Name: transverse fracture of the mouse femur with stabilizing pin
Uploaded: 2021-12-29T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transverse Fracture of the Mouse Femur with Stabilizing Pin at JoVE.com

Agradecemos ao Dr. Vicki Rosen pelo apoio financeiro e orientação com o projeto. Também gostaríamos de agradecer aos veterinários e funcionários da IACUC da Escola de Medicina de Harvard por consultas sobre técnica estéril, bem-estar animal e os materiais utilizados para desenvolver este protocolo.

Todos os experimentos em animais descritos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Área Médica de Harvard. Foram utilizados neste protocolo camundongos C57BL/6J de 12 semanas (machos e fêmeas). Camundongos machos e fêmeas C57BL/6J atingem o pico de massa óssea em torno de 12 semanas de idade com fêmures largos o suficiente para caber em um pino estabilizador, tornando-os uma cepa apropriada para usar para este protocolo15.
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<ol>
	<li>Black, D. M., Rosen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postmenopausal+osteoporosis.">Postmenopausal osteoporosis.</a> The New England Journal of Medicine. 374, 2096-2097 (2016).</li><li>Curtis, E. M., Moon, R. J., Harvey, N. C., Cooper, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+fragility+fracture+and+approaches+to+osteoporosis+risk+assessment+worldwide.">The impact of fragility fracture and approaches to osteoporosis risk assessment worldwide.</a> Bone. 104, 29-38 (2017).</li><li>Laurent, M. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblast-derived+VEGF+regulates+osteoblast+differentiation+and+bone+formation+during+bone+repair.">Osteoblast-derived VEGF regulates osteoblast differentiation and bone formation during bone repair.</a> Journal of Clinical Investigation. 126, 509-526 (2016).</li><li>Collier, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+reproducible+model+of+fracture+healing+in+mice+using+an+open+femoral+osteotomy.">Characterization of a reproducible model of fracture healing in mice using an open femoral osteotomy.</a> Bone Reports. 12, 100250 (2020).</li><li>Glatt, V., Canalis, E., Stadmeyer, L., Bouxsein, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+changes+in+trabecular+architecture+differ+in+female+and+male+C57BL/6J+mice.">Age-related changes in trabecular architecture differ in female and male C57BL/6J mice.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 22, 1197-1207 (2007).</li><li>Garcia, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+technique+for+internal+fixation+of+femoral+fractures+in+mice:+impact+of+stability+on+fracture+healing.">A new technique for internal fixation of femoral fractures in mice: impact of stability on fracture healing.</a> Journal of Biomechanics. 41, 1689-1696 (2008).</li><li>Holstein, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+establishment+of+defined+mouse+models+for+the+study+of+fracture+healing+and+bone+regeneration.">Advances in the establishment of defined mouse models for the study of fracture healing and bone regeneration.</a> Journal of Orthopaedic Trauma. 23, 31-38 (2009).</li><li>Garcia, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rodent+animal+models+of+delayed+bone+healing+and+non-union+formation:+a+comprehensive+review.">Rodent animal models of delayed bone healing and non-union formation: a comprehensive review.</a> European Cells &amp; Materials. 26 (1-12), 12-14 (2013).</li><li>Histing, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+analysis+of+rotational+stiffness+of+different+osteosynthesis+techniques+in+mouse+femur+fracture.">Ex vivo analysis of rotational stiffness of different osteosynthesis techniques in mouse femur fracture.</a> Journal of Orthopaedic Research. 27, 1152-1156 (2009).</li><li>Williams, J. N., Li, Y., Valiya Kambrath, A., Sankar, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Generation+of+closed+femoral+fractures+in+mice:+A+model+to+study+bone+healing.">The Generation of closed femoral fractures in mice: A model to study bone healing.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e58122 (2018).</li><li>Haffner-Luntzer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mouse+model+to+study+fracture+healing+of+the+proximal+femur.">A novel mouse model to study fracture healing of the proximal femur.</a> Journal of Orthopaedic Research. 38, 2131-2138 (2020).</li></ol>

O modelo de lesão detalhado neste protocolo abrange todos os quatro passos significativos observados durante a cicatrização de fraturas espontâneas, incluindo (1) resposta pró-inflamatória com a formação do hematoma, (2) recrutamento de progenitores esqueléticos do periósteo para formar o calo macio, (3) mineralização do calo por osteoblastos e (4) remodelação do osso por osteoclasstos.
O procedimento cirúrgico descrito neste manuscrito é otimizado para camundongos adultos com ...

Fraturas, quebras na continuidade da superfície óssea, ocorrem em todos os segmentos da população. Eles se tornam graves em pessoas que têm ossos frágeis devido ao envelhecimento ou doença, e os custos de cuidados de saúde das fraturas por fragilidade devem ultrapassar US$ 25 bilhões em 5 anos 1,2,3,4,5. Compreender os mecanismos biológicos envolvidos na reparação de fraturas seria um ponto de partida no desenvolvimento de novas terapias visando melhorar o processo de cicatrização. Pesquisas anteriores mostraram que, após a fratura, ocorrem quatro etapas significativas que permitem curar o osso: (1) formação do hematoma; (2) formação de calo fibrocartilagino; (3) mineralização do calo macio para formar osso; e (4) remodelação do osso curado6,7. Muitos processos biológicos são ativados para curar a fratura com sucesso. Primeiro, uma resposta aguda pró-inflamatória é iniciada imediatamente após uma fraturade 6,7. Em seguida, o periosteum se torna ativado e se expande, e as células periosteais se diferenciam em condrócitos para formar um calo de cartilagem que cresce para preencher a lacuna deixada pelos segmentos ósseos rompidos 6,7,8,9. Células neurais e vasculares invadem o calo recém-formado para fornecer células adicionais e moléculas de sinalização necessárias para facilitar a reparaçãode 6,7,8, 9,10. Além de contribuir para a formação do calo, as células periosteais também se diferenciam em osteoblastos que estabelecem osso tecido no calo de ponte. Finalmente, os osteoclartos remodelam o osso recém-formado para retornar à sua forma original e estrutura lamelar 7,8,9,10,11. Muitos grupos desenvolveram modelos de camundongos de reparo de fraturas. Um dos modelos de fratura mais antigos e mais usados em camundongos é a abordagem Einhorn, onde um peso é caído na perna a partir de uma altura específica12. A falta de controle sobre o ângulo e a força aplicada para induzir a fratura cria muita variabilidade na localização e tamanho da descontinuidade óssea. Posteriormente, resulta em variações na resposta específica de cicatrização da fratura observada. Outras abordagens populares são a intervenção cirúrgica para produzir um defeito monocortical tibial ou fraturas por estresse, procedimentos que induzem respostas de cura relativamente mais brandas10,13. A variabilidade nesses modelos deve-se principalmente à pessoa que conduz o procedimento14.
Aqui, um modelo detalhado de lesão do fêmur do camundongo permite o controle sobre a ruptura para fornecer uma lesão reprodutível e permitir uma avaliação quantitativa e qualitativa da reparação da fratura do fêmur. Especificamente, um completo avanço nos fêmures de camundongos adultos é introduzido e estabiliza as extremidades da fratura para explicar o papel do carregamento físico na cicatrização óssea. Os métodos de colheita de tecidos e imagem das diferentes etapas do processo de cura utilizando histologia e tomografia microcomputada (microCT) também são fornecidos em detalhes.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>23 G x 1 TW IM (0.6 mm x 2 5mm) needle</td>
			<td>BD precision</td>
			<td>305193</td>
			<td>Use as guide needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 G x 1 &#188; (0.4 mm x 30 mm)</td>
			<td>BD precision</td>
			<td>305136</td>
			<td>Use as stabilizing pin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9 mm wound autoclip applier/remover/clips kit</td>
			<td>Braintree Scientific, INC</td>
			<td>ACS-KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian Blue 8 GX</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>10350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>AX1303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circular blade X926.7 THIN-FLEX</td>
			<td>Abrasive technologies</td>
			<td>CELBTFSG633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DREMEL 7700-1/15, 7.2 V Rotary Tool Kit</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>7700 1/15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>7111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine curved dissecting forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxulin Gill 2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>GHS216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>HX0603-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>07-893-1389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgical kit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>95042-540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orange G</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phloxine B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-Iodine Swabs</td>
			<td>PDI</td>
			<td>S23125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCANCO Medical &#181;CT35</td>
			<td>Scanco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slow-release buprenorphine</td>
			<td>Zoopharm</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transverse fracture of the mouse femur with stabilizing pin

O reparo da fratura é uma função essencial do esqueleto que não pode ser modelado de forma confiável in vitro. Um modelo de lesão do camundongo é uma abordagem eficiente para testar se um gene, produto genético ou droga influencia a reparação óssea porque os ossos da murina recapitulam os estágios observados durante a cicatrização da fratura humana. Quando um rato ou humano quebra um osso, uma resposta inflamatória é iniciada, e o periosteum, um nicho de células-tronco ao redor do próprio osso, é ativado e se expande. As células que residem no periósteo então se diferenciam para formar um calo macio vascularizado. A transição do calo macio para um calo duro ocorre à medida que as células progenitoras esqueléticas recrutadas se diferenciam em células mineralizadoras, e a ponte das extremidades fraturadas resulta na união óssea. O calo mineralizado passa então por remodelação para restaurar a forma original e a estrutura do osso curado. A cicatrização de fraturas tem sido estudada em camundongos usando vários modelos de lesões. Ainda assim, a melhor maneira de recapitular todo esse processo biológico é romper a seção transversal de um osso longo que engloba ambos os cortices. Este protocolo descreve como uma fratura de fêmur transversal estabilizada pode ser realizada com segurança para avaliar a cicatrização em camundongos adultos. Também é fornecido um protocolo cirúrgico, incluindo técnicas detalhadas de colheita e imagem para caracterizar os diferentes estágios de cicatrização da fratura.

Em camundongos C57BL/6J, uma cirurgia bem sucedida completa os passos de cura mencionados anteriormente com pouca ou nenhuma resposta inflamatória local ou envolvimento periosteal no fêmur contralateral operado pela farsa. Um hematoma é formado algumas horas após a cirurgia, e o periosteum é ativado para recrutar progenitores esqueléticos para condrogênese. Várias populações de células, como progenitores mesenquimais Prx1+, podem ser rastreadas durante o processo de reparo usando modelos de mouse fl...

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Transverse Fracture of the Mouse Femur with Stabilizing Pin

Este protocolo descreve um método para realizar fraturas em camundongos adultos e monitorar o processo de cura.

Fratura transversa do fêmur do rato com pino estabilizador

Fracture repair is an essential function of the skeleton that cannot be reliably modeled in vitro. A mouse injury model is an efficient approach to test ...

Este protocolo descreve uma técnica confiável para realizar e estudar a fratura do fêmur em camundongos adultos. Esta técnica é fácil, rápida e requer ferramentas mínimas para ser realizada. Permite a caracterização de diferentes estágios de cicatrização de fraturas.Os indivíduos podem inicialmente lutar para alinhar adequadamente as extremidades da fratura e criar fraturas consistentes entre camundongos. Prestando muita atenção ao local da fratura, à inserção do pino e ao fechamento da ferida vai melhorar o sucesso desta cirurgia. Para começar, prepare o animal injetando 0,05 miligramas por quilograma de buprenorfina subcutânea.Usando um aparador elétrico, raspe um quadrado de dois por dois centímetros em ambas as coxas correspondentes à localização do fêmur. Esterilize uma área raspada usando iodo e enxágue com solução de 70% de etanol. Faça uma incisão de cinco milímetros e exponha a fáscia subjacente.Exponha o músculo que cobre o fêmur cortando a fáscia. Separe o músculo do fêmur sem danificar o tecido, em seguida, desprende o músculo do osso e fixe o fêmur para fazer um corte. Faça um corte transversal no meio do eixo do fêmur.Insira uma agulha guia através da seção distal da cavidade da medula e empurre a rosca através da articulação do joelho. Em seguida, remova a agulha guia e realize um procedimento semelhante da extremidade proximal. Deixe a agulha na extremidade proximal com sua ponta emergindo acima da pele.Insira um pino estabilizador dentro da ponta da agulha guia, empurrando-o para que entre na cavidade proximal à medida que a agulha guia é puxada para fora, em seguida, descarte a agulha guia. Alinhe a extremidade distal com a extremidade proximal para que a rosca passe pela cavidade da medula distal à medida que sai da articulação do joelho. Puxe a ponta do pino usando um grampo cirúrgico para que as seções proximais e distal sejam puxadas juntas.Em seguida, dobre as extremidades do pino cirúrgico em direção ao local da fratura para realinhar as extremidades da fratura. O uso de cortadores de arame remove o plástico da base da agulha. Torça as extremidades do pino para evitar qualquer lesão interna do tecido.Por fim, substitua os músculos do fêmur e feche a abertura da ferida, beliscando a pele com clipes. Realizar um procedimento semelhante sem a fratura do fêmur na outra perna e fechar a ferida. Após a cirurgia bem sucedida, imagens fluorescentes revelaram vários progenitores Messent-Kinal, como células periosteais prx1 positivas, que foram encontradas durante o processo de reparação da fratura do fêmur.A coloração azul alciana do fêmur fraturado revelou a formação de calo macio. Além disso, também foi determinado o percentual da formação do calo ou da cartilagem. Ao utilizar microclima com aproximadamente 28 dias após a fratura, o processo de mineralização foi detectado juntamente com a lacuna calo e a fratura.Observou-se também que se as extremidades da fratura não estavam alinhadas adequadamente ou presas com um pino, havia falta de formação insensível em todos ou em um lado da extremidade da fratura. Ao tentar este procedimento lembre-se de alinhar cuidadosamente as duas extremidades do fêmur quebrado e estabilizá-las com o pino para garantir a cura adequada. Após a cirurgia, a femora pode ser coletada para análise de imagem e molecular.

Research

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Biology

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