Name: transverse fracture of the mouse femur with stabilizing pin
Uploaded: 2021-12-29T13:30:00
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우리는 프로젝트에 대한 재정적 지원과지도에 대해 Vicki Rosen 박사에게 감사드립니다. 우리는 또한 멸균 기술, 동물 복지 및이 프로토콜을 개발하는 데 사용 된 재료에 관한 상담을 위해 하버드 의과 대학의 수의학 및 IACUC 직원에게 감사드립니다.

설명 된 모든 동물 실험은 하버드 의료 지역의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다. 12주령의 C57BL/6J 마우스(수컷 및 암컷)를 이 프로토콜에 사용하였다. C57BL/6J 수컷 및 암컷 마우스는 안정화 핀에 맞을 정도로 넓은 대퇴골로 약 12주령의 피크 골 질량을 달성하며, 이 프로토콜15에 사용하기에 적합한 균주가 됩니다.
1. 수술 준비
<...

<ol>
	<li>Black, D. M., Rosen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postmenopausal+osteoporosis.">Postmenopausal osteoporosis.</a> The New England Journal of Medicine. 374, 2096-2097 (2016).</li><li>Curtis, E. M., Moon, R. J., Harvey, N. C., Cooper, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+fragility+fracture+and+approaches+to+osteoporosis+risk+assessment+worldwide.">The impact of fragility fracture and approaches to osteoporosis risk assessment worldwide.</a> Bone. 104, 29-38 (2017).</li><li>Laurent, M. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+biology+of+fracture+healing.">Cellular biology of fracture healing.</a> Journal of Orthopaedic Research. 37, 35-50 (2019).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fracture+repair+requires+TrkA+signaling+by+skeletal+sensory+nerves.">Fracture repair requires TrkA signaling by skeletal sensory nerves.</a> Journal of Clinical Investigation. 129, 5137-5150 (2019).</li><li>Colnot, C., Thompson, Z., Miclau, T., Werb, Z., Helms, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+fracture+repair+in+the+absence+of+MMP9.">Altered fracture repair in the absence of MMP9.</a> Development. 130, 4123-4133 (2003).</li><li>Bonnarens, F., Einhorn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+a+standard+closed+fracture+in+laboratory+animal+bone.">Production of a standard closed fracture in laboratory animal bone.</a> Journal of Orthopaedic Research. 2, 97-101 (1984).</li><li>Hu, K., Olsen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblast-derived+VEGF+regulates+osteoblast+differentiation+and+bone+formation+during+bone+repair.">Osteoblast-derived VEGF regulates osteoblast differentiation and bone formation during bone repair.</a> Journal of Clinical Investigation. 126, 509-526 (2016).</li><li>Collier, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+reproducible+model+of+fracture+healing+in+mice+using+an+open+femoral+osteotomy.">Characterization of a reproducible model of fracture healing in mice using an open femoral osteotomy.</a> Bone Reports. 12, 100250 (2020).</li><li>Glatt, V., Canalis, E., Stadmeyer, L., Bouxsein, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+changes+in+trabecular+architecture+differ+in+female+and+male+C57BL/6J+mice.">Age-related changes in trabecular architecture differ in female and male C57BL/6J mice.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 22, 1197-1207 (2007).</li><li>Garcia, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+technique+for+internal+fixation+of+femoral+fractures+in+mice:+impact+of+stability+on+fracture+healing.">A new technique for internal fixation of femoral fractures in mice: impact of stability on fracture healing.</a> Journal of Biomechanics. 41, 1689-1696 (2008).</li><li>Holstein, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+establishment+of+defined+mouse+models+for+the+study+of+fracture+healing+and+bone+regeneration.">Advances in the establishment of defined mouse models for the study of fracture healing and bone regeneration.</a> Journal of Orthopaedic Trauma. 23, 31-38 (2009).</li><li>Garcia, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rodent+animal+models+of+delayed+bone+healing+and+non-union+formation:+a+comprehensive+review.">Rodent animal models of delayed bone healing and non-union formation: a comprehensive review.</a> European Cells &amp; Materials. 26 (1-12), 12-14 (2013).</li><li>Histing, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+analysis+of+rotational+stiffness+of+different+osteosynthesis+techniques+in+mouse+femur+fracture.">Ex vivo analysis of rotational stiffness of different osteosynthesis techniques in mouse femur fracture.</a> Journal of Orthopaedic Research. 27, 1152-1156 (2009).</li><li>Williams, J. N., Li, Y., Valiya Kambrath, A., Sankar, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Generation+of+closed+femoral+fractures+in+mice:+A+model+to+study+bone+healing.">The Generation of closed femoral fractures in mice: A model to study bone healing.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e58122 (2018).</li><li>Haffner-Luntzer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mouse+model+to+study+fracture+healing+of+the+proximal+femur.">A novel mouse model to study fracture healing of the proximal femur.</a> Journal of Orthopaedic Research. 38, 2131-2138 (2020).</li></ol>

이 프로토콜에 자세히 설명된 손상 모델은 (1) 혈종의 형성에 따른 전염증 반응, (2) 골막으로부터 부드러운 캘러스를 형성하기 위한 골격 전구물질의 모집, (3) 조골세포에 의한 굳은 살의 미네랄화 및 (4) 파골세포에 의한 뼈의 리모델링을 포함하여 자발적 골절의 치유 동안 관찰된 네 가지 중요한 단계를 모두 포함합니다.
이 원고에 설명 된 수술 절차는 적어도 12 주 된 성인 ?...

골절, 뼈 표면의 연속성의 파손은 인구의 모든 부분에서 발생합니다. 그들은 노화 나 질병으로 인해 깨지기 쉬운 뼈를 가진 사람들에게서 심각 해지고, 취약성 골절의 건강 관리 비용은 5 년 동안 250 억 달러를 초과 할 것으로 예상됩니다 1,2,3,4,5. 골절 복구와 관련된 생물학적 메커니즘을 이해하는 것은 치유 과정을 향상시키기위한 새로운 치료법을 개발하는 출발점이 될 것입니다. 이전의 연구에 따르면 골절시 뼈를 치유 할 수있는 네 가지 중요한 단계가 발생합니다 : (1) 혈종의 형성; (2) 섬유연골 캘러스의 형성; (3) 뼈를 형성하는 부드러운 캘러스의 미네랄화; 및 (4) 치유된 뼈의 리모델링 6,7. 골절을 성공적으로 치유하기 위해 많은 생물학적 과정이 활성화됩니다. 첫째, 급성 전염증 반응은 골절 6,7 직후에 개시된다. 그 후, 골막이 활성화되고 팽창되고, 연골세포가 연골세포로 분화하여 파쇄된 골 세그먼트 6,7,8,9에 의해 남겨진 틈새를 채우기 위해 성장하는 연골 캘러스를 형성한다. 신경 및 혈관 세포는 새로 형성된 캘러스를 침범하여 복구를 촉진하는 데 필요한 추가 세포 및 신호 전달 분자를 제공합니다 6,7,8,9,10. 굳은 살이 형성에 기여하는 것 외에도, periosteal 세포는 또한 브리징 캘러스에 짠 뼈를 내려 놓는 조골 세포로 분화됩니다. 마지막으로, 파골세포는 새로 형성된 뼈를 리모델링하여 원래의 모양과 라멜라 구조 7,8,9,10,11로 되돌아갑니다. 많은 그룹이 골절 복구의 마우스 모델을 개발했습니다. 마우스에서 가장 초기의 가장 자주 사용되는 골절 모델 중 하나는 Einhorn 접근법으로, 특정 높이12에서 다리에 체중이 떨어집니다. 골절을 유도하기 위해 가해지는 각도 및 힘에 대한 제어의 부족은 뼈의 위치 및 크기에 불연속성을 많이 생성한다. 이어서, 관찰된 특정 골절 치유 반응의 변이를 초래한다. 다른 대중적인 접근법은 경골 단피질 결함 또는 스트레스 골절을 생성하기 위한 외과적 개입, 비교적 가벼운 치유 반응을 유도하는 절차(10,13)이다. 이들 모델의 가변성은 주로 절차14를 수행하는 사람 때문이다.
여기서, 상세한 마우스 대퇴골 손상 모델은 재현 가능한 부상을 제공하고 대퇴골 골절 복구의 양적 및 질적 평가를 허용하기 위해 휴식에 대한 제어를 허용한다. 특히, 성인 마우스의 대퇴골에 완전한 돌파구가 도입되고 골절 끝을 안정화시켜 뼈 치유에서 물리적 로딩이 수행하는 역할을 설명합니다. 조직을 수확하고 조직학 및 미세 컴퓨터 단층 촬영 (microCT)을 사용하여 치유 과정의 다양한 단계를 이미징하는 방법 또한 자세히 제공됩니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>23 G x 1 TW IM (0.6 mm x 2 5mm) needle</td>
			<td>BD precision</td>
			<td>305193</td>
			<td>Use as guide needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 G x 1 &#188; (0.4 mm x 30 mm)</td>
			<td>BD precision</td>
			<td>305136</td>
			<td>Use as stabilizing pin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9 mm wound autoclip applier/remover/clips kit</td>
			<td>Braintree Scientific, INC</td>
			<td>ACS-KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian Blue 8 GX</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>10350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>AX1303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circular blade X926.7 THIN-FLEX</td>
			<td>Abrasive technologies</td>
			<td>CELBTFSG633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DREMEL 7700-1/15, 7.2 V Rotary Tool Kit</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>7700 1/15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>7111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine curved dissecting forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxulin Gill 2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>GHS216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>HX0603-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>07-893-1389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgical kit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>95042-540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orange G</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phloxine B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-Iodine Swabs</td>
			<td>PDI</td>
			<td>S23125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCANCO Medical &#181;CT35</td>
			<td>Scanco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slow-release buprenorphine</td>
			<td>Zoopharm</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transverse fracture of the mouse femur with stabilizing pin

골절 복구는 시험관 내에서 안정적으로 모델링 할 수없는 골격의 필수 기능입니다. 마우스 손상 모델은 뮤린 뼈가 인간의 골절 치유 중에 관찰 된 단계를 재구성하기 때문에 유전자, 유전자 제품 또는 약물이 뼈 복구에 영향을 미치는지 여부를 테스트하는 효율적인 접근 방식입니다. 마우스 또는 인간이 뼈를 부러 뜨리면 염증 반응이 시작되고 뼈 자체를 둘러싼 줄기 세포 틈새 인 골막이 활성화되고 확장됩니다. 골막에 상주하는 세포는 분화 후 혈관화된 연질 캘러스를 형성한다. 부드러운 캘러스에서 하드 캘러스로의 전환은 모집 된 골격 전구 세포가 미네랄 화 세포로 분화 될 때 발생하며, 골절 된 끝의 브리징은 뼈 연합을 초래합니다. 미네랄 화 된 굳은 살은 치유 된 뼈의 원래 모양과 구조를 복원하기 위해 리모델링을 거칩니다. 골절 치유는 다양한 부상 모델을 사용하여 마우스에서 연구되었습니다. 그럼에도 불구하고,이 전체 생물학적 과정을 재구성하는 가장 좋은 방법은 두 피질을 모두 포함하는 긴 뼈의 단면을 뚫는 것입니다. 이 프로토콜은 성인 마우스의 치유를 평가하기 위해 안정화 된 횡단 대퇴골 골절을 안전하게 수행 할 수있는 방법을 설명합니다. 골절 치유의 여러 단계를 특성화하기 위한 상세한 수확 및 이미징 기술을 포함하는 수술 프로토콜이 또한 제공된다.

C57BL / 6J 마우스에서 성공적인 수술은 국소 염증 반응 또는 가짜 수술 대퇴골에 대한 periosteal 관여가 거의 없거나 전혀없이 앞에서 언급 한 치유 단계를 완료합니다. 혈종은 수술 후 몇 시간 후에 형성되며, 골막은 연골 형성을위한 골격 전구 인자를 모집하기 위해 활성화됩니다. Prx1+ 중간엽 전구물질과 같은 다양한 세포 집단은 상업적으로 입수가능한 형광 리포터 마우스 모델을 사용하여...

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Transverse Fracture of the Mouse Femur with Stabilizing Pin

이 프로토콜은 성인 마우스에서 골절을 수행하고 치유 과정을 모니터링하는 방법을 설명합니다.

안정화 핀을 가진 마우스 대퇴골의 횡단 골절

Fracture repair is an essential function of the skeleton that cannot be reliably modeled in vitro. A mouse injury model is an efficient approach to test ...

이 프로토콜은 성인 마우스에서 대퇴골 골절을 수행하고 연구하는 신뢰할 수있는 기술을 설명합니다. 이 기술은 쉽고 빠르며 최소한의 도구가 필요합니다. 그것은 골절 치유의 다른 단계의 특성화를 허용합니다.개인은 처음에는 골절 끝을 적절하게 정렬하고 생쥐 사이에 일관된 골절을 만드는 데 어려움을 겪을 수 있습니다. 골절 부위에 세심한주의를 기울이면 핀을 삽입하고 상처를 닫으면이 수술의 성공이 향상됩니다. 시작하려면 킬로그램 당 0.05 밀리그램의 부프레 노르핀을 피하로 주사하여 동물을 준비하십시오.전기 트리머를 사용하여 대퇴골의 위치에 해당하는 양쪽 허벅지에 두 센티미터 정사각형을 면도합니다. 요오드를 사용하여 면도 된 부위를 살균하고 70 % 에탄올 용액으로 헹구십시오. 다섯 밀리미터 절개를하고 근본적인 근막을 노출시킵니다.근막을 절단하여 대퇴골을 덮고있는 근육을 노출시킵니다. 조직을 손상시키지 않고 대퇴골에서 근육을 분리 한 다음 뼈에서 근육을 분리하고 대퇴골을 고정시켜 상처를 만듭니다. 대퇴골 샤프트의 중간에 횡단 절단을하십시오.골수 공동의 원위 부분을 통해 가이드 바늘을 삽입하고 무릎 관절을 가로 질러 실을 밀어 넣으십시오. 그런 다음 가이드 바늘을 제거하고 근위 끝에서 유사한 절차를 수행하십시오. 바늘을 근위 끝에 두고 팁이 피부 위로 튀어 나오게하십시오.가이드 바늘의 팁 내에 안정화 핀을 삽입하고 가이드 바늘이 당겨 나올 때 근위 구멍으로 들어가도록 밀어 넣은 다음 가이드 바늘을 버립니다. 원위 끝을 근위 끝과 정렬하여 실이 무릎 관절을 빠져 나올 때 원위 골수 구멍을 통과하도록하십시오. 수술 클램프를 사용하여 핀의 끝을 당겨 근위 및 원위 섹션이 함께 당겨지도록하십시오.그런 다음 수술 핀의 끝을 골절 부위쪽으로 접어 골절 끝을 다시 정렬하십시오. 와이어 커터를 사용하여 바늘 바닥에서 플라스틱을 제거하십시오. 내부 조직 손상을 피하기 위해 핀의 끝을 비틀어주십시오.마지막으로, 근육을 대퇴골에 교체하고 클립과 함께 피부를 꼬집어 상처 개구부를 닫습니다. 다른 다리의 대퇴골 골절없이 비슷한 절차를 수행하고 상처를 닫으십시오. 성공적인 수술 후, 형광 이미징은 대퇴골 골절 복구 과정에서 발견 된 Prx1 양성 periosteal 세포와 같은 다양한 Messent-Kinal 전구 인자를 밝혀 냈습니다.골절 된 대퇴골의 알시안 블루 염색은 부드러운 굳은 살의 형성을 나타 냈습니다. 또한, 캘러스 또는 연골 형성의 백분율도 결정되었다. 골절 후 약 28 일에 Micro-CT를 사용함으로써 캘러스 갭 및 골절 갭과 함께 미네랄 화 과정이 감지되었습니다.또한 골절 끝이 제대로 정렬되지 않았거나 핀으로 고정되지 않은 경우 골절 끝의 전체 또는 한쪽면에 냉담한 형성이 부족하다는 것이 관찰되었습니다. 이 절차를 시도 할 때 부러진 대퇴골의 두 끝을 조심스럽게 정렬하고 핀으로 안정화시켜 적절한 치유를 보장해야합니다. 수술 후 이미징 및 분자 분석을 위해 대퇴골을 수집 할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator

gentleMACS Dissociator과 마우스 비장에서 단일 셀 Suspensions의 준비

Single-cell suspensions are a prerequisite for experiments in cell separation, cell analysis and cell culture.  To avoid tedious and often painful manual ...

연구

생물학

Transverse Aortic Constriction in Mice

마우스의 가로 대동맥 수축

Transverse aortic constriction (TAC) in the mouse is a commonly used experimental model for pressure overload-induced cardiac hypertrophy and heart ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

생체내 이미징 및 난소암의 Orthotopic 마우스 모델에서 치료 트리 트먼트

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Characterization of the Isolated, Ventilated, and Instrumented Mouse Lung Perfused with Pulsatile Flow

절연, 환기 및기구 마우스 폐의 특성화는 타악기 흐름 Perfused

The isolated, ventilated and instrumented mouse lung preparation allows steady and pulsatile pulmonary vascular pressure-flow relationships to be measured ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

유도 만능의 줄기 세포에서 파생 마우스의 생성

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Fundamental Technical Elements of Freeze-fracture/Freeze-etch in Biological Electron Microscopy

생물 전자 현미경에서 동결 골절 / 동결 에칭의 기본 기술 요소

Freeze-fracture/freeze-etch describes a process whereby specimens, typically biological or nanomaterial in nature, are frozen, fractured, and replicated ...

Phenotyping Mouse Pulmonary Function In Vivo with the Lung Diffusing Capacity

Phenotyping Mouse Pulmonary Function In Vivo with the Lung Diffusing Capacity

표현형 마우스 폐 기능<em&gt; 생체</em&gt; 폐 확산 능력

The mouse is now the primary animal used to model a variety of lung diseases. To study the mechanisms that underlie such pathologies, phenotypic methods ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

트랜스-내부 세포 배아 줄기 세포의 대량 주입 리드 더 높은 Chimerism 요금

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

Application of Passive Head Motion to Generate Defined Accelerations at the Heads of Rodents

설치류의 머리에서 정의된 가속도를 생성하기 위한 수동 머리 움직임의 적용

Exercise is widely recognized as effective for various diseases and physical disorders, including those related to brain dysfunction. However, molecular ...

Isolation of Conditionally Immortalized Mouse Glomerular Endothelial Cells with Fluorescent Mitochondria

형광 미토콘드리아를 이용한 조건부 불멸화 마우스 사구체 내피 세포의 분리

Glomerular endothelial cell (GEC) dysfunction can initiate and contribute to glomerular filtration barrier breakdown. Increased mitochondrial oxidative ...