Name: interphase fluorescence in situ hybridization of bone marrow smears of multiple myeloma
Uploaded: 2022-04-15T14:00:00
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Ce projet a été soutenu par le Fonds d’innovation de WNLO 2018WNLOKF023.

Cette étude a été menée conformément aux principes de la Déclaration d’Helsinki et approuvée par le Comité d’éthique de l’hôpital Zhongnan de l’Université de Wuhan (n° 2019065). Les échantillons ont été prélevés sur un patient MM du département d’hématologie de l’hôpital Zhongnan de l’Université de Wuhan (Chine).
1. Préparation des frottis BM
<ol><li>Placez les premiers 0,2 mL de solution BM sur une lame de verre jetable propre.</li>
	<li>...

<ol>
	<li>Sonneveld, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+multiple+myeloma+with+high-risk+cytogenetics:+a+consensus+of+the+International+Myeloma+Working+Group.">Treatment of multiple myeloma with high-risk cytogenetics: a consensus of the International Myeloma Working Group.</a> Blood. 127, 2955-2962 (2016).</li><li>Radbruch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competence+and+competition:+the+challenge+of+becoming+a+long-lived+plasma+cell.">Competence and competition: the challenge of becoming a long-lived plasma cell.</a> Nature Reviews Immunology. 6, 741-750 (2006).</li><li>Lai, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+cytogenetics+in+multiple+myeloma:+a+study+of+151+patients+including+117+patients+at+diagnosis.">Improved cytogenetics in multiple myeloma: a study of 151 patients including 117 patients at diagnosis.</a> Blood. 85 (9), 2490-2497 (1995).</li><li>Hallek, M., Bergsagel, P. L., Anderson, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+myeloma:+increasing+evidence+for+a+multistep+transformation+process.">Multiple myeloma: increasing evidence for a multistep transformation process.</a> Blood. 91, 3-21 (1998).</li><li>Munsh, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+recommendations+for+risk+stratification+in+multiple+myeloma:+report+of+the+International+Myeloma+Workshop+Consensus+Panel+2.">Consensus recommendations for risk stratification in multiple myeloma: report of the International Myeloma Workshop Consensus Panel 2.</a> Blood. 117, 4696-4700 (2011).</li><li>Gole, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cIg-FISH+On+Patients+with+Multiple+Myeloma+-+A+Modified+and+Simple+Technique+Easily+Incorporated+Into+Routine+Clinical+Service.">cIg-FISH On Patients with Multiple Myeloma - A Modified and Simple Technique Easily Incorporated Into Routine Clinical Service.</a> Blood. 120, 4792-4792 (2012).</li><li>Lee, S. H., Erber, W., Porwit, A., Tomonaga, M., Peterson, L. I. C. S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematology,+ICSH+guidelines+for+the+standardization+of+bone+marrow+specimens+and+reports.">Hematology, ICSH guidelines for the standardization of bone marrow specimens and reports.</a> International Journal of Laboratory Hematology. 30, 349-364 (2008).</li><li>&#352;tifter, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+evaluation+of+bone+marrow+aspirate+and+biopsy+is+superior+in+the+prognosis+of+multiple+myeloma.">Combined evaluation of bone marrow aspirate and biopsy is superior in the prognosis of multiple myeloma.</a> Diagnostic Pathology. 5, 30 (2010).</li><li>Huegel, A., Coyle, L., McNeil, R., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+interphase+fluorescence+in+situ+hybridization+on+direct+hematological+bone+marrow+smears.">Evaluation of interphase fluorescence in situ hybridization on direct hematological bone marrow smears.</a> Pathology. 27, 86-90 (1995).</li><li>Jacobsson, B., Bernell, P., Arvidsson, I., Hast, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classical+morphology,+esterase+cytochemistry,+and+interphase+cytogenetics+of+peripheral+blood+and+bone+marrow+smears.">Classical morphology, esterase cytochemistry, and interphase cytogenetics of peripheral blood and bone marrow smears.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 44, 1303-1309 (1996).</li><li>Dunning, K., Safo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ultimate+Wright-Giemsa+stain:+60+years+in+the+making.">The ultimate Wright-Giemsa stain: 60 years in the making.</a> Biotechnic &amp; Histochemistry. 86, 69-75 (2011).</li><li>Woronzoff-Dashkoff, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+wright-giemsa+stain.+Secrets+revealed.">The wright-giemsa stain. Secrets revealed.</a> Clinics in Laboratory Medicine. 22, 15-23 (2002).</li><li>McPherson, R. A., Pincus, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Henry's+Clinical+diagnosis+and+Management+by+Laboratory+Methods+E-book.">Henry's Clinical diagnosis and Management by Laboratory Methods E-book.</a> Elsevier Health Sciences. , (2017).</li><li>Ross, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Report+from+the+European+Myeloma+Network+on+interphase+FISH+in+multiple+myeloma+and+related+disorders.">Report from the European Myeloma Network on interphase FISH in multiple myeloma and related disorders.</a> Haematologica. 97, 1272-1277 (2012).</li></ol>

L’application de FISH à la stratification des risques génétiques dans le MM est essentielle. La partie critique des rapports FISH n’est pas toutes les cellules nucléées, mais les PC clonaux spécifiquement purifiés ou identifiés par tri avec des billes magnétiques anti-CD138 ou marquage avec une chaîne légère d’immunoglobuline cytoplasmique κ ou λ. L’interphase FISH après le tri PC ou cIg-FISH s’est avérée significative dans le diagnostic de MM en raison de la proportion relativement plus faible...

Le myélome multiple (MM) est une maladie maligne à plasmocytes (PC) avec une forte hétérogénéité biologique et de grandes différences individuelles dans l’efficacité clinique, avec des périodes de survie allant de mois à des décennies. Les caractéristiques cytogénétiques sont des indicateurs pronostiques importants de la MM. Le système de stratification des risques et les traitements individualisés basés sur les caractéristiques génétiques sont devenus des sujets d’intérêt intense dans la recherche clinique sur le MM1. Les aberrations des PC testés dans un panel d’hybridation in situ en fluorescence (FISH) de moelle osseuse (BM) comprennent del 13q14 (RB1), del 17p13 (TP53), t(4;14) (IGH/FGFR3), t(11;14) (IGH/MYEOV), t(14;16) (IGH/MAF), t(14:20) (IGH/MAFB), 1q21 (CKS1B) gain/amplification et 1p (CDKN2C).
La cytogénétique métaphasique standard doit être incluse dans l’évaluation initiale des patients atteints de MM. Bien que le caryotypage conventionnel à bande G offre l’avantage d’une analyse chromosomique entière, le faible rendement de cette méthode conduit à de nombreux résultats faussement négatifs2. Traditionnellement, les PC ont été considérés comme largement incapables de se diviser parce qu’ils sont les produits finaux de la différenciation des lymphocytes B. Cela rend difficile l’obtention d’images fractionnées. L’amélioration de l’analyse cytogénétique dans la MM avec des cultures à long terme (6 jours) et la stimulation des cultures par des cytokines peuvent être une méthode prometteuse pour identifier les anomalies cytogénétiques chez les patients atteints de MM nouvellement diagnostiqués3. Même lorsque le temps de culture a été prolongé à 6 jours, cependant, des anomalies cytogénétiques ont été rapportées avec précision chez 30% à 50% des patients atteints de MM4. De plus, le MM est caractérisé par des aberrations cytogénétiques complexes qui reflètent son hétérogénéité pronostique. Cependant, la résolution de la technologie traditionnelle de bandes chromosomiques est faible, ce qui peut facilement conduire à une détection manquée d’anomalies chromosomiques dans le MM.
Le FISH interphasé, de préférence après tri ou marquage à base de billes magnétiques CD138 positif à base de billes magnétiques avec une chaîne légère d’immunoglobuline cytoplasmique κ/λ, est indispensable dans l’analyse de MM5,6. Un échantillon sélectionné CD138 positif est fortement recommandé pour le rendement optimisé des cellules tumorales. Cependant, une quantification précise des aberrations cytogénétiques nécessite au moins 4 mL de BM anticoagulé pour le tri PC. De plus, les combinaisons de tri immunomagnétique de billes CD138 avec FISH ou d’immunoglobuline cytoplasmique à chaîne légère κ/λ avec test FISH (cIg-FISH) augmentent de nombreux coûts expérimentaux et prennent beaucoup de temps.
Habituellement, le rapport PC est d’abord évalué à partir de l’examen morphologique des frottis BM colorés ou des sections de biopsie BM7,8. Les échantillons BM de la plus haute qualité (premiers échantillons d’aspiration de moelle) sont utilisés pour les tests morphologiques, tandis que ceux envoyés pour FISH ou autre détection sont souvent les échantillons d’aspiration secondaire avec des rapports élevés de dilution avec le sang périphérique.
Dès les années 1990, de nombreuses études ont montré que les frottis de BM peuvent être directement utilisés pour les examens interstitiels FISH, ce qui s’est avéré être une méthode fiable et reproductible9. Une étude élégante basée sur la morphologie cellulaire et la cytochimie de l’estérase combinée à FISH de sang périphérique et à des frottis de BM a confirmé sa grande importance clinique pour élucider les anomalies chromosomiques chez les patients atteints de leucémie granulocytaire et lymphocytaire10.
Ici, nous fournissons une nouvelle méthode pour améliorer le succès de la détection interphasée fish chez les patients MM.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>automatic FISH machine</td>
			<td>Leica&#160; Corporation</td>
			<td>S500-24</td>
			<td>FINAL Assy Thermobrite 240V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Abbott Molecular Inc.</td>
			<td>06J49-001</td>
			<td>DAPI Counterstain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FISH Analysis Software</td>
			<td>IMSTAR&#160; Corporation</td>
			<td>IMSTAR</td>
			<td>FISH Analysis Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FISH Probe</td>
			<td>Abbott Molecular Inc.</td>
			<td>05N56-020</td>
			<td>Vysis Locus Specifc Identifer TP53 / CEP 17 FISH Probe Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed volume pipette</td>
			<td>Eppendorf China Ltd.</td>
			<td>M33768H</td>
			<td>10&#160; microliter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope</td>
			<td>Olympus Corporation</td>
			<td>BX53</td>
			<td>Forward Fluorescence Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Karyotype Analysis Software</td>
			<td>IMSTAR&#160; Corporation</td>
			<td>IMSTAR</td>
			<td>Karyotype Analysis Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Microscope</td>
			<td>Olympus&#160; Corporation</td>
			<td>BX41</td>
			<td>Forward Light Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Abbott Molecular Inc.</td>
			<td>07J05-001</td>
			<td>NP-40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic staining dyeing rack</td>
			<td>Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd.</td>
			<td>RSJ-501</td>
			<td>&#160;24 slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic staining dyeing tank</td>
			<td>Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd.</td>
			<td>RSJ-516</td>
			<td>&#160;24 slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber Cement</td>
			<td>Marabu&#160;GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>FixoGum&#160;</td>
			<td>Rubber Cement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSC</td>
			<td>Abbott Molecular Inc.</td>
			<td>02J10-032</td>
			<td>20&#215;SSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Shanghai Boxun Medical Bio-Instrument Co., Ltd.</td>
			<td>DK-8D</td>
			<td>Multiple Temperature Water bath</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

interphase fluorescence in situ hybridization of bone marrow smears of multiple myeloma

La détection de l’hybridation in situ par fluorescence (FISH) est une méthode indispensable dans la stratification du risque génétique dans le myélome multiple (MM), qui est l’une des tumeurs malignes hématologiques les plus courantes. La caractéristique d’identification du MM est l’accumulation de plasmocytes malins dans la moelle osseuse. Les rapports FISH pour MM se concentrent principalement sur les plasmocytes clonaux purifiés ou identifiés, plutôt que sur toutes les cellules nucléées, en triant avec des billes magnétiques anti-CD138 ou en marquant avec une chaîne légère d’immunoglobuline cytoplasmique κ ou λ. Les noyaux interphasiques de la moelle osseuse sont généralement obtenus à partir de cellules fraîches de la moelle osseuse. Cependant, un enrichissement satisfaisant des échantillons de plasmocytes nécessite de grandes quantités de moelle osseuse fraîche anti-coagulée à l’héparine, ce qui ne peut être obtenu en cas d’extraction difficile de la moelle osseuse ou d’un robinet sec de moelle osseuse. Ici, nous établissons une nouvelle méthode pour améliorer le succès de la détection de FISH sur les frottis de moelle osseuse colorés ou non colorés. Les frottis de moelle osseuse sont plus faciles à obtenir que les échantillons de moelle osseuse anticoagulés.

Lors de l’évaluation morphologique initiale d’un patient atteint de MM nouvellement diagnostiqué, 15 % des PC d’un frottis de BM présentaient des noyaux plus gros et plus sombres ainsi que de plus grandes quantités de cytoplasme que les PC normaux (Figure 2A). Le premier tube de BM anti-coagulé à l’héparine détecté par la technique de l’immunophénotype n’a révélé que 2,3% des PC aberrants monoclonaux. Le tri immunomagnétique des billes CD138 en combinaison avec FISH...

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Interphase Fluorescence in situ Hybridization of Bone Marrow Smears of Multiple Myeloma

Nous présentons ici un protocole pour améliorer le succès de la détection de l’hybridation in situ par fluorescence interphasique sur les frottis de moelle osseuse de patients atteints de myélome multiple.

Fluorescence interphasique hybridation in situ des frottis de moelle osseuse du myélome multiple

Fluorescence in situ hybridization (FISH) detection is an indispensable method in genetic risk stratification in multiple myeloma (MM), which is one of ...

L’application de l’hybridation in situ par fluorescence appelée FISH à la stratification du risque génétique dans le myélome multiple est essentielle. La partie critique des rapports FISH n’est pas toutes les cellules nucléées, mais les plasmocytes clonaux spécifiquement purifiés ou identifiés par tri avec des billes magnétiques anti-CD138 ou marquage avec une immunoglobuline à chaîne légère cytoplasmique kappa ou Lambda avec un test FISH appelé cIg FISH. Interphase FISH après tri plasmocytaire ou cIg FISH s’avère significatif dans le diagnostic du myélome multiple, en raison de la proportion relativement plus faible de plasmocytes dans la moelle osseuse.Cependant, ces méthodes présentent certaines lacunes, notamment des processus complexes, des exigences élevées en matière d’échantillons et des coûts expérimentaux élevés. Les plasmocytes peuvent être rapidement localisés dans un frottis de moelle osseuse. Sur cette base, nous utilisons le frottis de moelle osseuse FISH pour la détection des cellules du myélome multiple.Cette étude a été menée selon les principes de la Déclaration d’Helsinki et approuvée par le Comité d’éthique de l’hôpital Zhongnan de l’Université de Wuhan. Les échantillons ont été prélevés sur un patient atteint de myélome multiple au département d’hématologie de l’hôpital Zhongnan de l’Université de Wuhan en Chine. Placez le premier 0,2 millilitre de solution de moelle osseuse sur une lame de verre jetable propre, étalez les frottis de moelle osseuse à une épaisseur uniforme et à des queues pointues en retirant rapidement la moelle osseuse puis séchez-la naturellement.Couvrir les pellicules de moelle osseuse d’un millilitre de solution de Wright-Giemsa pendant environ 10 secondes à température ambiante. Ajouter un millilitre de tampon phosphate aux lames, des précautions ont été nécessaires pour empêcher la solution de colorant de sécher ou de s’écouler des lames. Mélangez doucement la solution de colorant et maintenez-la pendant 15 minutes à température ambiante.Rincez les lames à l’eau claire et séchez-les à l’air à température ambiante. Utilisez la microscopie optique avancée pour détecter les plasmocytes malins, les plasmocytes doivent être bien dispersés. Maintenant, ce que nous voyons sur le terrain, ce sont les plasmocytes qui sont assez dispersés.Il s’agit d’une cellule de plasma nucléaire Binucléaire typique. Couvrir la zone hybridée avec une solution fixative pendant 10 minutes pour décolorer et fixer les plasmocytes. Rincez la lame à l’eau désionisée et séchez-la à l’air à température ambiante.Préchauffer un pot contenant deux fois le tampon SSC à 56 degrés Celsius au bain-marie. Laver le frottis de moelle osseuse préparé dans le tampon SSC préchauffé deux fois pendant 10 minutes, puis tremper dans de l’eau désionisée à température ambiante. Déshydratez le frottis dans un gradient d’éthanol de 70% 85% et 100% d’éthanol chacun pendant une minute.Sécher le frottis à l’air pendant 10 minutes. Ajoutez d’abord TP53 sur centromère du mélange de sonde du chromosome 17 à la zone d’hybridation et recouvrez-la d’un couvercle, appuyez doucement sur la pince à épiler fine et pointue pour éliminer les bulles d’air par le dessous. Scellez tous les côtés du couvercle avec du ciment en caoutchouc pour assurer une bonne étanchéité.Après la solidification du ciment en caoutchouc, la lame a été placée sur une machine automatique FISH, la dénaturation a été effectuée à 78 degrés Celsius pendant cinq minutes, suivie d’une hybridation à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Récupérez la glissière de la machine FISH. Utilisez une pince à épiler fine et pointue pour enlever doucement le ciment en caoutchouc.Immergez la glissière dans deux fois SSC à température ambiante pendant environ une ou deux minutes pour laver le couvercle. Lavez la glissière dans un tampon de préchauffage de 68 degrés Celsius au bain-marie pendant deux minutes. Lavez les diapositives avec deux fois SSC dans un bain-marie de 37 degrés Celsius pendant une minute.Installez-vous dans l’obscurité pour bien sécher pendant 10 minutes à 10 microlitres de DAPI dans la zone hybridée, couvrez avec un couvercle. Visualisez une lame hybridée à l’aide d’un filtre approprié sur un microscope à fluorescence, utilisez un filtre optique fluorophore bleu monochromatique pour observer l’intensité de fluorescence du noyau cellulaire. Prenez des images de noyau cellulaire sous un ensemble de filtres DAPI.Le CEP17 a été marqué avec une fluorescence verte. Utilisez un filtre optique fluorophore vert à spectre pour observer l’emplacement du CEP17. Prenez l’image des signaux CEP17 sous le jeu de filtres verts.Le gène TP53 a été marqué avec une fluorescence orange. Utilisez un filtre optique fluorophore orange à spectre pour observer TP53, prendre l’image des signaux TP53 sous l’ensemble, fusionner ces trois images dans un ensemble et examiner les anomalies numériques. Dans une cellule interphasique normale, deux signaux orange et deux signaux verts sont observés à l’intérieur d’un noyau avec une fluorescence bleue indiquant une paire de chromosomes normaux 17.Les résultats ont montré la morphologie et la génétique de la moelle osseuse chez un patient atteint de myélome multiple. La figure A a montré que 15% des plasmocytes dans un frottis de moelle osseuse se sont révélés plus gros et plus sombres et nucléaires ainsi que de grandes quantités de cytoplasme que la normale. La figure B montrait une image en échelle de gris représentative par un plasmocyte nucléé dans un frottis de moelle osseuse.La figure C montrait quatre signaux orange et quatre signaux verts dans un noyau interphasique de plasmocytes suggérant que quatre copies du chromosome 17 étaient localisées dans un noyau. La figure D a montré que le caryogramme chromosomique anormal de ce patient a confirmé deux paires de chromosomes 17 dans un noyau. Les frottis de moelle osseuse sont beaucoup plus faciles à obtenir que les échantillons de moelle osseuse anticoagulants, car l’obtention de moelle osseuse anticoagulée nécessite des procédures complexes pour obtenir le noyau.En conséquence, nous avons établi une méthode convaincante pour le frottis de moelle osseuse FISH pour la détection des cellules myélomateuses multiples.

Research

JoVE Journal

Medicine

Interphase Fluorescence in situ Hybridization of Bone Marrow Smears of Multiple Myeloma

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