Name: interphase fluorescence in situ hybridization of bone marrow smears of multiple myeloma
Uploaded: 2022-04-15T14:00:00
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Questo progetto è stato sostenuto dal Fondo per l'innovazione di WNLO 2018WNLOKF023.

Questo studio è stato condotto secondo i principi della Dichiarazione di Helsinki e approvato dal Comitato Etico dell'Ospedale Zhongnan dell'Università di Wuhan (n. 2019065). I campioni sono stati raccolti da un paziente di MM nel Dipartimento di Ematologia, Zhongnan Hospital dell'Università di Wuhan (Cina).
1. Preparazione degli strisci BM
<ol><li>Posizionare i primi 0,2 ml di soluzione bm su un vetrino monouso pulito.</li>
	<li>Distribuire le strisce BM a spessore unifo...

<ol>
	<li>Sonneveld, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+multiple+myeloma+with+high-risk+cytogenetics:+a+consensus+of+the+International+Myeloma+Working+Group.">Treatment of multiple myeloma with high-risk cytogenetics: a consensus of the International Myeloma Working Group.</a> Blood. 127, 2955-2962 (2016).</li><li>Radbruch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competence+and+competition:+the+challenge+of+becoming+a+long-lived+plasma+cell.">Competence and competition: the challenge of becoming a long-lived plasma cell.</a> Nature Reviews Immunology. 6, 741-750 (2006).</li><li>Lai, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+cytogenetics+in+multiple+myeloma:+a+study+of+151+patients+including+117+patients+at+diagnosis.">Improved cytogenetics in multiple myeloma: a study of 151 patients including 117 patients at diagnosis.</a> Blood. 85 (9), 2490-2497 (1995).</li><li>Hallek, M., Bergsagel, P. L., Anderson, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+myeloma:+increasing+evidence+for+a+multistep+transformation+process.">Multiple myeloma: increasing evidence for a multistep transformation process.</a> Blood. 91, 3-21 (1998).</li><li>Munsh, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+recommendations+for+risk+stratification+in+multiple+myeloma:+report+of+the+International+Myeloma+Workshop+Consensus+Panel+2.">Consensus recommendations for risk stratification in multiple myeloma: report of the International Myeloma Workshop Consensus Panel 2.</a> Blood. 117, 4696-4700 (2011).</li><li>Gole, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cIg-FISH+On+Patients+with+Multiple+Myeloma+-+A+Modified+and+Simple+Technique+Easily+Incorporated+Into+Routine+Clinical+Service.">cIg-FISH On Patients with Multiple Myeloma - A Modified and Simple Technique Easily Incorporated Into Routine Clinical Service.</a> Blood. 120, 4792-4792 (2012).</li><li>Lee, S. H., Erber, W., Porwit, A., Tomonaga, M., Peterson, L. I. C. S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematology,+ICSH+guidelines+for+the+standardization+of+bone+marrow+specimens+and+reports.">Hematology, ICSH guidelines for the standardization of bone marrow specimens and reports.</a> International Journal of Laboratory Hematology. 30, 349-364 (2008).</li><li>&#352;tifter, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+evaluation+of+bone+marrow+aspirate+and+biopsy+is+superior+in+the+prognosis+of+multiple+myeloma.">Combined evaluation of bone marrow aspirate and biopsy is superior in the prognosis of multiple myeloma.</a> Diagnostic Pathology. 5, 30 (2010).</li><li>Huegel, A., Coyle, L., McNeil, R., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+interphase+fluorescence+in+situ+hybridization+on+direct+hematological+bone+marrow+smears.">Evaluation of interphase fluorescence in situ hybridization on direct hematological bone marrow smears.</a> Pathology. 27, 86-90 (1995).</li><li>Jacobsson, B., Bernell, P., Arvidsson, I., Hast, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classical+morphology,+esterase+cytochemistry,+and+interphase+cytogenetics+of+peripheral+blood+and+bone+marrow+smears.">Classical morphology, esterase cytochemistry, and interphase cytogenetics of peripheral blood and bone marrow smears.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 44, 1303-1309 (1996).</li><li>Dunning, K., Safo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ultimate+Wright-Giemsa+stain:+60+years+in+the+making.">The ultimate Wright-Giemsa stain: 60 years in the making.</a> Biotechnic &amp; Histochemistry. 86, 69-75 (2011).</li><li>Woronzoff-Dashkoff, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+wright-giemsa+stain.+Secrets+revealed.">The wright-giemsa stain. Secrets revealed.</a> Clinics in Laboratory Medicine. 22, 15-23 (2002).</li><li>McPherson, R. A., Pincus, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Henry's+Clinical+diagnosis+and+Management+by+Laboratory+Methods+E-book.">Henry's Clinical diagnosis and Management by Laboratory Methods E-book.</a> Elsevier Health Sciences. , (2017).</li><li>Ross, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Report+from+the+European+Myeloma+Network+on+interphase+FISH+in+multiple+myeloma+and+related+disorders.">Report from the European Myeloma Network on interphase FISH in multiple myeloma and related disorders.</a> Haematologica. 97, 1272-1277 (2012).</li></ol>

L'applicazione della FISH alla stratificazione del rischio genetico nel MM è essenziale. La parte critica dei rapporti FISH non sono tutte le cellule nucleate, ma i PC clonali specificamente purificati o identificati mediante smistamento con perline magnetiche anti-CD138 o marcatura con catena leggera di immunoglobuline citoplasmatiche κ o λ. Interphase FISH dopo LO SMISTAMENTO PC o cIg-FISH è risultato significativo nella diagnosi di MM a causa della percentuale relativamente inferiore di PC nel BM. Tuttavia, questi...

Il mieloma multiplo (MM) è una malattia maligna delle plasmacellule (PC) con forte eterogeneità biologica e grandi differenze individuali nell'efficacia clinica, con periodi di sopravvivenza che vanno da mesi a decenni. Le caratteristiche citogenetiche sono importanti indicatori prognostici del MM. Il sistema di stratificazione del rischio e i trattamenti individualizzati basati su caratteristiche genetiche sono diventati argomenti di intenso interesse nella ricerca clinica sulla MM1. Le aberrazioni dei PC testati in un pannello di ibridazione fluorescente in situ (FISH) di midollo osseo (BM) includono del 13q14 (RB1), del 17p13 (TP53), t(4;14) (IGH/FGFR3), t(11;14) (IGH/MYEOV), t(14;16) (IGH/MAF), t(14:20) (IGH/MAFB), 1q21 (CKS1B) gain/amplification e 1p (CDKN2C) deletion.
La citogenetica standard delle metafasi deve essere inclusa nella valutazione iniziale dei pazienti con MM. Sebbene il cariotipo convenzionale a banda G offra il vantaggio di un'analisi dell'intero cromosoma, la bassa resa di questo metodo porta a molti risultati falsi negativi2. Tradizionalmente, i PC sono stati visti come in gran parte incapaci di scissione perché sono i prodotti allo stadio terminale della differenziazione dei linfociti B. Ciò rende difficile ottenere immagini divise. Una migliore analisi citogenetica nel MM con colture a lungo termine (6 giorni) e la stimolazione delle colture da parte delle citochine possono essere un metodo promettente per identificare le anomalie citogenetiche nei pazienti con MM di nuova diagnosi3. Anche quando il tempo di coltura è stato prolungato a 6 giorni, tuttavia, le anomalie citogenetiche sono state accuratamente riportate nel 30%-50% dei pazienti con MM4. Inoltre, il MM è caratterizzato da aberrazioni citogenetiche complesse che riflettono la sua eterogeneità prognostica. Tuttavia, la risoluzione della tradizionale tecnologia di banding cromosomico è bassa, il che può facilmente portare alla mancata rilevazione di anomalie cromosomiche nel MM.
La FISH interfase, preferibilmente dopo smistamento o marcatura con PC a base di perline magnetiche CD138-positive con catena leggera di immunoglobuline citoplasmatiche κ/λ, è indispensabile nell'analisi di MM5,6. Un campione selezionato CD138-positivo è fortemente raccomandato per la resa ottimizzata delle cellule tumorali. Tuttavia, una quantificazione accurata delle aberrazioni citogenetiche richiede almeno 4 ml di BM anticoagulato per lo smistamento del PC. Inoltre, le combinazioni di SMistamento immunomagnetico delle perline CD138 con FISH o immunoglobuline citoplasmatiche a catena leggera κ/λ con test FISH (cIg-FISH) aumentano numerosi costi sperimentali e richiedono molto tempo.
Di solito, il rapporto PC viene prima valutato dall'esame morfologico di strisci bm colorati o sezioni di biopsia BM7,8. I campioni di BM di altissima qualità (campioni di primo aspirato di midollo) vengono utilizzati per i test morfologici, mentre quelli inviati per FISH o altra rilevazione sono spesso i campioni di aspirato secondario con alti rapporti di diluizione con sangue periferico.
Già nel 1990, diversi studi hanno dimostrato che gli strisci BM possono essere utilizzati direttamente per gli esami FISH interstiziali, che ha dimostrato di essere un metodo affidabile e ripetibile9. Un elegante studio basato sulla morfologia cellulare e sulla citochimica dell'esterasi combinato con FISH di sangue periferico e strisci bm ha confermato il suo grande significato clinico per chiarire le anomalie cromosomiche in pazienti con leucemia granulocitica e linfocitica10.
Qui forniamo un nuovo metodo per migliorare il successo del rilevamento FISH interfase nei pazienti con MM.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>automatic FISH machine</td>
			<td>Leica&#160; Corporation</td>
			<td>S500-24</td>
			<td>FINAL Assy Thermobrite 240V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Abbott Molecular Inc.</td>
			<td>06J49-001</td>
			<td>DAPI Counterstain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FISH Analysis Software</td>
			<td>IMSTAR&#160; Corporation</td>
			<td>IMSTAR</td>
			<td>FISH Analysis Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FISH Probe</td>
			<td>Abbott Molecular Inc.</td>
			<td>05N56-020</td>
			<td>Vysis Locus Specifc Identifer TP53 / CEP 17 FISH Probe Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed volume pipette</td>
			<td>Eppendorf China Ltd.</td>
			<td>M33768H</td>
			<td>10&#160; microliter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope</td>
			<td>Olympus Corporation</td>
			<td>BX53</td>
			<td>Forward Fluorescence Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Karyotype Analysis Software</td>
			<td>IMSTAR&#160; Corporation</td>
			<td>IMSTAR</td>
			<td>Karyotype Analysis Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Microscope</td>
			<td>Olympus&#160; Corporation</td>
			<td>BX41</td>
			<td>Forward Light Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Abbott Molecular Inc.</td>
			<td>07J05-001</td>
			<td>NP-40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic staining dyeing rack</td>
			<td>Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd.</td>
			<td>RSJ-501</td>
			<td>&#160;24 slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic staining dyeing tank</td>
			<td>Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd.</td>
			<td>RSJ-516</td>
			<td>&#160;24 slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber Cement</td>
			<td>Marabu&#160;GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>FixoGum&#160;</td>
			<td>Rubber Cement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSC</td>
			<td>Abbott Molecular Inc.</td>
			<td>02J10-032</td>
			<td>20&#215;SSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Shanghai Boxun Medical Bio-Instrument Co., Ltd.</td>
			<td>DK-8D</td>
			<td>Multiple Temperature Water bath</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

interphase fluorescence in situ hybridization of bone marrow smears of multiple myeloma

Il rilevamento dell'ibridazione fluorescente in situ (FISH) è un metodo indispensabile nella stratificazione del rischio genetico nel mieloma multiplo (MM), che è una delle neoplasie ematologiche più comuni. La caratteristica identificativa del MM è l'accumulo di plasmacellule maligne nel midollo osseo. I rapporti FISH per MM si concentrano principalmente sulle plasmacellule clonali purificate o identificate, piuttosto che su tutte le cellule nucleate, ordinando con perline magnetiche anti-CD138 o marcando con catena leggera di immunoglobuline citoplasmatiche κ o λ. I nuclei interfasici del midollo osseo sono solitamente ottenuti da cellule fresche del midollo osseo. Tuttavia, un arricchimento soddisfacente dei campioni di plasmacellule richiede grandi quantità di eparina fresca anticoagulato, che non può essere ottenuta in caso di estrazione difficile del midollo osseo o di un rubinetto secco del midollo osseo. Qui, stabiliamo un nuovo metodo per migliorare il successo del rilevamento FISH su strisci di midollo osseo macchiati o non macchiati. Gli strisci di midollo osseo sono più facili da ottenere rispetto ai campioni di midollo osseo anticoagulato.

Nella valutazione morfologica iniziale di un paziente con MM di nuova diagnosi, il 15% dei PC in uno striscio di BM è risultato avere nuclei più grandi e più scuri insieme a quantità maggiori di citoplasma rispetto ai normali PC (Figura 2A). Il primo tubo di BM anticoagulato di eparina rilevato con la tecnica dell'immunofenotipo ha rivelato solo il 2,3% dei PC monoclonali aberranti. Lo smistamento immunomagnetico delle perline CD138 in combinazione con FISH o la tecnica cIg-FISH è essen...

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Interphase Fluorescence in situ Hybridization of Bone Marrow Smears of Multiple Myeloma

Qui, presentiamo un protocollo per migliorare il successo del rilevamento dell'ibridazione in situ a fluorescenza interfase su strisci di midollo osseo da pazienti con mieloma multiplo.

Ibridazione in situ a fluorescenza interfase di strisci di midollo osseo di mieloma multiplo

Fluorescence in situ hybridization (FISH) detection is an indispensable method in genetic risk stratification in multiple myeloma (MM), which is one of ...

L'applicazione dell'ibridazione fluorescente in situ chiamata FISH alla stratificazione del rischio genetico nel mieloma multiplo è essenziale. La parte critica dei rapporti FISH non sono tutte le cellule nucleate, ma le plasmacellule clonali specificamente purificate o identificate mediante smistamento con perline magnetiche anti-CD138 o marcatura con immunoglobuline citoplasmatiche kappa o Lambda a catena leggera con test FISH chiamati cIg FISH. Interphase FISH dopo selezione delle plasmacellule o cIg FISH risulta essere significativo nella diagnosi di mieloma multiplo, a causa della percentuale relativamente più bassa di plasmacellule nel midollo osseo.Tuttavia, questi metodi presentano alcune carenze, tra cui processi complessi, elevate richieste di campioni e alti costi sperimentali. Le plasmacellule possono essere rapidamente localizzate in uno striscio di midollo osseo. Sulla base di questo, utilizziamo lo striscio di midollo osseo FISH per il rilevamento di cellule di mieloma multiplo.Questo studio è stato condotto secondo i principi della Dichiarazione di Helsinki e approvato dal Comitato Etico dell'Ospedale Zhongnan dell'Università di Wuhan. I campioni sono stati raccolti da un paziente con mieloma multiplo nel Dipartimento di Ematologia, Zhongnan Hospital dell'Università cinese di Wuhan. Posizionare il primo 0,2 millilitri di soluzione di midollo osseo su un vetrino monouso pulito, distribuire gli strisci di midollo osseo a spessore uniforme e code affilate rimuovendo rapidamente il midollo osseo, quindi asciugarlo naturalmente.Coprire i film di midollo osseo con un millilitro di soluzione di Wright-Giemsa per circa 10 secondi a temperatura ambiente. Aggiungere un millilitro di tampone fosfato ai vetrini, è stata necessaria attenzione per evitare che la soluzione colorante si asciugasse o scorresse dai vetrini. Mescolare delicatamente la soluzione colorante e mantenerla per 15 minuti a temperatura ambiente.Risciacquare i vetrini con acqua pulita e asciugarli all'aria a temperatura ambiente. Utilizzare la microscopia a luce diretta per rilevare le plasmacellule maligne, le plasmacellule devono essere ben disperse. Ora quello che vediamo sul campo sono le plasmacellule che sono abbastanza disperse.Questa è una tipica plasmacellula nucleare Binuclear. Coprire l'area ibridata con soluzione fissativa per 10 minuti per scolorire e fissare le plasmacellule. Risciacquare il vetrino con acqua deionizzata e asciugarlo all'aria a temperatura ambiente.Preriscaldare un barattolo contenente due volte il buffer SSC a 56 gradi Celsius a bagnomaria. Lavare lo striscio di midollo osseo preparato nel tampone SSC preriscaldato due volte per 10 minuti, seguito immergendolo in acqua deionizzata a temperatura ambiente. Disidratare lo striscio in un gradiente di etanolo 70%85% e 100% di etanolo ciascuno per un minuto.Asciugare lo striscio all'aria per 10 minuti. Per prima cosa aggiungere TP53 sul centromero della miscela di sonda del cromosoma 17 all'area di ibridazione e coprirlo con una slitta di copertura premere delicatamente le pinzette a punta fine per rimuovere le bolle d'aria da sotto. Sigillare tutti i lati dello slittamento del coperchio con cemento di gomma per garantire una buona tenuta.Dopo la solidificazione del cemento gommato, il vetrino è stato posizionato su una macchina automatica FISH la denaturazione è stata eseguita a 78 gradi Celsius per cinque minuti seguita dall'ibridazione a 37 gradi Celsius durante la notte. Prelevare lo scivolo dalla macchina FISH. Utilizzare una pinzetta a punta fine per rimuovere delicatamente il cemento di gomma.Immergere la diapositiva in due volte SSC a temperatura ambiente per circa uno o due minuti per lavare via il coperchio. Lavare la diapositiva a 68 gradi Celsius tampone di preriscaldamento a bagnomaria per due minuti. Lavare le diapositive con due volte SSC in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per un minuto.Impostare al buio per asciugare accuratamente per 10 minuti a 10 microlitri di DAPI nell'area ibridata, coprire con un coperchio. Visualizza vetrino ibridato utilizzando un filtro adatto impostato su un microscopio a fluorescenza, usa il filtro ottico monocromatico blu fluoroforo per osservare l'intensità di fluorescenza del nucleo cellulare. Acquisire immagini del nucleo cellulare in un set di filtri DAPI.CEP17 è stato etichettato con fluorescenza verde. Utilizzare il filtro ottico a fluoroforo verde spettro per osservare la posizione di CEP17. Prendi l'immagine dei segnali CEP17 sotto il set di filtri verdi.Il gene TP53 è stato etichettato con fluorescenza arancione. Usa il filtro ottico al fluoroforo arancione dello spettro per osservare TP53, prendi l'immagine dei segnali TP53 sotto il set, unisci queste tre immagini in un'interezza ed esamina le anomalie numeriche. In una normale cellula interfase si osservano due segnali arancioni e due verdi all'interno di un nucleo con fluorescenza blu che indicano una coppia di cromosomi normali 17.I risultati hanno mostrato la morfologia e la genetica del midollo osseo in un paziente con mieloma multiplo. La figura A ha mostrato che il 15% delle plasmacellule in uno striscio di midollo osseo sono risultate avere più grandi e più scure e nucleari insieme a grandi quantità di citoplasma rispetto al normale. La figura B ha mostrato un'immagine in scala di grigi di rappresentante da una plasmacellula nucleata in uno striscio di midollo osseo.La figura C ha mostrato quattro segnali arancioni e quattro verdi in un nucleo interfase di plasmacellula suggerendo che quattro copie del cromosoma 17 erano localizzate in un nucleo. La figura D ha mostrato che il cariogramma cromosomico anormale di questo paziente ha confermato due coppie di cromosomi 17 in un nucleo. Gli strisci di midollo osseo sono molto più facili da ottenere rispetto ai campioni di midollo osseo anticoagulante perché ottenere midollo osseo anticoagulato richiede procedure complesse per ottenere il nucleo.Di conseguenza, abbiamo stabilito un metodo convincente per lo striscio di midollo osseo FISH per il rilevamento di cellule di mieloma multiplo.

Research

JoVE Journal

Medicine

Interphase Fluorescence in situ Hybridization of Bone Marrow Smears of Multiple Myeloma

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Analisi biofilm orale di espansori palatali da Fluorescence In Situ-ibridazione e microscopia confocale a scansione laser

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