Name: transverse fracture of the mouse femur with stabilizing pin
Uploaded: 2021-12-29T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transverse Fracture of the Mouse Femur with Stabilizing Pin at JoVE.com

Мы благодарим д-ра Вики Розен за финансовую поддержку и руководство проектом. Мы также хотели бы поблагодарить ветеринаров и сотрудников IACUC в Гарвардской школе медицины за консультации относительно стерильной техники, благополучия животных и материалов, используемых для разработки этого протокола.

Все описанные эксперименты на животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Гарвардской медицинской области. В этом протоколе использовались 12-недельные мыши C57BL/6J (самцы и самки). C57BL/6J самцы и самки мышей достигают пиковой костной массы в ...

<ol>
	<li>Black, D. M., Rosen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postmenopausal+osteoporosis.">Postmenopausal osteoporosis.</a> The New England Journal of Medicine. 374, 2096-2097 (2016).</li><li>Curtis, E. M., Moon, R. J., Harvey, N. C., Cooper, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+fragility+fracture+and+approaches+to+osteoporosis+risk+assessment+worldwide.">The impact of fragility fracture and approaches to osteoporosis risk assessment worldwide.</a> Bone. 104, 29-38 (2017).</li><li>Laurent, M. R., Dedeyne, L., Dupont, J., Mellaerts, B., Dejaeger, M., Gielen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+bone+loss+and+sarcopenia+in+men.">Age-related bone loss and sarcopenia in men.</a> Maturitas. 122, 51-56 (2019).</li><li>NOF - Just for men. National Osteoporosis Foundation Available from: <a target="_blank" href="https://cdn.nof.org/wp-content/uploads/2015/12/Osteoporosis-Fast-Facts.pdf">https://cdn.nof.org/wp-content/uploads/2015/12/Osteoporosis-Fast-Facts.pdf</a> (2019)</li><li>Williams, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Economic+burden+of+osteoporotic+fractures+in+US+managed+care+enrollees.">Economic burden of osteoporotic fractures in US managed care enrollees.</a> The American Journal of Managed Care. 26, 142-149 (2020).</li><li>Sheen, J. R., Garla, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fracture+healing+overview.">Fracture healing overview.</a> StatPearls. , (2021).</li><li>Holmes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Closing+the+gap.">Closing the gap.</a> Nature. 550, 194-195 (2017).</li><li>Duchamp de Lageneste, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periosteum+contains+skeletal+stem+cells+with+high+bone+regenerative+potential+controlled+by+Periostin.">Periosteum contains skeletal stem cells with high bone regenerative potential controlled by Periostin.</a> Nature Communications. 9, 773 (2018).</li><li>Bahney, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+biology+of+fracture+healing.">Cellular biology of fracture healing.</a> Journal of Orthopaedic Research. 37, 35-50 (2019).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fracture+repair+requires+TrkA+signaling+by+skeletal+sensory+nerves.">Fracture repair requires TrkA signaling by skeletal sensory nerves.</a> Journal of Clinical Investigation. 129, 5137-5150 (2019).</li><li>Colnot, C., Thompson, Z., Miclau, T., Werb, Z., Helms, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+fracture+repair+in+the+absence+of+MMP9.">Altered fracture repair in the absence of MMP9.</a> Development. 130, 4123-4133 (2003).</li><li>Bonnarens, F., Einhorn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+a+standard+closed+fracture+in+laboratory+animal+bone.">Production of a standard closed fracture in laboratory animal bone.</a> Journal of Orthopaedic Research. 2, 97-101 (1984).</li><li>Hu, K., Olsen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblast-derived+VEGF+regulates+osteoblast+differentiation+and+bone+formation+during+bone+repair.">Osteoblast-derived VEGF regulates osteoblast differentiation and bone formation during bone repair.</a> Journal of Clinical Investigation. 126, 509-526 (2016).</li><li>Collier, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+reproducible+model+of+fracture+healing+in+mice+using+an+open+femoral+osteotomy.">Characterization of a reproducible model of fracture healing in mice using an open femoral osteotomy.</a> Bone Reports. 12, 100250 (2020).</li><li>Glatt, V., Canalis, E., Stadmeyer, L., Bouxsein, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+changes+in+trabecular+architecture+differ+in+female+and+male+C57BL/6J+mice.">Age-related changes in trabecular architecture differ in female and male C57BL/6J mice.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 22, 1197-1207 (2007).</li><li>Garcia, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+technique+for+internal+fixation+of+femoral+fractures+in+mice:+impact+of+stability+on+fracture+healing.">A new technique for internal fixation of femoral fractures in mice: impact of stability on fracture healing.</a> Journal of Biomechanics. 41, 1689-1696 (2008).</li><li>Holstein, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+establishment+of+defined+mouse+models+for+the+study+of+fracture+healing+and+bone+regeneration.">Advances in the establishment of defined mouse models for the study of fracture healing and bone regeneration.</a> Journal of Orthopaedic Trauma. 23, 31-38 (2009).</li><li>Garcia, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rodent+animal+models+of+delayed+bone+healing+and+non-union+formation:+a+comprehensive+review.">Rodent animal models of delayed bone healing and non-union formation: a comprehensive review.</a> European Cells &amp; Materials. 26 (1-12), 12-14 (2013).</li><li>Histing, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+analysis+of+rotational+stiffness+of+different+osteosynthesis+techniques+in+mouse+femur+fracture.">Ex vivo analysis of rotational stiffness of different osteosynthesis techniques in mouse femur fracture.</a> Journal of Orthopaedic Research. 27, 1152-1156 (2009).</li><li>Williams, J. N., Li, Y., Valiya Kambrath, A., Sankar, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Generation+of+closed+femoral+fractures+in+mice:+A+model+to+study+bone+healing.">The Generation of closed femoral fractures in mice: A model to study bone healing.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e58122 (2018).</li><li>Haffner-Luntzer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mouse+model+to+study+fracture+healing+of+the+proximal+femur.">A novel mouse model to study fracture healing of the proximal femur.</a> Journal of Orthopaedic Research. 38, 2131-2138 (2020).</li></ol>

Модель травмы, подробно описанная в этом протоколе, охватывает все четыре значительных этапа, наблюдаемых во время заживления спонтанных переломов, включая (1) провоспалительную реакцию с образованием гематомы, (2) набор скелетных предшественников из надкостницы для формирования мягко...

Переломы, разрывы в непрерывности костной поверхности, происходят во всех слоях населения. Они становятся тяжелыми у людей с хрупкими костями из-за старения или болезней, а расходы на здравоохранение при переломах хрупкости, как ожидается, превысят 25 миллиардов долларов через 5 лет 1,2,3,4,5. Понимание биологических механизмов, участвующих в восстановлении переломов, станет отправной точкой в разработке новых методов лечения, направленных на улучшение процесса заживления. Предыдущие исследования показали, что при переломе происходят четыре значительных шага, которые позволяют кости заживать: (1) образование гематомы; (2) образование фиброхрящевой мозоли; (3) минерализация мягкой мозоли с образованием кости; и 4) ремоделирование зажившей кости 6,7. Многие биологические процессы активизируются для успешного заживления перелома. Во-первых, острая провоспалительная реакция инициируется сразу после перелома 6,7. Затем надкостница активируется и расширяется, а периостальные клетки дифференцируются в хондроциты, образуя мозоль хряща, которая растет, чтобы заполнить пробел, оставленный нарушенными сегментамикости 6,7,8,9. Нервные и сосудистые клетки вторгаются во вновь образованную мозоль, чтобы обеспечить дополнительные клетки и сигнальные молекулы, необходимые для облегчения восстановления 6,7,8,9,10. В дополнение к содействию образованию мозоли, периостальные клетки также дифференцируются в остеобласты, которые откладывают тканую кость в мостовой мозоли. Наконец, остеокласты ремоделируют вновь образованную кость, чтобы вернуть свою первоначальную форму и пластинчатую структуру 7,8,9,10,11. Многие группы разработали мышиные модели восстановления переломов. Одной из более ранних и наиболее часто используемых моделей переломов у мышей является подход Эйнхорна, при котором вес падает на ногу с определенной высоты12. Отсутствие контроля над углом и силой, приложенной для индуцирования перелома, создает большую изменчивость в расположении и размере разрыва кости. Впоследствии это приводит к изменениям в специфической реакции заживления переломов. Другими популярными подходами являются хирургическое вмешательство для получения монокортикального дефекта большеберцовой кости или стрессовых переломов, процедуры, которые вызывают сравнительно более мягкие реакции заживления10,13. Изменчивость в этих моделях обусловлена в первую очередь человеком, проводящим процедуру14.
Здесь подробная модель травмы бедренной кости мыши позволяет контролировать разрыв, чтобы обеспечить воспроизводимую травму и позволить количественную и качественную оценку восстановления перелома бедренной кости. В частности, вводится полный прорыв в бедренных костях взрослых мышей и стабилизирует концы переломов, чтобы учесть роль физической нагрузки в заживлении костей. Также подробно представлены методы сбора тканей и визуализации различных этапов процесса заживления с использованием гистологии и микрокомпьютерной томографии (микроКТ).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>23 G x 1 TW IM (0.6 mm x 2 5mm) needle</td>
			<td>BD precision</td>
			<td>305193</td>
			<td>Use as guide needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 G x 1 &#188; (0.4 mm x 30 mm)</td>
			<td>BD precision</td>
			<td>305136</td>
			<td>Use as stabilizing pin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9 mm wound autoclip applier/remover/clips kit</td>
			<td>Braintree Scientific, INC</td>
			<td>ACS-KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian Blue 8 GX</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>10350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>AX1303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circular blade X926.7 THIN-FLEX</td>
			<td>Abrasive technologies</td>
			<td>CELBTFSG633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DREMEL 7700-1/15, 7.2 V Rotary Tool Kit</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>7700 1/15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>7111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine curved dissecting forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxulin Gill 2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>GHS216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>HX0603-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>07-893-1389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgical kit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>95042-540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orange G</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phloxine B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-Iodine Swabs</td>
			<td>PDI</td>
			<td>S23125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCANCO Medical &#181;CT35</td>
			<td>Scanco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slow-release buprenorphine</td>
			<td>Zoopharm</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transverse fracture of the mouse femur with stabilizing pin

Восстановление переломов является важной функцией скелета, которая не может быть надежно смоделирована in vitro. Модель травмы мыши является эффективным подходом к проверке того, влияет ли ген, генный продукт или лекарство на восстановление костей, потому что мышиные кости повторяют этапы, наблюдаемые во время заживления переломов человека. Когда мышь или человек ломает кость, инициируется воспалительная реакция, и надкостница, ниша стволовых клеток, окружающая саму кость, активируется и расширяется. Клетки, находящиеся в надкостнице, затем дифференцируются, образуя васкуляризированную мягкую мозоль. Переход от мягкой мозоли к твердой мозоли происходит, когда рекрутированные скелетные клетки-предшественники дифференцируются в минерализующие клетки, а мост сломанных концов приводит к объединению костей. Минерализованная мозоль затем подвергается ремоделированию, чтобы восстановить первоначальную форму и структуру зажившей кости. Заживление переломов было изучено на мышах с использованием различных моделей травм. Тем не менее, лучший способ повторить весь этот биологический процесс - прорваться через поперечное сечение длинной кости, которая охватывает обе коры. Этот протокол описывает, как стабилизированный поперечный перелом бедренной кости может быть безопасно выполнен для оценки заживления у взрослых мышей. Также предоставляется хирургический протокол, включающий подробные методы сбора и визуализации для характеристики различных этапов заживления переломов.

У мышей C57BL/6J успешная операция завершает этапы заживления, упомянутые ранее, практически без местной воспалительной реакции или периостального поражения в фиктивной контралатеральной бедренной кости. Гематома образуется через несколько часов после операции, а надкостница активируе...

Watch this Scientific Journal Video about Transverse Fracture of the Mouse Femur with Stabilizing Pin at JoVE.com

Transverse Fracture of the Mouse Femur with Stabilizing Pin

Этот протокол описывает метод выполнения переломов на взрослых мышах и мониторинга процесса заживления.

Поперечный перелом бедренной кости мыши стабилизирующим штифтом

Fracture repair is an essential function of the skeleton that cannot be reliably modeled in vitro. A mouse injury model is an efficient approach to test ...

Этот протокол описывает надежную технику для выполнения и изучения перелома бедренной кости на взрослых мышах. Эта техника проста, быстра и требует минимального количества инструментов. Это позволяет охарактеризовать различные этапы заживления переломов.Люди могут первоначально бороться с правильным выравниванием концов переломов и созданием последовательных переломов между мышами. Уделяя пристальное внимание месту перелома, вставлению штифта и закрытию раны, вы улучшите успех этой операции. Для начала подготовьте животное, введя 0,05 миллиграмма на килограмм бупренорфина подкожно.С помощью электрического триммера сбриваем квадрат размером два на два сантиметра на обоих бедрах, соответствующий расположению бедренной кости. Стерилизовать бритую область с помощью йода и промыть 70% раствором этанола. Сделайте пятимиллиметровый разрез и обнажите подлежащую фасцию.Обнажите мышцу, покрывающую бедренную кость, разрезав фасцию. Отделите мышцу от бедренной кости, не повреждая ткань, затем отделите мышцу от кости и закрепите бедренную кость, чтобы сделать разрез. Сделайте поперечный разрез в середине бедренного стержня.Вставьте направляющую иглу через дистальный отдел полости костного мозга и протолкните нить через коленный сустав. Затем снимите направляющую иглу и выполните аналогичную процедуру с проксимального конца. Оставьте иглу в проксимальном конце с ее кончиком, появившимся над кожей.Вставьте стабилизирующий штифт в кончик направляющей иглы, толкая его так, чтобы он входил в проксимальную полость, когда направляющая игла вытягивается, затем отбросьте направляющую иглу. Выровняйте дистальный конец с проксимальным концом так, чтобы нить проходила через дистальную полость костного мозга при выходе из коленного сустава. Потяните кончик штифта с помощью хирургического зажима так, чтобы проксимальный и дистальный отделы были стянуты вместе.Затем сложите концы хирургического штифта к месту перелома, чтобы выровнять концы перелома. С помощью проволочных резаков удалите пластик с основания иглы. Скрутите концы штифта, чтобы избежать повреждения внутренних тканей.Наконец, замените мышцы на бедренной кости и закройте раневое отверстие, зажав кожу вместе с зажимами. Выполните аналогичную процедуру без перелома бедренной кости на другой ноге и закройте рану. После успешной операции флуоресцентная визуализация выявила различных мессент-кинальных предшественников, таких как Prx1-положительные периостальные клетки, которые были обнаружены в процессе восстановления перелома бедренной кости.Альциановое синее окрашивание перелома бедренной кости выявило образование мягкой мозоли. Кроме того, был также определен процент образования мозоли или хряща. При использовании микро-КТ примерно через 28 дней после перелома процесс минерализации был обнаружен вместе с разрывом мозоли и разрывом трещины.Было также отмечено, что если концы перелома не были выровнены должным образом или закреплены штифтом, то на всей или одной стороне конца перелома отсутствовало черствое образование. При попытке этой процедуры не забудьте тщательно выровнять два конца сломанной бедренной кости и стабилизировать их с помощью штифта, чтобы обеспечить правильное заживление. После операции бедренная кость может быть собрана для визуализации и молекулярного анализа.

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator

Подготовка одноклеточных суспензий из селезенки мыши с gentleMACS диссоциатор

Single-cell suspensions are a prerequisite for experiments in cell separation, cell analysis and cell culture.  To avoid tedious and often painful manual ...

Transverse Aortic Constriction in Mice

Поперечные Сужение аорты у мышей

Transverse aortic constriction (TAC) in the mouse is a commonly used experimental model for pressure overload-induced cardiac hypertrophy and heart ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

В естественных изображений и лечебных процедур в Ортотопическая мышиной модели рака яичников

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Characterization of the Isolated, Ventilated, and Instrumented Mouse Lung Perfused with Pulsatile Flow

Характеристика Изолированные, вентилируемый и легких мыши Instrumented озарен пульсирующего потока

The isolated, ventilated and instrumented mouse lung preparation allows steady and pulsatile pulmonary vascular pressure-flow relationships to be measured ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

Генерация Мыши, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Fundamental Technical Elements of Freeze-fracture/Freeze-etch in Biological Electron Microscopy

Фундаментальный Технический Элементы замерзания перелома / Зафиксированные-травления в биологическом электронной микроскопии

Freeze-fracture/freeze-etch describes a process whereby specimens, typically biological or nanomaterial in nature, are frozen, fractured, and replicated ...

Phenotyping Mouse Pulmonary Function In Vivo with the Lung Diffusing Capacity

Phenotyping Mouse Pulmonary Function In Vivo with the Lung Diffusing Capacity

Фенотипирование мыши легочная функция<em&gt; В Vivo</em&gt; С жизненной емкости легких диффундирующих

The mouse is now the primary animal used to model a variety of lung diseases. To study the mechanisms that underlie such pathologies, phenotypic methods ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

Транс внутренняя ячейка массы впрыска эмбриональных стволовых клеток приводит к более высоким ставкам химеризма

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

Application of Passive Head Motion to Generate Defined Accelerations at the Heads of Rodents

Применение пассивного движения головы для генерации определенных ускорений на головах грызунов

Exercise is widely recognized as effective for various diseases and physical disorders, including those related to brain dysfunction. However, molecular ...

Isolation of Conditionally Immortalized Mouse Glomerular Endothelial Cells with Fluorescent Mitochondria

Выделение условно увековеченных мышиных клубочковых эндотелиальных клеток с флуоресцентными митохондриями

Glomerular endothelial cell (GEC) dysfunction can initiate and contribute to glomerular filtration barrier breakdown. Increased mitochondrial oxidative ...