråga om debatt 3,18. Banbrytande studier i 2D-substrat gav en inblick i de grundläggande molekylära mekanismerna som genererar de krafter som driver tillväxtkondynamik under axonbildning, utväxt och navigering 2,10,11,12,19. Mer nyligen avslöjade studier i 3D-matriser hur mycket inflytande en tredje dimension har i tillväxtkonens beteende och följaktligen i axontillväxt 8,9. Ändå återstår de invecklade mekanismerna som instruerar tillväxtkondynamik in vivo att undersökas grundligt.
Beredning av organotypiska skivkulturer från IUE- eller EUE-hjärnor används allmänt och är väldokumenterad. Det har blivit en gyllene standard som gör det möjligt för forskare att få insikt i utvecklingen och beteendet hos neuroner i den levande hjärnvävnaden20,21. Faktum är att denna teknik framgångsrikt har använts i kombination med olika högupplösta bildtekniker för att visualisera specifika molekylära processer och morfologiska händelser på plats. Sådana studier inkluderar, men är inte begränsade till axonbildning och förlängning 19,22, kortikal neuronal migration 19,22,23,24, centrosomdynamik25,26, mikrotubulidynamik27, samt den funktionella dynamiken i pre- och postsynaptiska fack 28,29.
Detta protokoll adresserar ett gap i experimentell neurobiologi, visualiserar tillväxtkondynamiken för att utveckla kortikala neuroner in situ, i ex vivo akuta hjärnskivkulturer och verktygen för att analysera de erhållna data.
Akuta hjärnsnittskulturer användes för att upprätta detta protokoll eftersom de (1) med viss övning är lätta att generera; (2) presentera ett tillgängligt system för att studera tillväxtkoner inbäddade i en kvasi-helt fysiologisk miljö, men ändå tillräckligt transparent för att möjliggöra högupplöst live-cellavbildning; (3) kan utökas för dess användning med en myriad av transgena muslinjer; (4) i kombination med antingen IUE eller EUE, ge praktiskt taget obegränsad potential att leverera molekylära verktyg för att utvärdera prestandan hos tillväxtkottar och axoner in vivo under förlust/förstärkning av funktionsregimer, tillsammans med fluorescerande rapportörer och cytoskelettsonder.
Denna metod beskrevs i samband med både EUE och IUE. Även om det fortfarande är en mycket tillförlitlig metod resulterade EUE i en ökad förekomst av hjärnskivor som visade ett oorganiserat RG-nätverk jämfört med de som erhölls med IUE som leveransmetod (Figur 4C). Störningar i RG-matrisen påverkar starkt neuronal migration och mönstret för axonförlängning30,31. Det här är viktiga parametrar som förutsäger var man kan hitta axoner för analys vid en viss tidpunkt och vilken typ av miljö de navigerar. Hjärnskivor med ett signifikant stört RG-nätverk har vanligtvis nedsatt kortikal neuronstratifiering. Detta producerar i sin tur axoner med kaotiska banor. Därför rekommenderas det starkt att kontrollera för RG-nätverkets strukturella integritet. Intressant nog korrelerar dålig strukturell integritet med ökad ålder hos den embryonala hjärnan. Faktum är att sådana effekter hos yngre E12.5-E13.5-embryon vanligtvis inte observerades19.
Det nuvarande protokollet är grundligt och enkelt. Ändå finns det några kritiska steg där särskild försiktighet och uppmärksamhet måste vidtas för att uppnå optimala resultat. Dessa har uttryckligen noterats i protokollet och inkluderar (1) inställning av mängden DNA som används i elektroporationen för att få gles märkning; (2) undvika skador vid extraktion av hjärnor; (3) kontroll av agarosens temperatur under hjärnhöljet; (4) felsökning av den ideala procentandelen agaros för hjärnor i en viss ålder; och (5) urval av fluoroforer, vars erfarenhet följer. Under protokolloptimering testades prestandan hos flera fluoroforer i live-cell in situ-avbildning. Monomera GFP-varianter EGFP och NeonGreen för beredning av LifeAct- och Lyn-märkta plasmider valdes för detta protokoll (figur 5A,B). Dessutom testades RFP-varianten mScarlet och befanns vara mycket lämplig för denna uppsättning (data visas inte). Multimeric tRFP (dimer) och ZsGreen (tetramer) (Figur 5C och Supplementary Video 1, till höger) testades också. Dessa snabbvikande superljusa fluoroforer rekommenderas när metoden kräver snabb fluorescerande signalgenerering efter DNA-leverans.
En vanlig praxis vid användning av skivkulturer är att använda skivor från olika hjärnor för att testa kontroll och experimentella förhållanden. Detta representerar en inneboende källa till oönskad variation. Här användes ett uttryckssystem som möjliggör oberoende modifiering av närliggande nervceller och reportrars uttryck för identifiering. Observera att i denna demonstration (figur 5C) fanns det inga skillnader mellan neuroner som uttryckte någon av fluoroforerna. Men som ett exempel kommer en sådan plasmidblandning i kombination med en transgen muslinje som rymmer en Cre-känslig gen att märka med tRFP (Dre-känsliga) neuroner som förblev som vild typ. Däremot kommer ZsGreen (även Cre-känslig) att märka de rekombinerade neuronerna. Därför kan tillväxtkottar av de två olika genotyperna, och sannolikt även fenotyper, studeras sida vid sida samtidigt i samma hjärnskiva.
Lokalisering av axoner och tillväxtkottar för analys är ett viktigt övervägande. Kortikala neuroner polariseras medan de radiellt migrerar från den ventrikulära zonen (VZ) mot kortikala plattan (CP). Under denna process bildar neuroner en ledande process (en framtida dendrit) och en efterföljande process som kommer att bli axonen, så småningom ansluta sig till banbrytande axoner i mellanzonen (IZ) och etablera axonkanaler32. För att fånga axonala tillväxtkottar gjordes därför avbildning på axonala fibrer i IZ, inklusive axoner som lämnar CP och tidigt genererade axoner som redan är associerade med axonbuntar; eller så småningom, i fibrer som tvärs över IZ och sträcker sig under den (Figur 7).
Detta protokoll gör det möjligt att utföra superupplösningsavbildning av neuroner inom organotypiska skivor. Historiskt sett var ljusspridning ett betydande problem vid avbildning av tjocka exemplar. Under de senaste två decennierna har omfattande framsteg inom optisk teknik gjort avbildning av tjocka exemplar möjlig. Här användes ett långdistansmål för att visualisera mindre strukturer bättre, till exempel tillväxtkoner. Oundvikligen fångar detta protokoll inte mer detaljerade händelser som retrograd aktinflöde eller mikrotubuli dynamik. Målet för långt arbetsavstånd, som kräver en lägre numerisk bländare (NA), bevarar information från tjocka skivor. Det var emellertid också möjligt att anpassa detta protokoll till användning med mål om kortare arbetsavstånd. Detta krävde en smidig överföring av skivor till en glasbottnad skål för att bevara strukturell integritet. Användning av denna metod resulterade emellertid i kortare överlevnad - ~ 15 h - på grund av förlust av gasutbyte (data visas inte). Till skillnad från 2D-kulturer upptar tillväxtkottar i 3D en större volym och kräver rörelseartefaktkompensation i z-axeln. För att öka möjligheten att avbilda detaljerade händelser måste modern konfokalteknik utnyttjas. Därför rekommenderas att du använder en snabbskanningsmotor med z-stack, till exempel z-Galvo som finns på mycket känsliga konfokalmikroskop33.
Observera att detta protokoll presenterar tre huvudbegränsningar. För det första är det ofta utmanande att kontrollera nivåer av uttryck / antal uttryckande celler av en given plasmid in vivo. Detta introducerar variation mellan alla skivor även när samma plasmidkoncentration bibehålls. Därför måste valet av regleringselementen i de använda uttrycksvektorerna vara förutbestämt med försiktighet. För det andra är det för närvarande inte möjligt att avbilda detaljerade händelser med membraninsatser. Denna andra begränsning kan övervinnas med de metoduppdateringar som föreslås i föregående stycke. Slutligen är tillväxtkottar mycket ljuskänsliga och kan snabbt bli fotoblekta. Därför kan frekvent avbildning av tillväxtkottarna, i så lite som 5 minuter med laserskanningsmikroskop, ofta kollapsa tillväxtkottarna. I detta avseende kan nya framsteg inom ljusarkmikroskopigenererade enheter anpassas för långsiktig avbildning av hjärnskivorna34.
Protokoll av detta liknande är tänkta att öppna nya forskningsvägar, vilket möjliggör en bättre förståelse för vad som krävs för att en tillväxtkon ska läsa och reagera mot en komplex in vivo-miljö , och ännu viktigare, att riva upp mekaniken i detta sofistikerade samspel.

Neuroner är mycket polariserade celler som representerar den grundläggande beräkningsenheten i nervsystemet. De tar emot och avger information som bygger på uppdelning av ingångs- och utgångsplatser: dendriter respektive axoner1. Under utvecklingen sträcker sig axoner samtidigt som de navigerar i en otroligt komplex miljö för att nå sin destination. Axonnavigering styrs av tillväxtkonen, en sensorisk struktur belägen vid spetsen av den utvecklande axonen. Tillväxtkonen är ansvarig för att detektera miljösignaler och översätta dem till den dynamiska rumsliga omorganisationen av dess cytoskelett 2,3. De resulterande morfomekaniska reaktionerna instruerar tillväxtkonen att förlänga eller dra sig tillbaka från utlösningssignalen, vilket leder till specifika axonmanövrar.
Den nuvarande förståelsen av axonförlängning och tillväxtkondynamik härrör från studier som utvärderar axontillväxt över tvådimensionella (2D) substrat 2,4,5,6,7. Dessa banbrytande studier identifierade sofistikerat samspel mellan tillväxtkottar och tillväxtsubstrat och avslöjade slående skillnader beroende på substrategenskaper som vidhäftning och styvhet 8,9. Ledda av dessa insikter antogs extracellulära miljösignaler diktera axontillväxt, med tillväxtkoncytoskelettet som utförde denna tillväxt 2,10,11,12. I synnerhet kan neuroner förlänga axoner i icke-vidhäftande substrat (t.ex. polylysin, polyornitin)13. Dessutom kan substratstyvhet påverka axontillväxthastigheten oberoende av celllimkomplex8. Därför kan studier av tillväxtkondynamik i 2D-substrat ensamma inte exakt modellera kraftbalansen som uppstår genom interaktionen mellan axonala tillväxtkottar med fysiologiskt relevanta tredimensionella (3D) miljöer, såsom de som finns i vivo.
För att övervinna begränsningarna i 2D-analyserna har axontillväxt och tillväxtkondynamik studerats i 3D-matriser 8,9. Dessa matriser utgör mer fysiologiskt sammanhang men tillåter ändå att studera cell-inneboende mekanismer för axontillväxt. Det möjliggör tillväxtkonundersökning på ett encelligt sätt under olika förhållanden och farmakologiska behandlingar9. I sådana 3D-miljöer visade axoner distinkt cytoskelettdynamik och växte snabbare än de som observerades i 2D-odlade neuroner9. Dessa eleganta studier visade påverkan av en extra dimension på omorganisationen av tillväxtkoncytoskelettet och följaktligen på dess beteende.
Trots uppenbara fördelar som presenteras av 3D-matriser över 2D-ytor för att stödja infödd neuronal utveckling och axontillväxt, förblir de en förenklad syntetisk ställning som inte kan återspegla komplexiteten i dynamiken som observerats i centrala nervsystemet (CNS) vävnad. Här kombinerades leverans av reporterplasmider av ex utero och in utero elektroporation med hjärnorganotypisk skivkultur och in situ live superupplösningsavbildning för att analysera tillväxtkondynamiken inom ett fysiologiskt sammanhang. Denna metod möjliggör visualisering av utvecklande axoner samtidigt som man upplever 3-dimensionaliteten hos in vivo-miljöer och komplexiteten i dess fysikalisk-kemiska sammansättning. Slutligen beskrivs användarvänliga förfaranden för att mäta axontillväxt och tillväxtkondynamik med hjälp av allmänt licensierad och allmänt tillgänglig programvara.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adson Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11006-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21202</td>
			<td>Goat Anti-Mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21236</td>
			<td>Goat Anti-Mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Vimentin antibody</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>V2258-.2ML</td>
			<td>Monoclonal mouse, clone LN-6, ascites fluid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>3864154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biozym Sieve GP Agarose</td>
			<td>Biozyme</td>
			<td>850080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Braunol, Spr&#252;hflasche</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>3864073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine (Temgesic)</td>
			<td>GEHE Pharma</td>
			<td>345928</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMZ unevirsal electrode puller</td>
			<td>Zeitz</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric razor</td>
			<td>Andes</td>
			<td>NA</td>
			<td>ProClip UltraEdge Super 2-Speed model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enrofloxacin (Baytril)</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>3543238</td>
			<td>2,5% (wt/vol)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf microloader pipette tips</td>
			<td>FischerScientific</td>
			<td>10289651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green FCF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7252-5G</td>
			<td>Dye content &#8805; 85 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji 2.1.0</td>
			<td>NIH</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji/downloads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-09</td>
			<td>ToughCut/Straight/9cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroDish Cell Culture Dish</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>FD5040-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount Aqueous Mounting Medium</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>F4680-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>MedPex</td>
			<td>3705391</td>
			<td>5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14025092</td>
			<td>calcium, magnesium, no phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Pan-Biotech</td>
			<td>P30-0711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris 9.7.2</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://imaris.oxinst.com/products/imaris-for-neuroscientists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Virbac</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotonic saline solution</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>8609261</td>
			<td>0.90%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica VT1200 S vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14048142066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 880 with Airyscan</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metacam</td>
			<td>Venusberg Apotheke</td>
			<td>8890217</td>
			<td>5 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>Janvier Labs</td>
			<td>NA</td>
			<td>C57BL/6JRj</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Adson Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11018-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Storage Jar</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>E210</td>
			<td>&#160;16.16.27</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/p/excel/cfq7ttc0k7dx?activetab=pivot:overviewtab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell Cell Culture Insert</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td>30&#160;mm, hydrophilic PTFE, 0.4&#160;&#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moria Perforated Spoons</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10370-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moria Spoon</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10321-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium, minus phenol red</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12348017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neuropan-2 supplement</td>
			<td>Pan-Biotech</td>
			<td>P07-11010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab138478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olsen-Hegar Needle Holder with Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Tub-alpha-1-Dre</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>133925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Tub-alpha-1-iCre</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>133924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Tub-alpha-1-LifeAct-GFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>175437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52858-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3813-10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCAG-lox-rox-STOP-rox-tRFP-lox-Lyn-ZsGreen</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>175438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCAG-lox-STOP-lox-Lyn-mNeonGreen</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>175257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoNozzle Kit v2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>5430-ALL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum Tweezertrodes</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>45-0487</td>
			<td>1 mm / 3 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAGEN Maxi kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reflex wound closure Clip</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500344-10</td>
			<td>7 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sekundenkleber Pattex Mini Trio</td>
			<td>Lyreco</td>
			<td>4722659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square wave electroporation system ECM830</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>W3 45-0052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile gauze</td>
			<td>Braun Askina</td>
			<td>9031216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile lubricant eye ointment</td>
			<td>Bayer Vital</td>
			<td>PZN1578675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile surgical gloves</td>
			<td>Sempermed</td>
			<td>14C0451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4621.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supramid 5-0 surgical silk sutures</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin-wall glass capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW100-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide 8 Well Glass Bottom</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80827</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ visualization of axon growth and growth cone dynamics in acute ex vivo embryonic brain slice cultures

Under neuronal utveckling navigerar axoner i den kortikala miljön för att nå sina slutdestinationer och upprätta synaptiska anslutningar. Tillväxtkottar - de sensoriska strukturerna som ligger vid de distala spetsarna för att utveckla axoner - utför denna process. Att studera strukturen och dynamiken i tillväxtkonen är avgörande för att förstå axonal utveckling och interaktionerna med det omgivande centrala nervsystemet (CNS) som gör det möjligt att bilda neurala kretsar. Detta är viktigt när man utformar metoder för att återintegrera axoner i neurala kretsar efter skada i grundforskning och prekliniska sammanhang. Hittills är den allmänna förståelsen av tillväxtkondynamik främst grundad på studier av neuroner odlade i två dimensioner (2D). Även om det utan tvekan är grundläggande för den nuvarande kunskapen om tillväxtkonstrukturell dynamik och svar på stimuli, ger 2D-studier en felaktig bild av den fysiologiska tredimensionella (3D) miljön som neuronala tillväxtkottar möter i intakt CNS-vävnad. På senare tid användes kollagengeler för att övervinna några av dessa begränsningar, vilket möjliggjorde undersökning av neuronal utveckling i 3D. Både syntetiska 2D- och 3D-miljöer saknar emellertid signalsignaler i CNS-vävnad, vilket styr förlängningen och vägvisningen av utvecklande axoner. Detta protokoll ger en metod för att studera axoner och tillväxtkottar med hjälp av organotypiska hjärnskivor, där utvecklande axoner möter fysiologiskt relevanta fysiska och kemiska signaler. Genom att kombinera finjusterad in utero och ex utero elektroporation för att sparsamt leverera fluorescerande reportrar tillsammans med superupplösningsmikroskopi, presenterar detta protokoll en metodologisk pipeline för visualisering av axon- och tillväxtkondynamik in situ. Dessutom ingår en detaljerad verktygslåda beskrivning av analysen av långsiktiga och levande cellavbildningsdata.

Representativa resultat som erhållits med det beskrivna metodarbetsflödet visas. E15.5-möss användes i den aktuella demonstrationen, även om detta protokoll lätt kan anpassas till praktiskt taget alla embryonala åldrar som sträcker sig från E11 till sen E17. I detta protokoll, antingen ex utero elektroporation (EUE; Figur 2A, 2C-I) eller in utero elektroporation (IUE; Figur 2B, C och 2J-Q) användes för att leverera plasmider i stamcellerna som kantar de laterala ventriklerna. Dessa förfäder är källan till framtida kortikala projicerande neuroner (CPN)15,16. Plasmidblandningar bereddes för att driva glest neuronspecifikt uttryck av antingen membraninriktat (Lyn)-mNeonGreen (figur 1A) eller LifeAct-förstärkt (E)GFP (figur 1B) för att utvärdera det övergripande beteendet respektive aktindynamiken i tillväxtkottar. Vidare inkluderades en plasmidblandning som syftade till att märka enskilda neuroner med antingen turbo (t) -RFP eller zoanthus sp. (Zs) grönt fluorescerande protein (ZsGreen) (Figur 1C). Detta underlättar övervakningen av tillväxtkonbeteende från oberoende närliggande neuroner.
Hjärndissektion från elektroporated embryon är ett viktigt steg som måste utföras noggrant för att få högkvalitativa skivor, vilket bevarar den ursprungliga hjärnstrukturen. Dissektionsinstrument och vibratom framställdes i förväg och noggrant etanosteriliserades (figur 3A,B). Därefter dissekerades huvudet på elektroporated embryon noggrant och hjärnorna extraherades. Här visas representativ dissektion av hjärnor från embryon som utsätts för EUE vid E15 (figur 3C-F) och E12.5 (figur 3G-J). Hjärnor innesluts omedelbart i en agarosmatris, skivas och placeras på PTFE-membraninsatser i en bottenglasskål för inkubation (figur 3K-M).
Hälsotillståndet för hjärnskivor är en viktig punkt för kontroll för att säkerställa tillförlitliga resultat. En visuell inspektion för eventuell kontaminering utfördes dagligen. Dessutom, när kulturen var färdigställd, fixeras hjärnskivorna och utsätts för immunohistokemi. Här,4′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) användes för att kontrollera den övergripande cellulära organisationen och vimentinfärgning för att avslöja glial organisation; särskilt radial glia (RG) ställning. Vanligtvis visar framgångsrikt odlade hjärnskivor härledda från antingen IUE eller EUE normal cellulär fördelning som avslöjas av DAPI och en något organiserad uppsättning RG med apiskt orienterade pialkontaktprocesser17 (Figur 4A, B respektive). Ibland observeras markanta störningar i RG-byggnadsställningarna i odlade hjärnskivor, särskilt hos dem som härrör från EUE-elektroporering (figur 4C). Hjärnskivor med extremt oorganiserad RG-ställning visar nedsatt neuronal migration och defekt axontillväxt (visas inte). Därför är kontroll av RG-ställningen en enkel postkulturmetod för att sortera data som erhållits från tillförlitliga hjärnskivor.
Hjärnskivor härledda från antingen IUE eller EUE med Lyn-mNeonGreen-uttryckande plasmidblandning resulterar i liknande gles neuronmärkning. En representativ pyramidal CPN som uttrycker Lyn-mNeonGreen och det dynamiska beteendet hos dess tillväxtkon visas som ett exempel (Figur 5A och kompletterande video 1, uppe till vänster). Dessutom märktes neuroner med hjälp av en plasmid som uttryckte en aktinsond för att analysera aktindynamiken hos axonala tillväxtkottar in situ (Figur 5B och kompletterande video 1, längst ner till vänster). In situ-experiment utfördes också med en dual-Cre / Dre fluorofor-uttryckande plasmiddesign (figur 1C och kompletterande video 1, till höger). tRFP eller ZsGreen fluoroforer i denna plasmid kan specifikt och individuellt aktiveras av antingen Dre respektive Cre recombinases i närliggande neuroner (Figur 5C). Denna experimentella line-up möjliggör sida vid sida analys av tillväxtkottar från kontrollneuroner med närliggande modifierade neuroner (varje given förlust eller vinst av funktion). Detta kringgår variationer som uppstår vid användning av olika skivor för att testa kontroll och experimentella förhållanden.
Kymografer genererade från den inspelade filmen analyserades, från vilka dynamiska tillväxtparametrar som utskjutande aktivitet över tid och tillväxtlängd lätt kan erhållas (Figur 6A). Observera att en enkel justering av tidsfördröjningens tidsmässiga upplösning möjliggör mätning av axonförlängningshastigheten i 2 timmar (figur 6A). Dessutom kan variationen av tillväxtkonvolymen över tiden - ett mått på allmän tillväxtkondynamisk aktivitet - enkelt erhållas, i detta fall med licensierad programvara (figur 6B och figur 6E,F). Detta kan användas för att utvärdera hastigheten på aktin löpband och balansen mellan filopodia / lamellipodia under tillväxt kon utforska aktivitet.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig01.jpg"> Figur 1: Scheman för de plasmider som används i protokollet. (A) pCAG-lox-STOP-lox-Lyn-mNeonGreen. (B) p-Tub-alfa-1-LifeAct-GFP. (C) pCAG-lox-rox-STOP-rox-tRFP-pA-lox-ZsGreen-pA. Relevant information om plasmidkomponenter och fluoroforens ursprung finns i lådorna. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig02.jpg"> Figur 2: Arbetsflöde för ex utero och in utero elektroporation av E15.5 möss. (A) Inrätta en kirurgisk station för ex utero elektroporering. (B) Inrätta en kirurgisk station för in utero elektroporering. (C) Livmoderhorn dras utanför bukhålan hos den sövda musen. D) Extraktion av ett embryo ur livmodersäcken. E) Embryooffer genom fullständig ryggmärgstranssektion via ett diagonalt snitt. Observera att halshuggning undvikits. F) Placering av embryo i hållaren och injicerad med DNA/Fast Green-blandning i vänster lateral ventrikel. (G,H) Placera embryots huvud mellan platinapincettelektroder med katoden (röd pil) över cortex i 60 ° vinkel. I) Placering av embryots armar (svarta pilar) utanför hållaren för att förhindra att embryot glider under ingreppet. J) Embryots rotation inuti livmodersäcken för att exponera huvudet. (K,L) Injektion av DNA / Fast Green-blandning i embryots laterala ventriklar genom livmoderväggen. (M) Placera embryots huvud mellan platinapincettelektroder med en katod (röd pil) över cortex i 60 ° vinkel. (N) Suturerat muskelsnitt via löpande låssutur. (O) Suturerat hudsnitt via en avbruten sutur. (P) Säkring av såret med kirurgiska sårklämmor och desinfektion med betadin. (Q) Placering av musen i återhämtningsburen med långt infrarött värmeljus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig03.jpg"> Figur 3: Extraktion av E15.5 och E12.5 hjärnor och organotypisk skivodlingsprocedur. (A) Verktyg som används för hjärnans extraktion. (B) Inrätta en organotypisk odlingsstation. (C-F) Extraktion av E15.5 hjärna. (G-J) Extraktion av E12.5 hjärna. Prickade linjer markerar placeringen av snitt. Röda pilar pekar ut riktningen för att dra med pincett. (K) Bädda in hjärnan i en 3 cm skål som innehåller 3% låg smältagaros, vilket lämnar ett 1-2 mm agarosavstånd under hjärnan. (L) Insamling av 150 μm hjärnskiva. (M) Placering av hjärnskivor på PTFE-membraninsatser immobiliserade i en 35 mm skål med paraffinfilm (blå pil). Röd stjärnmarkering indikerar en given hjärnskiva från vibratom (L) och dess överföring till PTFE-membran (M). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig04.jpg"> Figur 4: Bevarad radiell gliacellstruktur i friska organotypiska skivor. Konfokala bilder av E17.5 hjärnskivor som avslöjar RG-array (vimentin; grön) och övergripande cellorganisation (DAPI; magenta) efter IUE (A) och EUE (B,C). Observera de starka störningar i RG-matrisen som ibland kan bero på EUE (C). Förstoringar motsvarar de röda prickade ramarna i huvudfiguren: skalstänger, 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig04large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig05.jpg"> Figur 5: In situ-visualisering av tillväxtkondynamiken i akuta organotypiska skivor. (A,B) Neuroner och deras motsvarande tillväxtkottar märkta med Lyn-mNeonGreen respektive LifeAct-GFP. Röd stjärna som markerar tillväxtkon av Lyn-mNeonGreen som uttrycker neuron. Blå asterisk som markerar tillväxtkon av LifeAct-GFP som uttrycker neuron. (C) Angränsande neuroner märkta med det dubbla plasmidsystemet som innehåller tRFP (magenta) och ZsGreen (grön) och deras motsvarande tillväxtkottar. Tillväxtkottar avbildade (höger) var utanför den fångade ramen (vänster), erhållen strax efter förvärv av tillväxtkonens tidsfördröjning; skalstänger, 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig05large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig6v2.jpg"> Figur 6: Analys av axontillväxthastighet och tillväxtkonvolym. (A) Axonspårning på en neuron som uttrycker Lyn-mNeonGreen (överst) och dess motsvarande kymograf (nedan) genererad med hjälp av ImageJ. (B) Rekonstruktion av z-stack video av tillväxtkon med hjälp av bildanalysprogramvaran (överst) och samma tillväxtkon markerad med hjälp av ytmätningsverktyget (nedan). (C) Diagram som visar förändringar i tillväxthastighet över tid för flera axoner. (D) Axonernas genomsnittliga tillväxthastighet kvantifieras i punkt C. (E) Diagram som visar förändringarna i tillväxtkonvolymen över tiden. F) Den genomsnittliga volymen tillväxtkoner kvantifieras i punkt E. skala bar, 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig6v2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig07.jpg"> Figur 7: Radiell migration och neuronal polarisering av pyramidala kortikala neuroner. Diagram som illustrerar att utveckla pyramidala kortikala neuroner (rosa) som migrerar radiellt från den germinala ventrikulära zonen (VZ) mot pia-ytan. Styrd av radiella gliaprocesser (grå) etablerar migrerande polariserade neuroner en ledande process, framtida dendrit och efterföljande process, framtida axon, som fortsätter att sträcka sig nedåt mot mellanzonen (IZ). Streckade röda rutor representerar de kortikala områdena där tillväxtkottar avbildades. Specifikt i IZ, subventrikulär zon (SVZ) eller sammanfogning av axonbuntar (grön). Illustrationen skapades med ett webbaserat verktyg, BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig07large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Plasmid</td>
			<td>Koncentration (μg/μL)</td>
			<td>Avsedd användning</td>
		</tr>
<tr>
<td>pCAG-lox-STOP-lox-Lyn-mNeonGreen</td>
			<td>0.25</td>
			<td rowspan="3">Märkning av membraninriktat protein (Lyn)</td>
		</tr>
<tr>
<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>p-Tub-alfa-1-iCre</td>
			<td>0.08</td>
		</tr>
<tr>
<td>p-Tub-alfa-1-LifeAct-GFP</td>
			<td>0.125</td>
			<td>Märkning av filamentöst aktin (F-aktin) i tillväxtkottar</td>
		</tr>
<tr>
<td>pCAG-lox-rox-STOP-rox-tRFP-lox-Lyn-ZsGreen</td>
			<td>1</td>
			<td rowspan="5">Oberoende märkning av två populationer av närliggande neuroner</td>
		</tr>
<tr>
<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>p-Tub-alfa-1-iCre</td>
			<td>0.004</td>
		</tr>
<tr>
<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>p-Tub-alfa-1-Dre</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: Förteckning över plasmider som används i protokollet. Namn, koncentration och avsedd användning av varje använd plasmid.
Kompletterande video 1: In situ-visualisering av tillväxtkondynamiken i akuta organotypiska skivor. Dynamik i tillväxtkoner märkta med Lyn-mNeonGreen (uppe till vänster) och LifeAct-GFP (nere till vänster). Angränsande tillväxtkottar är differentiellt märkta med det dubbla plasmidsystemet som innehåller tRFP (magenta; uppe till höger) och ZsGreen (grönt; längst ner till höger). Bildintervall, 2,5 s. Skala staplar, 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/Supplementary_Video_1.mp4" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures at JoVE.com

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

Detta protokoll visar en enkel och robust metod för att studera in situ axontillväxt och tillväxtkondynamik. Den beskriver hur man förbereder ex vivo fysiologiskt relevanta akuta hjärnskivor och ger en användarvänlig analyspipeline.

In situ Visualisering av axontillväxt och tillväxtkondynamik i akuta ex vivo embryonala hjärnskivor

During neuronal development, axons navigate the cortical environment to reach their final destinations and establish synaptic connections. Growth cones ...

Hur axoner navigerar i den komplexa matrisen för centrala nervsystemet är en grundläggande fråga inom neurobiologin. Detta protokoll möjliggör studier av axontillväxt och tillväxtkondynamik i den fysiologiska miljön med högupplöst bildbehandling. Detta protokoll beskriver en användarvänlig end-to-end-pipeline för leverans av DNA i musembryons hjärna, förberedelser för högkvalitativa organotypiska skivor och en steg-för-steg-guide för bildförvärv och analys.Även om det ursprungligen utformades för att studera axondynamik i det embryonala centrala nervsystemet, kan detta protokoll justeras för att möjliggöra organotypisk odling och visualisering av axonplasticitet efter traumatiska eller patologiska tillstånd. Protokollet i sig är relativt enkelt. Att uppnå sin första märkning och bevarande av hjärnstrukturer är dock kritiska punkter.Därför kräver elektroporering, hjärndissektion och skivningssteg extra försiktighet. Att demonstrera proceduren kommer att vara till hjälp, och doktoranden är från Brackets laboratorium. Efter att ha bedövat en gravid kvinnlig mus, gör ett snitt för att dra ut båda livmoderhornen med en bomullsknopp blöt i varm saltlösning eller pincett, försiktigt ta tag i utrymmena mellan embryon.Placera sedan embryon på våt gasbindning. Efter att ha klippt upp livmodersäcken, ta bort varje embryo. Placera embryona i en 10 centimeter skål som innehåller HBSS kompletterad med glukos på is.För ex utero elektroporation, plocka upp ett embryo och placera det i hållaren. Sätt sedan försiktigt in glaskapillären som innehåller DNA-snabbgrön blandning genom embryoskallen i laterala ventrikeln och injicera två till tre mikroliter av DNA-plasmidblandningen i varje ventrikel. Håll sedan embryots huvud mellan platinapincettelektroder i lämplig vinkel för att rikta in sig på det önskade hjärnområdet, med katoden vänd mot det område där DNA-överföringen är avsedd.För in utero elektroporation, efter att ha dragit ut livmoderhornen och placerat embryon på en våt gasbindning som visats tidigare, använd fingertopparna för att försiktigt rotera embryot inuti livmodern tills lambdoidala och saggitala suturer är belägna. Sätt sedan försiktigt in glaskapillären som innehåller DNA-snabbgrön blandning genom livmoderväggen och embryoskallet i laterala ventrikeln och injicera två till tre mikroliter av DNA-plasmidblandningen i antingen en eller båda ventriklarna efter önskemål med högst två mikroliter per ventrikel. Efter injektionen, håll embryots huvud mellan platinapincettelektroder i lämplig vinkel för att rikta in sig på det önskade hjärnområdet med katoden vänd mot det område där DNA-överföringen är avsedd.När alla nödvändiga embryon har elektroporats, använd en saltlösning blöt bomullsknopp för att försiktigt placera livmoderhornen tillbaka inuti bukhålan. Suturera muskel- och hudsnitten med 5-0 suturmaterial, säkra sedan såret med suturklämmor och desinficera såret genom att spruta det med betadin. Placera musen tillbaka i återhämtningsburet och behåll värmen med ett långt infrarött värmeljus i minst 20 minuter efterproceduren.Fixa embryots huvud under ett dissektionsmikroskop. Ta sedan bort huden i skallen genom att skära längs mittlinjen från huvudets botten mot näsan. Skala huden i skallen i sidled och gör ett tillräckligt stort gap för att hjärnan ska skäras ut.Därefter, för att ta bort hjärnan, sätt in den slutna spetsen av steril dissektionssax som börjar under luktlampan och rör sig mot hjärnstammen. Skär sedan av hjärnstammen och trimma många lösa bitar av hjärnhinnor runt hjärnan. Använd en perforerad sked, plocka upp hjärnan och ta bort överflödig vätska genom att dutta botten av skeden mot torrt silkespapper.Placera sedan hjärnan i en agarosskål på is. Därefter, med hjälp av en mindre sked blanda agarosen i 10 sekunder för jämn kylning, manövrera sedan hjärnan till mitten av skålen och placera den horisontellt med dorsalsidan uppåt och se till att den är helt täckt med agaros från alla håll. Plocka försiktigt upp agarosblocket från Vibratome-arbetsstationen och torka botten genom att dutta mot silkespapper.Placera sedan blocket på det limmade området av provhållaren med den rostrala sidan av hjärnan uppåt och lägg provhållaren på is. Låt limet torka i en minut. Skär hjärnan i koronala skivor i en vinkel på 15 grader.Använd sedan rena spatlar, samla hjärnskivorna och placera dem på ett PTFE-membran immobiliserat i en 35 millimeter glasbottenskål med Parrafin. Samla upp till fem hjärnskivor per membran. Därefter använder du en 200 mikroliter pipett för att avlägsna överskottet av HBSS-glukoslösning från runt skivorna på membranet och lämnar skivorna halvtorra, tillsätt sedan 500 mikroliter förvärmda skivmedier direkt till utrymmet under membranet och inkubera skivorna vid 35 grader Celsius med 5% koldioxid.För avbildning av axontillväxt, lokalisera en cortexregion med låg till medelhög celldensitet. Medan för avbildning av tillväxtkondynamik, lokalisera en tillväxtkon i cortexens omedelbara zon eller subventrikulära zon. Definiera sedan en Z-stackstorlek.För axontillväxt i en stor Z-stack, ställ in en stegstorlek på två mikrometer och för tillväxtkottar i en mindre Z-stack, ställ in en stegstorlek på en mikrometer. För dataanalys öppnar du bildfilen i Fiji genom att klicka på fil, sedan öppna och välja bilden. Få den maximala intensitetsprojektionen av tidsfördröjningen genom att klicka på bilden, följt av staplar, Z-projektion och maximal intensitetsprojektion.Gå igenom tidsfördröjningen och hitta en växande axon. När du väl är placerad, rita en linje genom den växande axonen, från axonens spets i den första ramen och följ axonen genom hela tidsfördröjningen. Sjung sedan plugin kymo re-slice wide.Ställ in kymografens skala genom att gå till bild och sedan egenskaper. När du har ställt in avståndet i mikrometer och pixelbredd och tiden i sekunder eller minuter och pixelhöjd, gå till analysera och klicka på mått. För att mäta volymen på tillväxtkonen, öppna bildfilen i bildanalysprogramvaran genom att klicka på fil, öppna och välja den fil som är av intresse.Välj sedan guiden Lägg till nya ytor i steg ett, under algoritminställningar väljer du endast segment en region av intresse och i steg två beskär du ramen så att den passar hela tillväxtkonen i alla ramar. Nästa steg tre, håll tröskeln till absolut intensitet och i steg fyra, se till att hela tillväxtkonregionen är tröskel. Sedan i steg fem, under filtertyp, välj antal voxels LMG till en.Välj knappen Kör för att utföra alla skapandesteg och avsluta guiden Lägg till nya ytor. Slutligen, på statistikfliken högst upp i guidefönstret, välj specifika värden och volym under den detaljerade fliken. Typiskt visar framgångsrikt odlade hjärnskivor härledda från antingen in utero eller ex utero elektroporation normal cellulär fördelning och en organiserad uppsättning radiella glia med apikalt orienterade pilokontaktprocesser.Ibland observeras en ex utero elektroporation markerade störningar i radiella glialställningar och odlade hjärnskivor vilket gör denna kontrollfärgning rekommenderad. En representativ pyramidal kortikal projicerande neuron som uttrycker Lyn-mNeonGreen och det dynamiska beteendet hos dess tillväxtkon visas här. Dessutom märktes neuroner med hjälp av en plasmiduttryckande aktinsond för att analysera aktindynamiken hos axonala tillväxtkottar in situ.In situ-experiment utfördes också med en dubbel cre dre fluorofor som uttrycker plasmiddesign, där tRFP eller ZsGreen fluoroforer kunde aktiveras specifikt och individuellt av antingen dre respektive cre recombinases i närliggande neuroner. Från kymografer erhålls enkelt dynamiska tillväxtparametrar som tillväxthastighet för flera axoner och tillväxtkonvolym över tiden. Detta kan användas för att utvärdera hastigheten på aktin löpband och balansen mellan filopodia och lamellapodi under tillväxt kon utforska aktivitet.Det är viktigt att upprätthålla hjärnstrukturen och finjustera plasmidkoncentrationerna för att uppnå gles märkning. Detta är avgörande för noggrann visualisering av axoner och tillväxtkottar i cortex. Beroende på de valda plasmerna och den genetiska bakgrunden tillåter detta protokoll användare att modifiera neuroner eller miljön där de växer vilket möjliggör ett brett spektrum av studier.Genom att möjliggöra högupplöst tillgång till neuroner in situ, gör denna teknik det möjligt för neuroforskare att förhöra den dynamiska interaktionen mellan tillväxtkottar och centrala nervsystemets mätvärden både på morfologisk och molekylär nivå.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

Multi-elektrod Array Inspelningar av neuronala laviner i Organotypic kulturer

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output.  During development, this activity is important for the ...

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

Metoder för studier av Neuronal Morfogenes:<em&gt; Ex vivo</em&gt; RNAi Elektroporation i embryonal Murine Cerebral Cortex

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Funktionell hjärnavbildning med ultraljud Blod-hjärnbarriären störningar och mangan-förstärkt MRT

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinylering: An<em&gt; Ex vivo</em&gt; Metoden att mäta Region specifika Plasma membranprotein handel med vuxna nervceller

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Ex vivo Beredningar av den Intakt vomeronasala orgel och tillbehör luktbulben

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

Organotypic Slice kulturer för att studera Oligodendrocyte Dynamics och myelinisering

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

Slice It Hot: Acute Adult Brain Slicing in Physiological Temperature

Slice It Hot: Akut vuxna hjärnan Skivning i fysiologisk temperatur

Here we present a protocol for preparation of acute brain slices. This procedure is a critical element for electrophysiological patch-clamp experiments ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

Luktsystemet som en modell för att studera axonal tillväxt Mönster och morfologi<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imaging Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dynamik i Cone ljusmätare Axon terminaler i Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Samtidig<em&gt; Ex vivo</em&gt; Funktionstest av två näthinnor efter<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...