Name: transverse fracture of the mouse femur with stabilizing pin
Uploaded: 2021-12-29T13:30:00
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私たちは、このプロジェクトの財政的支援と指導に対してVicki Rosen博士に感謝します。また、ハーバード大学医学部の獣医およびIACUCのスタッフには、滅菌技術、動物の幸福、およびこのプロトコルの開発に使用された材料に関する相談に感謝します。

記載されているすべての動物実験は、ハーバード大学医療分野の施設動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。12週齢のC57BL/6Jマウス(雄および雌)をこのプロトコールで使用した。C57BL/6J雄および雌マウスは、安定化ピンに収まるのに十分な幅の大腿骨を有する12週齢前後にピーク骨量を達成し、このプロトコル15に使用するのに適した株となっている。
<p class="j...

<ol>
	<li>Black, D. M., Rosen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postmenopausal+osteoporosis.">Postmenopausal osteoporosis.</a> The New England Journal of Medicine. 374, 2096-2097 (2016).</li><li>Curtis, E. M., Moon, R. J., Harvey, N. C., Cooper, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+fragility+fracture+and+approaches+to+osteoporosis+risk+assessment+worldwide.">The impact of fragility fracture and approaches to osteoporosis risk assessment worldwide.</a> Bone. 104, 29-38 (2017).</li><li>Laurent, M. 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R., Garla, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fracture+healing+overview.">Fracture healing overview.</a> StatPearls. , (2021).</li><li>Holmes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Closing+the+gap.">Closing the gap.</a> Nature. 550, 194-195 (2017).</li><li>Duchamp de Lageneste, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periosteum+contains+skeletal+stem+cells+with+high+bone+regenerative+potential+controlled+by+Periostin.">Periosteum contains skeletal stem cells with high bone regenerative potential controlled by Periostin.</a> Nature Communications. 9, 773 (2018).</li><li>Bahney, C. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblast-derived+VEGF+regulates+osteoblast+differentiation+and+bone+formation+during+bone+repair.">Osteoblast-derived VEGF regulates osteoblast differentiation and bone formation during bone repair.</a> Journal of Clinical Investigation. 126, 509-526 (2016).</li><li>Collier, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+reproducible+model+of+fracture+healing+in+mice+using+an+open+femoral+osteotomy.">Characterization of a reproducible model of fracture healing in mice using an open femoral osteotomy.</a> Bone Reports. 12, 100250 (2020).</li><li>Glatt, V., Canalis, E., Stadmeyer, L., Bouxsein, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+changes+in+trabecular+architecture+differ+in+female+and+male+C57BL/6J+mice.">Age-related changes in trabecular architecture differ in female and male C57BL/6J mice.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 22, 1197-1207 (2007).</li><li>Garcia, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+technique+for+internal+fixation+of+femoral+fractures+in+mice:+impact+of+stability+on+fracture+healing.">A new technique for internal fixation of femoral fractures in mice: impact of stability on fracture healing.</a> Journal of Biomechanics. 41, 1689-1696 (2008).</li><li>Holstein, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+establishment+of+defined+mouse+models+for+the+study+of+fracture+healing+and+bone+regeneration.">Advances in the establishment of defined mouse models for the study of fracture healing and bone regeneration.</a> Journal of Orthopaedic Trauma. 23, 31-38 (2009).</li><li>Garcia, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rodent+animal+models+of+delayed+bone+healing+and+non-union+formation:+a+comprehensive+review.">Rodent animal models of delayed bone healing and non-union formation: a comprehensive review.</a> European Cells &amp; Materials. 26 (1-12), 12-14 (2013).</li><li>Histing, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+analysis+of+rotational+stiffness+of+different+osteosynthesis+techniques+in+mouse+femur+fracture.">Ex vivo analysis of rotational stiffness of different osteosynthesis techniques in mouse femur fracture.</a> Journal of Orthopaedic Research. 27, 1152-1156 (2009).</li><li>Williams, J. N., Li, Y., Valiya Kambrath, A., Sankar, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Generation+of+closed+femoral+fractures+in+mice:+A+model+to+study+bone+healing.">The Generation of closed femoral fractures in mice: A model to study bone healing.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e58122 (2018).</li><li>Haffner-Luntzer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mouse+model+to+study+fracture+healing+of+the+proximal+femur.">A novel mouse model to study fracture healing of the proximal femur.</a> Journal of Orthopaedic Research. 38, 2131-2138 (2020).</li></ol>

このプロトコールで詳述されている傷害モデルは、(1)血腫の形成を伴う炎症促進反応、(2)軟質カルスを形成するための骨膜からの骨格前駆細胞の動員、(3)骨芽細胞によるカルスの石灰化および(4)破骨細胞による骨のリモデリングを含む、自然骨折の治癒中に観察される4つの重要なステップすべてを包含する。
この原稿に記載された外科的処置は、少なくとも12週齢の成?...

骨折、骨表面の連続性の切断は、集団のすべてのセグメントで起こる。彼らは老化や病気のために壊れやすい骨を持っている人々で重篤になり、脆弱性骨折の医療費は5年間で250億ドルを超えると予想されています1,2,3,4,5。骨折修復に関与する生物学的メカニズムを理解することは、治癒プロセスを強化することを目的とした新しい治療法を開発する際の出発点となるでしょう。以前の研究では、骨折時に、骨を治癒させる4つの重要なステップが起こることが示されている:(1)血腫の形成;(2)線維軟骨カルスの形成;(3)軟質カルスの石灰化により骨を形成する工程;(4)治癒した骨のリモデリング 6,7.多くの生物学的プロセスは、骨折を正常に治癒するために活性化される。第1に、急性炎症促進反応が骨折の直後に開始される6,7。そして、骨膜が活性化・膨張し、骨膜細胞が軟骨細胞に分化して軟骨カルスを形成し、破壊された骨セグメント6、7、8、9によって残された隙間を埋めるために成長する。神経および血管細胞は、新たに形成されたカルスに侵入して、修復を容易にするために必要な追加の細胞およびシグナル伝達分子を提供する6、7、8、9、10。カルス形成に寄与することに加えて、骨膜細胞はまた、架橋カルスに織り込まれた骨を横たえる骨芽細胞に分化する。最後に、破骨細胞は、新しく形成された骨を元の形状および層状構造7、8、9、10、11に戻すように改造する。多くのグループが骨折修復のマウスモデルを開発した。マウスにおいてより早く、最も頻繁に使用される骨折モデルの1つは、特定の身長から脚に体重を落とすアインホーンアプローチである12。角度と骨折を誘発するために加えられる力に対する制御の欠如は、骨の不連続性の位置およびサイズに多くの変動性を作り出す。続いて、観察される特定の骨折治癒応答に変動をもたらす。他の一般的なアプローチは、脛骨単皮質欠損またはストレス骨折を生じる外科的介入であり、比較的穏やかな治癒応答を誘導する手順である10、13。これらのモデルにおける変動性は、主に、手順14を実施する人によるものである。
ここで、詳細なマウス大腿骨損傷モデルは、再現性のある傷害を提供し、大腿骨骨折修復の定量的および定性的評価を可能にするために、骨折の制御を可能にする。具体的には、成体マウスの大腿骨に完全なブレークスルーが導入され、骨折端を安定させて、骨治癒において物理的負荷が果たす役割を説明する。組織を採取し、組織学およびマイクロコンピュータ断層撮影法(microCT)を用いて治癒プロセスの異なるステップを画像化するための方法も詳細に提供される。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>23 G x 1 TW IM (0.6 mm x 2 5mm) needle</td>
			<td>BD precision</td>
			<td>305193</td>
			<td>Use as guide needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 G x 1 &#188; (0.4 mm x 30 mm)</td>
			<td>BD precision</td>
			<td>305136</td>
			<td>Use as stabilizing pin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9 mm wound autoclip applier/remover/clips kit</td>
			<td>Braintree Scientific, INC</td>
			<td>ACS-KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian Blue 8 GX</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>10350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>AX1303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circular blade X926.7 THIN-FLEX</td>
			<td>Abrasive technologies</td>
			<td>CELBTFSG633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DREMEL 7700-1/15, 7.2 V Rotary Tool Kit</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>7700 1/15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>7111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine curved dissecting forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxulin Gill 2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>GHS216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>HX0603-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>07-893-1389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgical kit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>95042-540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orange G</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phloxine B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-Iodine Swabs</td>
			<td>PDI</td>
			<td>S23125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCANCO Medical &#181;CT35</td>
			<td>Scanco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slow-release buprenorphine</td>
			<td>Zoopharm</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transverse fracture of the mouse femur with stabilizing pin

骨折修復は、 インビトロで確実にモデル化することができない骨格の不可欠な機能である。マウス傷害モデルは、マウスの骨がヒトの骨折治癒中に観察された段階を再現するため、遺伝子、遺伝子産物、または薬物が骨の修復に影響を与えるかどうかをテストするための効率的なアプローチです。マウスやヒトが骨を折ると炎症反応が始まり、骨自体を囲む幹細胞ニッチである骨膜が活性化され、膨張します。その後、骨膜に生息する細胞が分化し、血管新生ソフトカルスを形成する。軟カルスから硬質カルスへの移行は、動員された骨格前駆細胞が石灰化細胞に分化し、骨折した末端の架橋が骨結合をもたらすときに起こる。その後、石灰化したカルスは、治癒した骨の元の形状と構造を復元するために改造を受けます。骨折治癒は、様々な傷害モデルを用いてマウスにおいて研究されている。それでも、この生物学的プロセス全体を再現する最良の方法は、両方の皮質を含む長骨の断面を突破することです。このプロトコルは、成体マウスの治癒を評価するために、安定化された横大腿骨骨折を安全に行うことができる方法を記述している。骨折治癒のさまざまな段階を特徴付けるための詳細な収穫および画像化技術を含む外科的プロトコルも提供される。

C57BL/6Jマウスでは、手術が成功すれば、偽手術を受けた対側大腿骨への局所炎症反応または骨膜関与がほとんどまたはまったくなく、前述の治癒ステップが完了します。手術の数時間後に血腫が形成され、骨膜が活性化されて軟骨形成のために骨格前駆細胞を募集する。Prx1+ 間葉系前駆細胞などの様々な細胞集団を、市販の蛍光レポーターマウスモデルを用いて修復プロセス中にトレ...

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Transverse Fracture of the Mouse Femur with Stabilizing Pin

このプロトコルは、成体マウスに骨折を行い、治癒過程を監視する方法を記載する。

安定化ピン付きマウス大腿骨の横骨折

Fracture repair is an essential function of the skeleton that cannot be reliably modeled in vitro. A mouse injury model is an efficient approach to test ...

このプロトコールは、成体マウスで大腿骨骨折を実行および研究するための信頼できる技術を記載している。このテクニックは簡単で高速で、実行するツールは最小限で済みます。これは、骨折治癒の異なる段階の特徴付けを可能にする。個体は、最初に骨折端を適切に整列させ、マウス間で一貫した骨折を作り出すことに苦労するかもしれない。骨折部位に細心の注意を払って、ピンの挿入および創傷の閉鎖は、この手術の成功を改善する。まず、ブプレノルフィン1kgあたり0.05ミリグラムを皮下に注射して動物を準備します。電動トリマーを用いて、大腿骨の位置に対応する両大腿部に2×2センチメートル四方を剃る。ヨウ素を使用して剃った部分を滅菌し、70%エタノール溶液ですすいでください。5ミリメートルの切開を行い、下層の筋膜を露出させる。筋膜を切断して大腿骨を覆う筋肉を露出させる。組織を傷つけることなく筋肉を大腿骨から分離し、筋肉を骨から切り離し、大腿骨を固定して切り込みを入れます。大腿骨シャフトの中央に横方向の切断を行います。骨髄腔の遠位部にガイド針を挿入し、膝関節に糸を押し込みます。次に、ガイド針を取り外し、近位端から同様の手順を実行します。針を近位端に残し、その先端が皮膚の上に浮かび上がった。ガイド針の先端に安定化ピンを挿入し、ガイド針を引き抜くと近位腔に入るように押し込み、ガイド針を捨てます。遠位端を近位端に合わせ、糸が膝関節を出るときに遠位骨髄腔を通過するようにします。外科用クランプを使用してピンの先端を引っ張り、近位部と遠位部が一緒に引っ張られるようにします。次に、手術ピンの端部を骨折部位に向かって折り畳み、骨折端を再調整する。ワイヤーカッターを使用して、針の付け根からプラスチックを取り外します。ピンの端をひねって、内部組織の損傷を防ぎます。最後に、筋肉を大腿骨に交換し、クリップで皮膚をつまんで創傷口を閉じる。もう一方の脚に大腿骨骨折を起こさずに同様の手順を実行し、創傷を閉じる。手術の成功後、蛍光イメージングにより、大腿骨骨折修復プロセス中に発見されたPrx1陽性骨膜細胞などの様々なメッセントキナル前駆細胞が明らかになった。骨折した大腿骨のアルシアンブルー染色は、軟質カルスの形成を明らかにした。さらに、カルスまたは軟骨形成の割合も決定した。破断後約28日目にMicro-CTを採用することで、カルスギャップ、フラクチャギャップとともに石灰化過程を検出しました。また、骨折端が適切に整列されていないか、ピンで固定されていない場合、骨折端の全部または片側に無神経な形成がないことも観察された。この手順を試みるときは、壊れた大腿骨の両端を慎重に整列させ、ピンで安定させて適切な治癒を確実にすることを忘れないでください。手術後、大腿骨を画像化および分子分析のために収集することができる。

Research

JoVE Journal

Biology

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