Name: transverse fracture of the mouse femur with stabilizing pin
Uploaded: 2021-12-29T13:30:00
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Ringraziamo la dott.ssa Vicki Rosen per il supporto finanziario e la guida con il progetto. Vorremmo anche ringraziare il personale veterinario e IACUC della Harvard School of Medicine per la consultazione riguardante la tecnica sterile, il benessere degli animali e i materiali utilizzati per sviluppare questo protocollo.

Tutti gli esperimenti sugli animali descritti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee dell'Harvard Medical Area. In questo protocollo sono stati utilizzati topi C57BL/6J di 12 settimane (maschi e femmine). I topi maschi e femmine C57BL / 6J raggiungono il picco di massa ossea intorno alle 12 settimane di età con i femori abbastanza larghi da adattarsi a un perno stabilizzatore, rendendoli un ceppo appropriato da utilizzare per questo protocollo15.
<p class="jove_...

<ol>
	<li>Black, D. M., Rosen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postmenopausal+osteoporosis.">Postmenopausal osteoporosis.</a> The New England Journal of Medicine. 374, 2096-2097 (2016).</li><li>Curtis, E. M., Moon, R. J., Harvey, N. C., Cooper, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+fragility+fracture+and+approaches+to+osteoporosis+risk+assessment+worldwide.">The impact of fragility fracture and approaches to osteoporosis risk assessment worldwide.</a> Bone. 104, 29-38 (2017).</li><li>Laurent, M. 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R., Garla, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fracture+healing+overview.">Fracture healing overview.</a> StatPearls. , (2021).</li><li>Holmes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Closing+the+gap.">Closing the gap.</a> Nature. 550, 194-195 (2017).</li><li>Duchamp de Lageneste, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periosteum+contains+skeletal+stem+cells+with+high+bone+regenerative+potential+controlled+by+Periostin.">Periosteum contains skeletal stem cells with high bone regenerative potential controlled by Periostin.</a> Nature Communications. 9, 773 (2018).</li><li>Bahney, C. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblast-derived+VEGF+regulates+osteoblast+differentiation+and+bone+formation+during+bone+repair.">Osteoblast-derived VEGF regulates osteoblast differentiation and bone formation during bone repair.</a> Journal of Clinical Investigation. 126, 509-526 (2016).</li><li>Collier, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+reproducible+model+of+fracture+healing+in+mice+using+an+open+femoral+osteotomy.">Characterization of a reproducible model of fracture healing in mice using an open femoral osteotomy.</a> Bone Reports. 12, 100250 (2020).</li><li>Glatt, V., Canalis, E., Stadmeyer, L., Bouxsein, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+changes+in+trabecular+architecture+differ+in+female+and+male+C57BL/6J+mice.">Age-related changes in trabecular architecture differ in female and male C57BL/6J mice.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 22, 1197-1207 (2007).</li><li>Garcia, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+technique+for+internal+fixation+of+femoral+fractures+in+mice:+impact+of+stability+on+fracture+healing.">A new technique for internal fixation of femoral fractures in mice: impact of stability on fracture healing.</a> Journal of Biomechanics. 41, 1689-1696 (2008).</li><li>Holstein, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+establishment+of+defined+mouse+models+for+the+study+of+fracture+healing+and+bone+regeneration.">Advances in the establishment of defined mouse models for the study of fracture healing and bone regeneration.</a> Journal of Orthopaedic Trauma. 23, 31-38 (2009).</li><li>Garcia, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rodent+animal+models+of+delayed+bone+healing+and+non-union+formation:+a+comprehensive+review.">Rodent animal models of delayed bone healing and non-union formation: a comprehensive review.</a> European Cells &amp; Materials. 26 (1-12), 12-14 (2013).</li><li>Histing, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+analysis+of+rotational+stiffness+of+different+osteosynthesis+techniques+in+mouse+femur+fracture.">Ex vivo analysis of rotational stiffness of different osteosynthesis techniques in mouse femur fracture.</a> Journal of Orthopaedic Research. 27, 1152-1156 (2009).</li><li>Williams, J. N., Li, Y., Valiya Kambrath, A., Sankar, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Generation+of+closed+femoral+fractures+in+mice:+A+model+to+study+bone+healing.">The Generation of closed femoral fractures in mice: A model to study bone healing.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e58122 (2018).</li><li>Haffner-Luntzer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mouse+model+to+study+fracture+healing+of+the+proximal+femur.">A novel mouse model to study fracture healing of the proximal femur.</a> Journal of Orthopaedic Research. 38, 2131-2138 (2020).</li></ol>

Il modello di lesione dettagliato in questo protocollo comprende tutti e quattro i passaggi significativi osservati durante la guarigione delle fratture spontanee, tra cui (1) risposta pro-infiammatoria con la formazione dell'ematoma, (2) reclutamento di progenitori scheletrici dal periostio per formare il callo molle, (3) mineralizzazione del callo da parte degli osteoblasti e (4) rimodellamento dell'osso da parte degli osteoclasti.
La procedura chirurgica descritta in questo manoscritto è o...

Fratture, rotture nella continuità della superficie ossea, si verificano in tutti i segmenti della popolazione. Diventano gravi nelle persone che hanno ossa fragili a causa dell'invecchiamento o della malattia e i costi sanitari delle fratture da fragilità dovrebbero superare i 25 miliardi di dollari in 5 anni 1,2,3,4,5. Comprendere i meccanismi biologici coinvolti nella riparazione delle fratture sarebbe un punto di partenza per lo sviluppo di nuove terapie volte a migliorare il processo di guarigione. Ricerche precedenti hanno dimostrato che, dopo la frattura, si verificano quattro passaggi significativi che consentono all'osso di guarire: (1) formazione dell'ematoma; (2) formazione di un callo fibrocartilagineo; (3) mineralizzazione del callo molle per formare l'osso; e (4) rimodellamento dell'osso guarito 6,7. Molti processi biologici sono attivati per guarire con successo la frattura. In primo luogo, una risposta pro-infiammatoria acuta viene avviata immediatamente dopo una frattura 6,7. Quindi, il periostio si attiva e si espande, e le cellule periosteali si differenziano in condrociti per formare un callo cartilagineo che cresce per riempire il vuoto lasciato dai segmenti ossei interrotti 6,7,8,9. Le cellule neurali e vascolari invadono il callo appena formato per fornire ulteriori cellule e molecole di segnalazione necessarie per facilitare la riparazione 6,7,8,9,10. Oltre a contribuire alla formazione del callo, le cellule periosteali si differenziano anche in osteoblasti che depongono l'osso tessuto nel callo ponte. Infine, gli osteoclasti rimodellano l'osso appena formato per tornare alla sua forma originale e alla struttura lamellare 7,8,9,10,11. Molti gruppi hanno sviluppato modelli murini di riparazione delle fratture. Uno dei primi e più spesso utilizzati modelli di frattura nei topi è l'approccio Einhorn, in cui un peso viene lasciato cadere sulla gamba da un'altezza specifica12. La mancanza di controllo sull'angolo e la forza applicata per indurre la frattura crea molta variabilità nella posizione e nelle dimensioni della discontinuità ossea. Successivamente, si traduce in variazioni nella specifica risposta di guarigione della frattura osservata. Altri approcci popolari sono l'intervento chirurgico per produrre un difetto monocorticale tibiale o fratture da stress, procedure che inducono risposte di guarigione relativamente più lievi10,13. La variabilità in questi modelli è dovuta principalmente alla persona che conduce la procedura14.
Qui, un modello dettagliato di lesione del femore del topo consente il controllo della rottura per fornire una lesione riproducibile e consentire una valutazione quantitativa e qualitativa della riparazione della frattura del femore. In particolare, viene introdotta una svolta completa nei femori dei topi adulti e stabilizza le estremità della frattura per tenere conto del ruolo che il carico fisico gioca nella guarigione ossea. I metodi per la raccolta dei tessuti e l'imaging delle diverse fasi del processo di guarigione utilizzando l'istologia e la tomografia microinciuta (microCT) sono anche forniti in dettaglio.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>23 G x 1 TW IM (0.6 mm x 2 5mm) needle</td>
			<td>BD precision</td>
			<td>305193</td>
			<td>Use as guide needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 G x 1 &#188; (0.4 mm x 30 mm)</td>
			<td>BD precision</td>
			<td>305136</td>
			<td>Use as stabilizing pin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9 mm wound autoclip applier/remover/clips kit</td>
			<td>Braintree Scientific, INC</td>
			<td>ACS-KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian Blue 8 GX</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>10350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>AX1303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circular blade X926.7 THIN-FLEX</td>
			<td>Abrasive technologies</td>
			<td>CELBTFSG633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DREMEL 7700-1/15, 7.2 V Rotary Tool Kit</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>7700 1/15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>7111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine curved dissecting forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxulin Gill 2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>GHS216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>HX0603-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>07-893-1389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgical kit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>95042-540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orange G</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phloxine B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-Iodine Swabs</td>
			<td>PDI</td>
			<td>S23125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCANCO Medical &#181;CT35</td>
			<td>Scanco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slow-release buprenorphine</td>
			<td>Zoopharm</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transverse fracture of the mouse femur with stabilizing pin

La riparazione della frattura è una funzione essenziale dello scheletro che non può essere modellata in modo affidabile in vitro. Un modello di lesione del topo è un approccio efficiente per verificare se un gene, un prodotto genico o un farmaco influenza la riparazione ossea perché le ossa murine ricapitolano le fasi osservate durante la guarigione delle fratture umane. Quando un topo o un essere umano rompe un osso, viene avviata una risposta infiammatoria e il periostio, una nicchia di cellule staminali che circonda l'osso stesso, viene attivato e si espande. Le cellule che risiedono nel periostio si differenziano quindi per formare un callo molle vascolarizzato. La transizione dal callo molle a un callo duro avviene quando le cellule progenitrici scheletriche reclutate si differenziano in cellule mineralizzanti e il ponte delle estremità fratturate si traduce nell'unione ossea. Il callo mineralizzato subisce quindi un rimodellamento per ripristinare la forma e la struttura originali dell'osso guarito. La guarigione delle fratture è stata studiata nei topi utilizzando vari modelli di lesioni. Tuttavia, il modo migliore per ricapitolare l'intero processo biologico è quello di sfondare la sezione trasversale di un osso lungo che comprende entrambe le cortecce. Questo protocollo descrive come una frattura del femore trasversale stabilizzata può essere eseguita in modo sicuro per valutare la guarigione nei topi adulti. Viene inoltre fornito un protocollo chirurgico che include tecniche dettagliate di raccolta e imaging per caratterizzare le diverse fasi della guarigione delle fratture.

Nei topi C57BL / 6J, un intervento chirurgico di successo completa le fasi di guarigione menzionate in precedenza con poca o nessuna risposta infiammatoria locale o coinvolgimento periostale nel femore controlaterale operato da finzione. Un ematoma si forma poche ore dopo l'intervento chirurgico e il periostio viene attivato per reclutare progenitori scheletrici per la condrogenesi. Varie popolazioni cellulari, come i progenitori mesenchimali Prx1+, possono essere rintracciate durante il processo di riparazion...

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Transverse Fracture of the Mouse Femur with Stabilizing Pin

Questo protocollo descrive un metodo per eseguire fratture su topi adulti e monitorare il processo di guarigione.

Frattura trasversale del femore del topo con perno stabilizzante

Fracture repair is an essential function of the skeleton that cannot be reliably modeled in vitro. A mouse injury model is an efficient approach to test ...

Questo protocollo descrive una tecnica affidabile per eseguire e studiare la frattura del femore su topi adulti. Questa tecnica è facile, veloce e richiede strumenti minimi da eseguire. Permette la caratterizzazione di diverse fasi di guarigione delle fratture.Gli individui possono inizialmente lottare con il corretto allineamento delle estremità della frattura e la creazione di fratture coerenti tra i topi. Prestare molta attenzione al sito di frattura, all'inserimento del perno e alla chiusura della ferita migliorerà il successo di questo intervento chirurgico. Per iniziare, preparare l'animale iniettando 0,05 milligrammi per chilogrammo di buprenorfina per via sottocutanea.Usando un trimmer elettrico radere un quadrato di due per due centimetri su entrambe le cosce corrispondenti alla posizione del femore. Sterilizzare un'area rasata usando iodio e risciacquare con una soluzione di etanolo al 70%. Fai un'incisione di cinque millimetri ed esponi la fascia sottostante.Esporre il muscolo che copre il femore tagliando la fascia. Separare il muscolo dal femore senza danneggiare il tessuto, quindi staccare il muscolo dall'osso e fissare il femore per fare un taglio. Fai un taglio trasversale nel mezzo dell'albero del femore.Inserire un ago guida attraverso la sezione distale della cavità midollare e spingere il filo attraverso l'articolazione del ginocchio. Quindi, rimuovere l'ago guida ed eseguire una procedura simile dall'estremità prossimale. Lasciare l'ago nell'estremità prossimale con la sua punta emersa sopra la pelle.Inserire un perno stabilizzatore all'interno della punta dell'ago guida, spingendolo in modo che entri nella cavità prossimale mentre l'ago guida viene estratto, quindi scartare l'ago guida. Allineare l'estremità distale con l'estremità prossimale in modo che il filo venga fatto passare attraverso la cavità distale del midollo mentre esce dall'articolazione del ginocchio. Tirare la punta del perno usando un morsetto chirurgico in modo che le sezioni prossimale e distale siano tirate insieme.Quindi piegare le estremità del perno chirurgico verso il sito di frattura per riallineare le estremità della frattura. Usando tagliafili rimuovere la plastica dalla base dell'ago. Ruotare le estremità del perno per evitare qualsiasi lesione del tessuto interno.Infine, sostituire i muscoli sul femore e chiudere l'apertura della ferita pizzicando la pelle insieme alle clip. Eseguire una procedura simile senza la frattura del femore sull'altra gamba e chiudere la ferita. Dopo il successo dell'intervento chirurgico, l'imaging fluorescente ha rivelato vari progenitori Messent-Kinal, come le cellule periosteali Prx1-positive, che sono state trovate durante il processo di riparazione della frattura del femore.La colorazione blu alciana del femore fratturato ha rivelato la formazione di callo morbido. Inoltre, è stata determinata anche la percentuale della formazione del callo o della cartilagine. Impiegando la Micro-TC a circa 28 giorni dopo la frattura, il processo di mineralizzazione è stato rilevato insieme al gap del callo e al gap di frattura.È stato anche osservato che se le estremità della frattura non erano allineate correttamente o fissate con un perno, c'era una mancanza di formazione insensibile su tutto o un lato dell'estremità della frattura. Quando si tenta questa procedura, ricordarsi di allineare attentamente le due estremità del femore rotto e stabilizzarle con il perno per garantire una corretta guarigione. Dopo l'intervento chirurgico, il femore può essere raccolto per l'imaging e l'analisi molecolare.

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