Name: transverse fracture of the mouse femur with stabilizing pin
Uploaded: 2021-12-29T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transverse Fracture of the Mouse Femur with Stabilizing Pin at JoVE.com

Nous remercions la Dre Vicki Rosen pour son soutien financier et ses conseils dans le cadre du projet. Nous tenons également à remercier le personnel vétérinaire et IACUC de la Harvard School of Medicine pour leurs consultations concernant la technique stérile, le bien-être des animaux et les matériaux utilisés pour développer ce protocole.

Toutes les expériences sur les animaux décrites ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee du Harvard Medical Area. Des souris C57BL/6J âgées de 12 semaines (mâles et femelles) ont été utilisées dans ce protocole. Les souris mâles et femelles C57BL/6J atteignent une masse osseuse maximale vers l’âge de 12 semaines avec des fémurs suffisamment larges pour s’adapter à une broche stabilisatrice, ce qui en fait une souche appropriée à utiliser pour ce protocole<sup class="xref...

<ol>
	<li>Black, D. M., Rosen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postmenopausal+osteoporosis.">Postmenopausal osteoporosis.</a> The New England Journal of Medicine. 374, 2096-2097 (2016).</li><li>Curtis, E. M., Moon, R. J., Harvey, N. C., Cooper, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+fragility+fracture+and+approaches+to+osteoporosis+risk+assessment+worldwide.">The impact of fragility fracture and approaches to osteoporosis risk assessment worldwide.</a> Bone. 104, 29-38 (2017).</li><li>Laurent, M. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+changes+in+trabecular+architecture+differ+in+female+and+male+C57BL/6J+mice.">Age-related changes in trabecular architecture differ in female and male C57BL/6J mice.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 22, 1197-1207 (2007).</li><li>Garcia, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+technique+for+internal+fixation+of+femoral+fractures+in+mice:+impact+of+stability+on+fracture+healing.">A new technique for internal fixation of femoral fractures in mice: impact of stability on fracture healing.</a> Journal of Biomechanics. 41, 1689-1696 (2008).</li><li>Holstein, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+establishment+of+defined+mouse+models+for+the+study+of+fracture+healing+and+bone+regeneration.">Advances in the establishment of defined mouse models for the study of fracture healing and bone regeneration.</a> Journal of Orthopaedic Trauma. 23, 31-38 (2009).</li><li>Garcia, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rodent+animal+models+of+delayed+bone+healing+and+non-union+formation:+a+comprehensive+review.">Rodent animal models of delayed bone healing and non-union formation: a comprehensive review.</a> European Cells &amp; Materials. 26 (1-12), 12-14 (2013).</li><li>Histing, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+analysis+of+rotational+stiffness+of+different+osteosynthesis+techniques+in+mouse+femur+fracture.">Ex vivo analysis of rotational stiffness of different osteosynthesis techniques in mouse femur fracture.</a> Journal of Orthopaedic Research. 27, 1152-1156 (2009).</li><li>Williams, J. N., Li, Y., Valiya Kambrath, A., Sankar, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Generation+of+closed+femoral+fractures+in+mice:+A+model+to+study+bone+healing.">The Generation of closed femoral fractures in mice: A model to study bone healing.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e58122 (2018).</li><li>Haffner-Luntzer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mouse+model+to+study+fracture+healing+of+the+proximal+femur.">A novel mouse model to study fracture healing of the proximal femur.</a> Journal of Orthopaedic Research. 38, 2131-2138 (2020).</li></ol>

Le modèle de blessure détaillé dans ce protocole englobe les quatre étapes significatives observées lors de la guérison des fractures spontanées, y compris (1) la réponse pro-inflammatoire avec la formation de l’hématome, (2) le recrutement de progéniteurs squelettiques du périoste pour former le callosité molle, (3) la minéralisation du callosité par les ostéoblastes et (4) le remodelage de l’os par les ostéoclastes.
L’intervention chirurgicale décrite dans ce manuscrit...

Les fractures, ruptures dans la continuité de la surface osseuse, se produisent dans tous les segments de la population. Ils deviennent graves chez les personnes dont les os sont fragiles en raison du vieillissement ou d’une maladie, et les coûts des soins de santé liés aux fractures de fragilité devraient dépasser 25 milliards de dollars dans 5 ans 1,2,3,4,5. Comprendre les mécanismes biologiques impliqués dans la réparation des fractures serait un point de départ dans le développement de nouvelles thérapies visant à améliorer le processus de guérison. Des recherches antérieures ont montré que, lors d’une fracture, quatre étapes importantes se produisent qui permettent à l’os de guérir: (1) formation de l’hématome; (2) formation d’un cal fibrocartilagineux; 3° la minéralisation du cal mou pour former l’os; et (4) remodelage de l’os guéri 6,7. De nombreux processus biologiques sont activés pour guérir la fracture avec succès. Tout d’abord, une réponse pro-inflammatoire aiguë est initiée immédiatement après une fracture 6,7. Ensuite, le périoste s’active et se dilate, et les cellules périostées se différencient en chondrocytes pour former un callosité cartilagineuse qui se développe pour combler le vide laissé par les segments osseux perturbés 6,7,8,9. Les cellules neurales et vasculaires envahissent le callosité nouvellement formé pour fournir des cellules supplémentaires et des molécules de signalisation nécessaires pour faciliter la réparation 6,7,8,9,10. En plus de contribuer à la formation de callosités, les cellules périostéales se différencient également en ostéoblastes qui déposent de l’os tissé dans le callosité de pontage. Enfin, les ostéoclastes remodèlent l’os nouvellement formé pour retrouver sa forme et sa structure lamellaire d’origine 7,8,9,10,11. De nombreux groupes ont développé des modèles murins de réparation des fractures. L’un des modèles de fracture les plus anciens et les plus souvent utilisés chez la souris est l’approche d’Einhorn, où un poids est lâché sur la jambe à partir d’une hauteur spécifiquede 12. Le manque de contrôle sur l’angle et la force appliquée pour induire la fracture crée beaucoup de variabilité dans l’emplacement et la taille de la discontinuité osseuse. Par la suite, il en résulte des variations dans la réponse spécifique de guérison des fractures observée. D’autres approches populaires sont l’intervention chirurgicale pour produire un défaut monocortical tibial ou des fractures de stress, des procédures qui induisent des réponses de guérison comparativement plus douces10,13. La variabilité de ces modèles est principalement due à la personne qui effectue la procédure14.
Ici, un modèle détaillé de blessure au fémur de souris permet de contrôler la rupture pour fournir une blessure reproductible et permettre une évaluation quantitative et qualitative de la réparation de la fracture du fémur. Plus précisément, une percée complète dans les fémurs des souris adultes est introduite et stabilise les extrémités de la fracture pour tenir compte du rôle que joue la charge physique dans la guérison osseuse. Les méthodes de prélèvement des tissus et d’imagerie des différentes étapes du processus de guérison à l’aide de l’histologie et de la microterroriste (microCT) sont également fournies en détail.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>23 G x 1 TW IM (0.6 mm x 2 5mm) needle</td>
			<td>BD precision</td>
			<td>305193</td>
			<td>Use as guide needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 G x 1 &#188; (0.4 mm x 30 mm)</td>
			<td>BD precision</td>
			<td>305136</td>
			<td>Use as stabilizing pin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9 mm wound autoclip applier/remover/clips kit</td>
			<td>Braintree Scientific, INC</td>
			<td>ACS-KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian Blue 8 GX</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>10350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>AX1303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circular blade X926.7 THIN-FLEX</td>
			<td>Abrasive technologies</td>
			<td>CELBTFSG633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DREMEL 7700-1/15, 7.2 V Rotary Tool Kit</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>7700 1/15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>7111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine curved dissecting forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxulin Gill 2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>GHS216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>HX0603-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>07-893-1389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgical kit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>95042-540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orange G</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phloxine B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-Iodine Swabs</td>
			<td>PDI</td>
			<td>S23125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCANCO Medical &#181;CT35</td>
			<td>Scanco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slow-release buprenorphine</td>
			<td>Zoopharm</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transverse fracture of the mouse femur with stabilizing pin

La réparation des fractures est une fonction essentielle du squelette qui ne peut pas être modélisée de manière fiable in vitro. Un modèle de blessure chez la souris est une approche efficace pour tester si un gène, un produit génétique ou un médicament influence la réparation osseuse, car les os murins récapitulent les étapes observées lors de la guérison des fractures humaines. Lorsqu’une souris ou un humain casse un os, une réponse inflammatoire est déclenchée et le périoste, une niche de cellules souches entourant l’os lui-même, est activé et se dilate. Les cellules résidant dans le périoste se différencient alors pour former un callosité molle vascularisée. La transition du callosité molle à un callosité dure se produit lorsque les cellules progénitrices squelettiques recrutées se différencient en cellules minéralisantes, et le pontage des extrémités fracturées entraîne l’union osseuse. Le cal minéralisé subit ensuite un remodelage pour restaurer la forme et la structure d’origine de l’os guéri. La guérison des fractures a été étudiée chez la souris à l’aide de divers modèles de blessures. Pourtant, la meilleure façon de récapituler l’ensemble de ce processus biologique est de percer la section transversale d’un os long qui englobe les deux cortex. Ce protocole décrit comment une fracture transversale du fémur stabilisée peut être réalisée en toute sécurité pour évaluer la guérison chez les souris adultes. Un protocole chirurgical comprenant des techniques détaillées de prélèvement et d’imagerie pour caractériser les différentes étapes de la cicatrisation des fractures est également fourni.

Chez les souris C57BL / 6J, une chirurgie réussie complète les étapes de guérison mentionnées précédemment avec peu ou pas de réponse inflammatoire locale ou d’implication périostéale dans le fémur controlatéral opéré par simulacre. Un hématome se forme quelques heures après la chirurgie et le périoste est activé pour recruter des progéniteurs squelettiques pour la chondrogenèse. Diverses populations cellulaires, telles que les progéniteurs mésenchymateux Prx1+ , peuvent être tracées ...

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Transverse Fracture of the Mouse Femur with Stabilizing Pin

Ce protocole décrit une méthode pour effectuer des fractures sur des souris adultes et surveiller le processus de guérison.

Fracture transversale du fémur de la souris avec broche stabilisatrice

Fracture repair is an essential function of the skeleton that cannot be reliably modeled in vitro. A mouse injury model is an efficient approach to test ...

Ce protocole décrit une technique fiable pour effectuer et étudier la fracture du fémur sur des souris adultes. Cette technique est facile, rapide et nécessite un minimum d’outils à effectuer. Il permet de caractériser différentes étapes de la cicatrisation des fractures.Les individus peuvent d’abord avoir du mal à aligner correctement les extrémités de la fracture et à créer des fractures cohérentes entre les souris. En portant une attention particulière au site de fracture, à l’insertion de l’épingle et à la fermeture de la plaie améliorera le succès de cette chirurgie. Pour commencer, préparez l’animal en injectant 0,05 milligramme par kilogramme de buprénorphine par voie sous-cutanée.À l’aide d’une tondeuse électrique, rasez un carré de deux centimètres sur deux sur les deux cuisses correspondant à l’emplacement du fémur. Stériliser une zone rasée à l’iode et rincer avec une solution d’éthanol à 70%. Faites une incision de cinq millimètres et exposez le fascia sous-jacent.Exposez le muscle recouvrant le fémur en coupant le fascia. Séparez le muscle du fémur sans endommager le tissu, puis détachez le muscle de l’os et fixez le fémur pour faire une coupure. Faites une coupe transversale au milieu de la tige du fémur.Insérez une aiguille guide à travers la section distale de la cavité de la moelle et poussez le fil à travers l’articulation du genou. Ensuite, retirez l’aiguille de guidage et effectuez une procédure similaire à partir de l’extrémité proximale. Laissez l’aiguille dans l’extrémité proximale avec sa pointe émergée au-dessus de la peau.Insérez une broche stabilisatrice à l’intérieur de la pointe de l’aiguille de guidage, en la poussant de manière à ce qu’elle pénètre dans la cavité proximale lorsque l’aiguille de guidage est retirée, puis jetez l’aiguille de guidage. Alignez l’extrémité distale avec l’extrémité proximale de sorte que le fil soit passé à travers la cavité de la moelle distale lorsqu’il sort de l’articulation du genou. Tirez l’extrémité de la broche à l’aide d’une pince chirurgicale afin que les sections proximale et distale soient rapprochées.Ensuite, pliez les extrémités de la broche chirurgicale vers le site de la fracture pour réaligner les extrémités de la fracture. À l’aide de coupe-fils, retirez le plastique de la base de l’aiguille. Tournez les extrémités de l’épingle pour éviter toute blessure aux tissus internes.Enfin, remplacez les muscles sur le fémur et fermez l’ouverture de la plaie en pinçant la peau avec des clips. Effectuez une procédure similaire sans fracture du fémur sur l’autre jambe et fermez la plaie. Après la chirurgie réussie, l’imagerie fluorescente a révélé divers progéniteurs messent-kinaux, tels que les cellules périostées Prx1 positives, qui ont été trouvées au cours du processus de réparation de la fracture du fémur.La coloration bleu Alcian du fémur fracturé a révélé la formation de callosités molles. En outre, le pourcentage de formation de callosité ou de cartilage a également été déterminé. En utilisant la micro-tomodensitométrie environ 28 jours après la fracture, le processus de minéralisation a été détecté ainsi que l’écart de callosité et l’écart de fracture.Il a également été observé que si les extrémités de fracture n’étaient pas alignées correctement ou fixées avec une épingle, il y avait un manque de formation insensible sur tout ou un côté de l’extrémité de fracture. Lorsque vous tentez cette procédure, n’oubliez pas d’aligner soigneusement les deux extrémités du fémur cassé et de les stabiliser avec l’épingle pour assurer une bonne guérison. Après la chirurgie, le fémur peut être prélevé pour l’imagerie et l’analyse moléculaire.

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