In situ Visualisering av axontillväxt och tillväxtkondynamik i akuta ex vivo embryonala hjärnskivor

Hur axoner navigerar i den komplexa matrisen för centrala nervsystemet är en grundläggande fråga inom neurobiologin. Detta protokoll möjliggör studier av axontillväxt och tillväxtkondynamik i den fysiologiska miljön med högupplöst bildbehandling. Detta protokoll beskriver en användarvänlig end-to-end-pipeline för leverans av DNA i musembryons hjärna, förberedelser för högkvalitativa organotypiska skivor och en steg-för-steg-guide för bildförvärv och analys.

Även om det ursprungligen utformades för att studera axondynamik i det embryonala centrala nervsystemet, kan detta protokoll justeras för att möjliggöra organotypisk odling och visualisering av axonplasticitet efter traumatiska eller patologiska tillstånd. Protokollet i sig är relativt enkelt. Att uppnå sin första märkning och bevarande av hjärnstrukturer är dock kritiska punkter.

Därför kräver elektroporering, hjärndissektion och skivningssteg extra försiktighet. Att demonstrera proceduren kommer att vara till hjälp, och doktoranden är från Brackets laboratorium. Efter att ha bedövat en gravid kvinnlig mus, gör ett snitt för att dra ut båda livmoderhornen med en bomullsknopp blöt i varm saltlösning eller pincett, försiktigt ta tag i utrymmena mellan embryon.

Placera sedan embryon på våt gasbindning. Efter att ha klippt upp livmodersäcken, ta bort varje embryo. Placera embryona i en 10 centimeter skål som innehåller HBSS kompletterad med glukos på is.

För ex utero elektroporation, plocka upp ett embryo och placera det i hållaren. Sätt sedan försiktigt in glaskapillären som innehåller DNA-snabbgrön blandning genom embryoskallen i laterala ventrikeln och injicera två till tre mikroliter av DNA-plasmidblandningen i varje ventrikel. Håll sedan embryots huvud mellan platinapincettelektroder i lämplig vinkel för att rikta in sig på det önskade hjärnområdet, med katoden vänd mot det område där DNA-överföringen är avsedd.

För in utero elektroporation, efter att ha dragit ut livmoderhornen och placerat embryon på en våt gasbindning som visats tidigare, använd fingertopparna för att försiktigt rotera embryot inuti livmodern tills lambdoidala och saggitala suturer är belägna. Sätt sedan försiktigt in glaskapillären som innehåller DNA-snabbgrön blandning genom livmoderväggen och embryoskallet i laterala ventrikeln och injicera två till tre mikroliter av DNA-plasmidblandningen i antingen en eller båda ventriklarna efter önskemål med högst två mikroliter per ventrikel. Efter injektionen, håll embryots huvud mellan platinapincettelektroder i lämplig vinkel för att rikta in sig på det önskade hjärnområdet med katoden vänd mot det område där DNA-överföringen är avsedd.

När alla nödvändiga embryon har elektroporats, använd en saltlösning blöt bomullsknopp för att försiktigt placera livmoderhornen tillbaka inuti bukhålan. Suturera muskel- och hudsnitten med 5-0 suturmaterial, säkra sedan såret med suturklämmor och desinficera såret genom att spruta det med betadin. Placera musen tillbaka i återhämtningsburet och behåll värmen med ett långt infrarött värmeljus i minst 20 minuter efterproceduren.

Fixa embryots huvud under ett dissektionsmikroskop. Ta sedan bort huden i skallen genom att skära längs mittlinjen från huvudets botten mot näsan. Skala huden i skallen i sidled och gör ett tillräckligt stort gap för att hjärnan ska skäras ut.

Därefter, för att ta bort hjärnan, sätt in den slutna spetsen av steril dissektionssax som börjar under luktlampan och rör sig mot hjärnstammen. Skär sedan av hjärnstammen och trimma många lösa bitar av hjärnhinnor runt hjärnan. Använd en perforerad sked, plocka upp hjärnan och ta bort överflödig vätska genom att dutta botten av skeden mot torrt silkespapper.

Placera sedan hjärnan i en agarosskål på is. Därefter, med hjälp av en mindre sked blanda agarosen i 10 sekunder för jämn kylning, manövrera sedan hjärnan till mitten av skålen och placera den horisontellt med dorsalsidan uppåt och se till att den är helt täckt med agaros från alla håll. Plocka försiktigt upp agarosblocket från Vibratome-arbetsstationen och torka botten genom att dutta mot silkespapper.

Placera sedan blocket på det limmade området av provhållaren med den rostrala sidan av hjärnan uppåt och lägg provhållaren på is. Låt limet torka i en minut. Skär hjärnan i koronala skivor i en vinkel på 15 grader.

Använd sedan rena spatlar, samla hjärnskivorna och placera dem på ett PTFE-membran immobiliserat i en 35 millimeter glasbottenskål med Parrafin. Samla upp till fem hjärnskivor per membran. Därefter använder du en 200 mikroliter pipett för att avlägsna överskottet av HBSS-glukoslösning från runt skivorna på membranet och lämnar skivorna halvtorra, tillsätt sedan 500 mikroliter förvärmda skivmedier direkt till utrymmet under membranet och inkubera skivorna vid 35 grader Celsius med 5% koldioxid.

För avbildning av axontillväxt, lokalisera en cortexregion med låg till medelhög celldensitet. Medan för avbildning av tillväxtkondynamik, lokalisera en tillväxtkon i cortexens omedelbara zon eller subventrikulära zon. Definiera sedan en Z-stackstorlek.

För axontillväxt i en stor Z-stack, ställ in en stegstorlek på två mikrometer och för tillväxtkottar i en mindre Z-stack, ställ in en stegstorlek på en mikrometer. För dataanalys öppnar du bildfilen i Fiji genom att klicka på fil, sedan öppna och välja bilden. Få den maximala intensitetsprojektionen av tidsfördröjningen genom att klicka på bilden, följt av staplar, Z-projektion och maximal intensitetsprojektion.

Gå igenom tidsfördröjningen och hitta en växande axon. När du väl är placerad, rita en linje genom den växande axonen, från axonens spets i den första ramen och följ axonen genom hela tidsfördröjningen. Sjung sedan plugin kymo re-slice wide.

Ställ in kymografens skala genom att gå till bild och sedan egenskaper. När du har ställt in avståndet i mikrometer och pixelbredd och tiden i sekunder eller minuter och pixelhöjd, gå till analysera och klicka på mått. För att mäta volymen på tillväxtkonen, öppna bildfilen i bildanalysprogramvaran genom att klicka på fil, öppna och välja den fil som är av intresse.

Välj sedan guiden Lägg till nya ytor i steg ett, under algoritminställningar väljer du endast segment en region av intresse och i steg två beskär du ramen så att den passar hela tillväxtkonen i alla ramar. Nästa steg tre, håll tröskeln till absolut intensitet och i steg fyra, se till att hela tillväxtkonregionen är tröskel. Sedan i steg fem, under filtertyp, välj antal voxels LMG till en.

Välj knappen Kör för att utföra alla skapandesteg och avsluta guiden Lägg till nya ytor. Slutligen, på statistikfliken högst upp i guidefönstret, välj specifika värden och volym under den detaljerade fliken. Typiskt visar framgångsrikt odlade hjärnskivor härledda från antingen in utero eller ex utero elektroporation normal cellulär fördelning och en organiserad uppsättning radiella glia med apikalt orienterade pilokontaktprocesser.

Ibland observeras en ex utero elektroporation markerade störningar i radiella glialställningar och odlade hjärnskivor vilket gör denna kontrollfärgning rekommenderad. En representativ pyramidal kortikal projicerande neuron som uttrycker Lyn-mNeonGreen och det dynamiska beteendet hos dess tillväxtkon visas här. Dessutom märktes neuroner med hjälp av en plasmiduttryckande aktinsond för att analysera aktindynamiken hos axonala tillväxtkottar in situ.

In situ-experiment utfördes också med en dubbel cre dre fluorofor som uttrycker plasmiddesign, där tRFP eller ZsGreen fluoroforer kunde aktiveras specifikt och individuellt av antingen dre respektive cre recombinases i närliggande neuroner. Från kymografer erhålls enkelt dynamiska tillväxtparametrar som tillväxthastighet för flera axoner och tillväxtkonvolym över tiden. Detta kan användas för att utvärdera hastigheten på aktin löpband och balansen mellan filopodia och lamellapodi under tillväxt kon utforska aktivitet.

Det är viktigt att upprätthålla hjärnstrukturen och finjustera plasmidkoncentrationerna för att uppnå gles märkning. Detta är avgörande för noggrann visualisering av axoner och tillväxtkottar i cortex. Beroende på de valda plasmerna och den genetiska bakgrunden tillåter detta protokoll användare att modifiera neuroner eller miljön där de växer vilket möjliggör ett brett spektrum av studier.

Genom att möjliggöra högupplöst tillgång till neuroner in situ, gör denna teknik det möjligt för neuroforskare att förhöra den dynamiska interaktionen mellan tillväxtkottar och centrala nervsystemets mätvärden både på morfologisk och molekylär nivå.