Name: transverse fracture of the mouse femur with stabilizing pin
Uploaded: 2021-12-29T13:30:00
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Agradecemos a la Dra. Vicki Rosen por el apoyo financiero y la orientación con el proyecto. También nos gustaría agradecer al personal veterinario y de IACUC en la Escuela de Medicina de Harvard por la consulta sobre la técnica estéril, el bienestar animal y los materiales utilizados para desarrollar este protocolo.

Todos los experimentos con animales descritos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Área Médica de Harvard. En este protocolo se utilizaron ratones C57BL/6J de 12 semanas de edad (machos y hembras). Los ratones machos y hembras C57BL/6J alcanzan la masa ósea máxima alrededor de las 12 semanas de edad con fémures lo suficientemente anchos como para caber en un pasador estabilizador, lo que los convierte en una cepa apropiada para usar en este protocolo15</sup...

<ol>
	<li>Black, D. M., Rosen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postmenopausal+osteoporosis.">Postmenopausal osteoporosis.</a> The New England Journal of Medicine. 374, 2096-2097 (2016).</li><li>Curtis, E. M., Moon, R. J., Harvey, N. C., Cooper, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+fragility+fracture+and+approaches+to+osteoporosis+risk+assessment+worldwide.">The impact of fragility fracture and approaches to osteoporosis risk assessment worldwide.</a> Bone. 104, 29-38 (2017).</li><li>Laurent, M. R., Dedeyne, L., Dupont, J., Mellaerts, B., Dejaeger, M., Gielen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+bone+loss+and+sarcopenia+in+men.">Age-related bone loss and sarcopenia in men.</a> Maturitas. 122, 51-56 (2019).</li><li>NOF - Just for men. National Osteoporosis Foundation Available from: <a target="_blank" href="https://cdn.nof.org/wp-content/uploads/2015/12/Osteoporosis-Fast-Facts.pdf">https://cdn.nof.org/wp-content/uploads/2015/12/Osteoporosis-Fast-Facts.pdf</a> (2019)</li><li>Williams, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Economic+burden+of+osteoporotic+fractures+in+US+managed+care+enrollees.">Economic burden of osteoporotic fractures in US managed care enrollees.</a> The American Journal of Managed Care. 26, 142-149 (2020).</li><li>Sheen, J. R., Garla, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fracture+healing+overview.">Fracture healing overview.</a> StatPearls. , (2021).</li><li>Holmes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Closing+the+gap.">Closing the gap.</a> Nature. 550, 194-195 (2017).</li><li>Duchamp de Lageneste, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periosteum+contains+skeletal+stem+cells+with+high+bone+regenerative+potential+controlled+by+Periostin.">Periosteum contains skeletal stem cells with high bone regenerative potential controlled by Periostin.</a> Nature Communications. 9, 773 (2018).</li><li>Bahney, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+biology+of+fracture+healing.">Cellular biology of fracture healing.</a> Journal of Orthopaedic Research. 37, 35-50 (2019).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fracture+repair+requires+TrkA+signaling+by+skeletal+sensory+nerves.">Fracture repair requires TrkA signaling by skeletal sensory nerves.</a> Journal of Clinical Investigation. 129, 5137-5150 (2019).</li><li>Colnot, C., Thompson, Z., Miclau, T., Werb, Z., Helms, J. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblast-derived+VEGF+regulates+osteoblast+differentiation+and+bone+formation+during+bone+repair.">Osteoblast-derived VEGF regulates osteoblast differentiation and bone formation during bone repair.</a> Journal of Clinical Investigation. 126, 509-526 (2016).</li><li>Collier, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+reproducible+model+of+fracture+healing+in+mice+using+an+open+femoral+osteotomy.">Characterization of a reproducible model of fracture healing in mice using an open femoral osteotomy.</a> Bone Reports. 12, 100250 (2020).</li><li>Glatt, V., Canalis, E., Stadmeyer, L., Bouxsein, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+changes+in+trabecular+architecture+differ+in+female+and+male+C57BL/6J+mice.">Age-related changes in trabecular architecture differ in female and male C57BL/6J mice.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 22, 1197-1207 (2007).</li><li>Garcia, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+technique+for+internal+fixation+of+femoral+fractures+in+mice:+impact+of+stability+on+fracture+healing.">A new technique for internal fixation of femoral fractures in mice: impact of stability on fracture healing.</a> Journal of Biomechanics. 41, 1689-1696 (2008).</li><li>Holstein, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+establishment+of+defined+mouse+models+for+the+study+of+fracture+healing+and+bone+regeneration.">Advances in the establishment of defined mouse models for the study of fracture healing and bone regeneration.</a> Journal of Orthopaedic Trauma. 23, 31-38 (2009).</li><li>Garcia, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rodent+animal+models+of+delayed+bone+healing+and+non-union+formation:+a+comprehensive+review.">Rodent animal models of delayed bone healing and non-union formation: a comprehensive review.</a> European Cells &amp; Materials. 26 (1-12), 12-14 (2013).</li><li>Histing, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+analysis+of+rotational+stiffness+of+different+osteosynthesis+techniques+in+mouse+femur+fracture.">Ex vivo analysis of rotational stiffness of different osteosynthesis techniques in mouse femur fracture.</a> Journal of Orthopaedic Research. 27, 1152-1156 (2009).</li><li>Williams, J. N., Li, Y., Valiya Kambrath, A., Sankar, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Generation+of+closed+femoral+fractures+in+mice:+A+model+to+study+bone+healing.">The Generation of closed femoral fractures in mice: A model to study bone healing.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e58122 (2018).</li><li>Haffner-Luntzer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mouse+model+to+study+fracture+healing+of+the+proximal+femur.">A novel mouse model to study fracture healing of the proximal femur.</a> Journal of Orthopaedic Research. 38, 2131-2138 (2020).</li></ol>

El modelo de lesión detallado en este protocolo abarca los cuatro pasos significativos observados durante la curación de fracturas espontáneas, incluyendo (1) respuesta proinflamatoria con la formación del hematoma, (2) reclutamiento de progenitores esqueléticos del periostio para formar el callo blando, (3) mineralización del callo por osteoblastos y (4) remodelación del hueso por osteoclastos.
El procedimiento quirúrgico descrito en este manuscrito está optimizado para ratones adult...

Las fracturas, roturas en la continuidad de la superficie ósea, ocurren en todos los segmentos de la población. Se vuelven graves en personas que tienen huesos frágiles debido al envejecimiento o la enfermedad, y se espera que los costos de atención médica de las fracturas por fragilidad superen los $ 25 mil millones en 5 años 1,2,3,4,5. Comprender los mecanismos biológicos involucrados en la reparación de fracturas sería un punto de partida en el desarrollo de nuevas terapias destinadas a mejorar el proceso de curación. Investigaciones anteriores han demostrado que, tras la fractura, se producen cuatro pasos significativos que permiten que el hueso sane: (1) formación del hematoma; (2) formación de un callo fibrocartilaginoso; (3) mineralización del callo blando para formar hueso; y (4) remodelación del hueso curado 6,7. Muchos procesos biológicos se activan para curar la fractura con éxito. En primer lugar, se inicia una respuesta proinflamatoria aguda inmediatamente después de una fractura 6,7. Luego, el periostio se activa y se expande, y las células periósticas se diferencian en condrocitos para formar un callo de cartílago que crece para llenar el espacio dejado por los segmentos óseos interrumpidos 6,7,8,9. Las células neurales y vasculares invaden el callo recién formado para proporcionar células adicionales y moléculas de señalización necesarias para facilitar la reparación 6,7,8,9,10. Además de contribuir a la formación de callos, las células periósticas también se diferencian en osteoblastos que depositan hueso tejido en el callo puente. Finalmente, los osteoclastos remodelan el hueso recién formado para volver a su forma original y estructura lamelar 7,8,9,10,11. Muchos grupos desarrollaron modelos de ratón de reparación de fracturas. Uno de los modelos de fractura más tempranos y más utilizados en ratones es el enfoque Einhorn, donde se deja caer un peso sobre la pierna desde una altura específica12. La falta de control sobre el ángulo y la fuerza aplicada para inducir la fractura crea mucha variabilidad en la ubicación y el tamaño de la discontinuidad ósea. Posteriormente, da lugar a variaciones en la respuesta específica de curación de fracturas observada. Otros enfoques populares son la intervención quirúrgica para producir un defecto monocortical tibial o fracturas por estrés, procedimientos que inducen respuestas de curación comparativamente más leves10,13. La variabilidad en estos modelos se debe principalmente a la persona que realiza el procedimiento14.
Aquí, un modelo detallado de lesión de fémur de ratón permite el control sobre la rotura para proporcionar una lesión reproducible y permitir una evaluación cuantitativa y cualitativa de la reparación de la fractura de fémur. Específicamente, se introduce un avance completo en los fémures de ratones adultos y estabiliza los extremos de la fractura para dar cuenta del papel que desempeña la carga física en la curación ósea. También se proporcionan en detalle los métodos para recolectar tejidos e imágenes de los diferentes pasos del proceso de curación utilizando histología y tomografía microinformática (microCT).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>23 G x 1 TW IM (0.6 mm x 2 5mm) needle</td>
			<td>BD precision</td>
			<td>305193</td>
			<td>Use as guide needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 G x 1 &#188; (0.4 mm x 30 mm)</td>
			<td>BD precision</td>
			<td>305136</td>
			<td>Use as stabilizing pin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9 mm wound autoclip applier/remover/clips kit</td>
			<td>Braintree Scientific, INC</td>
			<td>ACS-KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian Blue 8 GX</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>10350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>AX1303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circular blade X926.7 THIN-FLEX</td>
			<td>Abrasive technologies</td>
			<td>CELBTFSG633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DREMEL 7700-1/15, 7.2 V Rotary Tool Kit</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>7700 1/15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>7111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine curved dissecting forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxulin Gill 2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>GHS216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>HX0603-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>07-893-1389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgical kit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>95042-540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orange G</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phloxine B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-Iodine Swabs</td>
			<td>PDI</td>
			<td>S23125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCANCO Medical &#181;CT35</td>
			<td>Scanco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slow-release buprenorphine</td>
			<td>Zoopharm</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transverse fracture of the mouse femur with stabilizing pin

La reparación de fracturas es una función esencial del esqueleto que no se puede modelar de manera confiable in vitro. Un modelo de lesión de ratón es un enfoque eficiente para probar si un gen, producto genético o medicamento influye en la reparación ósea porque los huesos murinos recapitulan las etapas observadas durante la curación de fracturas humanas. Cuando un ratón o un humano rompe un hueso, se inicia una respuesta inflamatoria y el periostio, un nicho de células madre que rodea el hueso en sí, se activa y se expande. Las células que residen en el periostio se diferencian para formar un callo blando vascularizado. La transición del callo blando a un callo duro ocurre a medida que las células progenitoras esqueléticas reclutadas se diferencian en células mineralizantes, y el puente de los extremos fracturados resulta en la unión ósea. El callo mineralizado luego se somete a una remodelación para restaurar la forma y estructura originales del hueso curado. La curación de fracturas se ha estudiado en ratones utilizando varios modelos de lesiones. Aún así, la mejor manera de recapitular todo este proceso biológico es romper la sección transversal de un hueso largo que abarca ambas cortezas. Este protocolo describe cómo se puede realizar de forma segura una fractura de fémur transversal estabilizada para evaluar la curación en ratones adultos. También se proporciona un protocolo quirúrgico que incluye técnicas detalladas de recolección e imágenes para caracterizar las diferentes etapas de la curación de fracturas.

En ratones C57BL / 6J, una cirugía exitosa completa los pasos de curación mencionados anteriormente con poca o ninguna respuesta inflamatoria local o afectación perióstica en el fémur contralateral operado simuladamente. Un hematoma se forma unas horas después de la cirugía, y el periostio se activa para reclutar progenitores esqueléticos para la condrogénesis. Varias poblaciones celulares, como los progenitores mesenquimales Prx1+ , se pueden rastrear durante el proceso de reparación utilizando mode...

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Transverse Fracture of the Mouse Femur with Stabilizing Pin

Este protocolo describe un método para realizar fracturas en ratones adultos y monitorear el proceso de curación.

Fractura transversal del fémur del ratón con pasador estabilizador

Fracture repair is an essential function of the skeleton that cannot be reliably modeled in vitro. A mouse injury model is an efficient approach to test ...

Este protocolo describe una técnica confiable para realizar y estudiar la fractura de fémur en ratones adultos. Esta técnica es fácil, rápida y requiere herramientas mínimas para ser realizada. Permite la caracterización de diferentes etapas de curación de fracturas.Los individuos pueden inicialmente tener dificultades para alinear adecuadamente los extremos de la fractura y crear fracturas consistentes entre ratones. Prestar mucha atención al sitio de la fractura, la inserción del pasador y el cierre de la herida mejorarán el éxito de esta cirugía. Para comenzar, prepare al animal inyectando 0.05 miligramos por kilogramo de buprenorfina por vía subcutánea.Usando un recortador eléctrico afeitado un cuadrado de dos por dos centímetros en ambos muslos correspondiente a la ubicación del fémur. Esterilizar un área afeitada con yodo y enjuagar con una solución de etanol al 70%. Haga una incisión de cinco milímetros y exponga la fascia subyacente.Exponga el músculo que cubre el fémur cortando la fascia. Separe el músculo del fémur sin dañar el tejido, luego separe el músculo del hueso y asegure el fémur para hacer un corte. Haga un corte transversal en el medio del eje del fémur.Inserte una aguja guía a través de la sección distal de la cavidad de la médula y empuje el hilo a través de la articulación de la rodilla. Luego, retire la aguja guía y realice un procedimiento similar desde el extremo proximal. Deje la aguja en el extremo proximal con su punta emergida por encima de la piel.Inserte un pasador estabilizador dentro de la punta de la aguja guía, empujándola para que entre en la cavidad proximal a medida que se extrae la aguja guía, luego deseche la aguja guía. Alinee el extremo distal con el extremo proximal para que el hilo pase a través de la cavidad de la médula distal a medida que sale de la articulación de la rodilla. Tire de la punta del pasador con una pinza quirúrgica para que las secciones proximal y distal se junten.Luego doble los extremos del pasador quirúrgico hacia el sitio de la fractura para realinear los extremos de la fractura. Usando cortadores de alambre retire el plástico de la base de la aguja. Gire los extremos del pasador para evitar cualquier lesión en el tejido interno.Finalmente, reemplace los músculos en el fémur y cierre la abertura de la herida pellizcando la piel junto con clips. Realice un procedimiento similar sin la fractura de fémur en la otra pierna y cierre la herida. Después de la cirugía exitosa, las imágenes fluorescentes revelaron varios progenitores de Messent-Kinal, como las células periósticas Prx1 positivas, que se encontraron durante el proceso de reparación de la fractura del fémur.La tinción azul alciana del fémur fracturado reveló la formación de callo blando. Además, también se determinó el porcentaje de formación de callos o cartílagos. Al emplear Micro-CT aproximadamente 28 días después de la fractura, se detectó el proceso de mineralización junto con la brecha de callo y la brecha de fractura.También se observó que si los extremos de la fractura no estaban alineados correctamente o asegurados con un alfiler, había una falta de formación insensible en todo o un lado del extremo de la fractura. Al intentar este procedimiento, recuerde alinear cuidadosamente los dos extremos del fémur roto y estabilizarlos con el pasador para garantizar una curación adecuada. Después de la cirugía, el fémur se puede recolectar para imágenes y análisis molecular.

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator

Preparación de una sola célula suspensiones de bazo de ratón con el disociador gentleMACS

Single-cell suspensions are a prerequisite for experiments in cell separation, cell analysis and cell culture.  To avoid tedious and often painful manual ...

Investigación

Biología

Transverse Aortic Constriction in Mice

Constricción de la aorta transversa en ratones

Transverse aortic constriction (TAC) in the mouse is a commonly used experimental model for pressure overload-induced cardiac hypertrophy and heart ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

En vivo de imágenes y tratamientos terapéuticos en un modelo de ratón ortotópico de cáncer de ovario

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Characterization of the Isolated, Ventilated, and Instrumented Mouse Lung Perfused with Pulsatile Flow

Caracterización de los aislados y ventilados, y pulmón de ratón instrumentado perfundidos con flujo pulsátil

The isolated, ventilated and instrumented mouse lung preparation allows steady and pulsatile pulmonary vascular pressure-flow relationships to be measured ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

Generación de ratones derivados de células madre pluripotentes inducidas

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Fundamental Technical Elements of Freeze-fracture/Freeze-etch in Biological Electron Microscopy

Fundamental elementos técnicos de Freeze-fractura / Freeze-grabado en Biológica Microscopía Electrónica

Freeze-fracture/freeze-etch describes a process whereby specimens, typically biological or nanomaterial in nature, are frozen, fractured, and replicated ...

Phenotyping Mouse Pulmonary Function In Vivo with the Lung Diffusing Capacity

Phenotyping Mouse Pulmonary Function In Vivo with the Lung Diffusing Capacity

Función Fenotipificación ratón pulmonar<em&gt; En Vivo</em&gt; Con la capacidad de difusión pulmonar

The mouse is now the primary animal used to model a variety of lung diseases. To study the mechanisms that underlie such pathologies, phenotypic methods ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

Trans-interno celular masiva inyección de células madre embrionarias conduce a mayores tasas de quimerismo

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

Application of Passive Head Motion to Generate Defined Accelerations at the Heads of Rodents

Aplicación del movimiento pasivo de la cabeza para generar aceleraciones definidas en las cabezas de roedores

Exercise is widely recognized as effective for various diseases and physical disorders, including those related to brain dysfunction. However, molecular ...

Isolation of Conditionally Immortalized Mouse Glomerular Endothelial Cells with Fluorescent Mitochondria

Aislamiento de células endoteliales glomerulares de ratón condicionalmente inmortalizadas con mitocondrias fluorescentes

Glomerular endothelial cell (GEC) dysfunction can initiate and contribute to glomerular filtration barrier breakdown. Increased mitochondrial oxidative ...