न्यूरोडीजेनेरेटिव और व्यवहार अध्ययन में एक शक्तिशाली पशु मॉडल के रूप में, हंटिंगटन के रोग जैसे मॉडल का उपयोग करके पॉलीग्लूटामाइन न्यूरोटॉक्सिसिटी के खिलाफ विषाक्त यौगिकों को कुशलतापूर्वक स्क्रीन और मूल्यांकन करने के लिए सी.एलिगेंस का उपयोग किया जा सकता है। इस तकनीक का मुख्य लाभ विभिन्न सी.एलिगेंस मॉडल में कई फेनोटाइप्स की प्रोफाइलिंग और एकीकरण है। इसके अलावा वास्तव में इस विधि में सी.एलिगेंस मॉडल का उपयोग किया जाता है।
यह स्क्रीनिंग में आकार प्रदान करता है और अन्य न्यूरोडीजेनेरेटिव देरी और वास्तव में अन्य देरी के लिए चिकित्सीय उम्मीदवारों की जांच करता है। कृपया सी.एलिगेंस वृद्धि में उपयोग किए जाने वाले तापमान पर ध्यान दें और नामिक विकास के सही चरणों में परीक्षण करें। प्रक्रिया का प्रदर्शन तीन स्नातक छात्र जियांग यीयी, ज़ियोआ यू और वांग कियांगकियांग करेंगे।
एएम 141 नेमाटोड के 300 से 500 सिंक्रनाइज़ एल 1 लार्वा को 48 अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं में स्थानांतरित करके शुरू करें, जिसमें ई कोलाई के ओपी 50 तनाव और एस्ट्रैगलन के प्रति मिलीलीटर पांच मिलीग्राम एस माध्यम के 500 माइक्रोलीटर होते हैं। पैराफिल्म के साथ प्लेट सील करें और वांछित समय अंतराल के लिए 20 डिग्री सेल्सियस और 120 रोटेशन प्रति मिनट पर सेते हैं। एक बाँझ 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में नेमाटोड स्थानांतरण और शेष ओपी 50 कोशिकाओं को हटाने के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा तीन बार एम 9 बफर के साथ धो लें।
उसके बाद, M9 बफर में AM141 सूत्रकृमि पुन: निलंबित करें। अब, 384 अच्छी तरह से प्लेट में प्रत्येक कुएं में 10 से 15 नेमाटोड स्थानांतरित करें, प्रत्येक उपचार के लिए 10 प्रतिकृति कुओं को सेट करें और प्रत्येक कुएं में 200 मिलीमोलर सोडियम एजाइड के 10 माइक्रोलीटर जोड़ें ताकि नेमाटोड को पंगु बनाया जा सके। फ्लोरोसेंट छवियों को प्राप्त करने के लिए प्लेट को उच्च सामग्री इमेजिंग सिस्टम में रखें।
छवि अधिग्रहण सॉफ़्टवेयर खोलें और पाठ पांडुलिपि में उल्लिखित मापदंडों को सेट करें। समीक्षा प्लेट डेटा विंडो खोलकर और छवि विश्लेषण के लिए परीक्षण प्लेट का चयन करके छवि डेटा का विश्लेषण करें। अपनी छवि प्रदर्शित करने के लिए एक परीक्षण अच्छी तरह से डबल क्लिक करें।
फिर विश्लेषण विधि के रूप में गिनती नाभिक का चयन करें और कॉन्फ़िगर सेटिंग्स बटन पर क्लिक करें। एफआईटीसी चैनल से स्रोत छवि को परिभाषित करें और मानक एल्गोरिथ्म का चयन करें। पाठ पांडुलिपि में वर्णित छवि विश्लेषण मापदंडों को सेट करें और विश्लेषण की विधि को अनुकूलित करने के लिए उनका परीक्षण करें।
सेटिंग्स सहेजें और सभी कुओं पर विश्लेषण चलाएं। प्रत्येक कुएं में क्यू 40: वाईएफपी समुच्चय की कुल संख्या के रूप में कुल नाभिक निर्यात करें। प्रत्येक कुएं में नेमाटोड की संख्या की गणना करें और प्रत्येक समूह में प्रति सूत्रकृमि क्यू 40: वाईएफपी समुच्चय की औसत संख्या की गणना करें।
फिर, निषेध सूचकांक की गणना करें। पॉलीक्यू न्यूरोटॉक्सिसिटी परख के लिए नेमाटोड तैयार करने के लिए, एचए 759 नेमाटोड के 300 से 500 सिंक्रनाइज़ एल 1 लार्वा को 48 अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं में स्थानांतरित करें, जिसमें ई कोलाई के ओपी 50 तनाव और एस्ट्रैगलन के प्रति मिलीलीटर पांच मिलीग्राम शामिल हैं। प्लेटों को सील करने के बाद, एम 9 बफर में नेमाटोड को सेतें, फसल लें और फिर से निलंबित करें जैसा कि पहले प्रदर्शित किया गया था।
अब, एम 9 बफर के 100 मिलीलीटर में दो ग्राम एगरोज जोड़कर एगरोज़ पैड में तैयार करें और माइक्रोवेव में समाधान को उबलने के पास गर्म करें। दो मिलीमीटर मोटी ग्लास प्लेटों के दो टुकड़ों के बीच रखे गए एक मिलीमीटर मोटी माइक्रोस्कोपी ग्लास स्लाइड के केंद्र पर पिघले हुए एगरोज़ के 0.5 मिलीलीटर वितरित करें, एक और स्लाइड के साथ लंबवत रूप से कवर करें। एक बार अगारोज ठंडा होने और जमने के बाद धीरे-धीरे शीर्ष स्लाइड को हटा दें।
एग्रोस पैड पर 20 मिलीमोलर सोडियम एजाइड की एक बूंद जोड़कर एएसएच न्यूरोनल उत्तरजीविता परख शुरू करें और फिर उन्हें स्थिर करने के लिए ड्रॉप में 15 से 20 एचए 759 नेमाटोड स्थानांतरित करें। नेमाटोड के ऊपर धीरे-धीरे एक कवर स्लिप रखें। अब, एक डिजिटल कैमरे के साथ फिट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत स्लाइड रखें।
नेमाटोड के सिर क्षेत्र में जीएफपी सकारात्मक एएसएच न्यूरॉन्स का पता लगाने के लिए 40x उद्देश्य लेंस और एफआईटीसी फ़िल्टर का चयन करें। अपने सिर क्षेत्र में जीएफपी-लेबल वाले द्विपक्षीय एएसएच न्यूरॉन्स के साथ नेमाटोड की संख्या की गणना करने के लिए प्रत्येक समूह में बेतरतीब ढंग से 50 से अधिक नेमाटोड का चयन करें, और फिर एएसएच न्यूरॉन्स की जीवित रहने की दर की गणना करें। आसमाटिक परिहार परख के लिए, बीच में एक आठ दाढ़ ग्लिसरॉल लाइन बनाकर सामान्य और जाल क्षेत्रों में एक खाद्य मुक्त एनजीएम प्लेट को विभाजित करें।
फिर, जाल क्षेत्र में ग्लिसरॉल बाधा के माध्यम से पार करने वाले नेमाटोड को पंगु बनाने के लिए ग्लिसरॉल लाइन से लगभग एक सेंटीमीटर दूर 200 मिलीमोलर सोडियम एजाइड लाइन फैलाएं। प्रत्येक समूह के लिए तीन प्रतिकृति प्लेटों के सामान्य क्षेत्र में लगभग 200 नेमाटोड स्थानांतरित करें। फिर, नेमाटोड को आकर्षित करने के लिए ट्रैप ज़ोन पर 1% ब्यूटेनडियोन की एक बूंद जोड़ें।
पेट्री डिश के ढक्कन को तुरंत कवर करें और 90 मिनट के लिए 23 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। माइक्रोस्कोप के तहत दोनों क्षेत्रों पर नेमाटोड की संख्या स्कोर करें और परिहार सूचकांक की गणना करें। ट्रांसजेनिक पॉलीक्यू तनाव एएम 141 दृढ़ता से अपने शरीर की दीवार की मांसपेशियों की कोशिकाओं में क्यू 40: वाईएफपी संलयन प्रोटीन व्यक्त करता है, जिसे इस स्वचालित इमेजिंग और विश्लेषण प्रोटोकॉल द्वारा पहचाना जाता है, जिसकी बढ़ती मात्रा को इसकी सुरक्षात्मक क्षमता का प्रदर्शन करने वाले एस्ट्रैगलन उपचार द्वारा बाधित किया गया था।
नेमाटोड के सिर क्षेत्रों में जीएफपी प्रतिदीप्ति और द्विपक्षीय एएसएच न्यूरॉन्स का नुकसान एएसएच न्यूरोनल मृत्यु को इंगित करता है। इस एएसएच न्यूरोनल उत्तरजीविता परख का उपयोग कैनोरहाब्डाइटिस लालित्य न्यूरॉन्स पर परीक्षण यौगिकों के न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभाव का नेत्रहीन मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है। पॉलीक्यू एकत्रीकरण द्वारा मध्यस्थता वाले एएसएच न्यूरॉन्स के कार्यात्मक नुकसान पर प्रभावी परीक्षण नमूनों की जांच करने के लिए केमोसेंसरी परिहार परख का उपयोग किया गया था।
तीन दिनों के लिए 15 डिग्री सेल्सियस पर एस्ट्रागलन के साथ इलाज किए गए एचए 759 नेमाटोड का परिहार सूचकांक 0.6 से अधिक हो गया, जो व्यवहार हानि के खिलाफ पॉलीसेकेराइड के न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभाव का प्रदर्शन करता है। परीक्षण यौगिकों की समग्र न्यूरोप्रोटेक्टिव क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए, व्यक्तिगत परखों से डेटा को एकीकृत किया गया था और एक रडार चार्ट के रूप में प्रस्तुत किया गया था, जो नियंत्रण समूह की तुलना में एस्ट्रैगलन उपचार समूह में त्रिकोण के क्षेत्र को दर्शाता है, जो पॉलीसेकेराइड के एंटी-पॉलीक्यू प्रभावों को दर्शाता है। कृपया ध्यान रखें कि भोजन, तापमान और नमी सी.एलिगेंस के उनके व्यवहार को प्रभावित कर सकते हैं।
