Name: interphase fluorescence in situ hybridization of bone marrow smears of multiple myeloma
Uploaded: 2022-04-15T14:00:00
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이 프로젝트는 WNLO 2018WNLOKF023의 혁신 기금에 의해 지원되었습니다.

이 연구는 헬싱키 선언의 원칙에 따라 수행되었으며 우한 대학의 중난 병원 윤리위원회 (제 2019065 호)의 승인을 받았습니다. 표본은 중국 우한대학교 중난병원의 혈액학과에 있는 MM 환자로부터 채취하였다.
1. BM 도말의 제조
<ol><li>BM 용액의 첫 번째 0.2 mL를 깨끗한 일회용 유리 슬라이드 위에 놓습니다.</li>
	<li>BM을 신속하게 제거하여 날카로운 꼬리로 BM 얼룩을 ?...

<ol>
	<li>Sonneveld, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+multiple+myeloma+with+high-risk+cytogenetics:+a+consensus+of+the+International+Myeloma+Working+Group.">Treatment of multiple myeloma with high-risk cytogenetics: a consensus of the International Myeloma Working Group.</a> Blood. 127, 2955-2962 (2016).</li><li>Radbruch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competence+and+competition:+the+challenge+of+becoming+a+long-lived+plasma+cell.">Competence and competition: the challenge of becoming a long-lived plasma cell.</a> Nature Reviews Immunology. 6, 741-750 (2006).</li><li>Lai, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+cytogenetics+in+multiple+myeloma:+a+study+of+151+patients+including+117+patients+at+diagnosis.">Improved cytogenetics in multiple myeloma: a study of 151 patients including 117 patients at diagnosis.</a> Blood. 85 (9), 2490-2497 (1995).</li><li>Hallek, M., Bergsagel, P. L., Anderson, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+myeloma:+increasing+evidence+for+a+multistep+transformation+process.">Multiple myeloma: increasing evidence for a multistep transformation process.</a> Blood. 91, 3-21 (1998).</li><li>Munsh, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+recommendations+for+risk+stratification+in+multiple+myeloma:+report+of+the+International+Myeloma+Workshop+Consensus+Panel+2.">Consensus recommendations for risk stratification in multiple myeloma: report of the International Myeloma Workshop Consensus Panel 2.</a> Blood. 117, 4696-4700 (2011).</li><li>Gole, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cIg-FISH+On+Patients+with+Multiple+Myeloma+-+A+Modified+and+Simple+Technique+Easily+Incorporated+Into+Routine+Clinical+Service.">cIg-FISH On Patients with Multiple Myeloma - A Modified and Simple Technique Easily Incorporated Into Routine Clinical Service.</a> Blood. 120, 4792-4792 (2012).</li><li>Lee, S. H., Erber, W., Porwit, A., Tomonaga, M., Peterson, L. I. C. S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematology,+ICSH+guidelines+for+the+standardization+of+bone+marrow+specimens+and+reports.">Hematology, ICSH guidelines for the standardization of bone marrow specimens and reports.</a> International Journal of Laboratory Hematology. 30, 349-364 (2008).</li><li>&#352;tifter, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+evaluation+of+bone+marrow+aspirate+and+biopsy+is+superior+in+the+prognosis+of+multiple+myeloma.">Combined evaluation of bone marrow aspirate and biopsy is superior in the prognosis of multiple myeloma.</a> Diagnostic Pathology. 5, 30 (2010).</li><li>Huegel, A., Coyle, L., McNeil, R., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+interphase+fluorescence+in+situ+hybridization+on+direct+hematological+bone+marrow+smears.">Evaluation of interphase fluorescence in situ hybridization on direct hematological bone marrow smears.</a> Pathology. 27, 86-90 (1995).</li><li>Jacobsson, B., Bernell, P., Arvidsson, I., Hast, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classical+morphology,+esterase+cytochemistry,+and+interphase+cytogenetics+of+peripheral+blood+and+bone+marrow+smears.">Classical morphology, esterase cytochemistry, and interphase cytogenetics of peripheral blood and bone marrow smears.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 44, 1303-1309 (1996).</li><li>Dunning, K., Safo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ultimate+Wright-Giemsa+stain:+60+years+in+the+making.">The ultimate Wright-Giemsa stain: 60 years in the making.</a> Biotechnic &amp; Histochemistry. 86, 69-75 (2011).</li><li>Woronzoff-Dashkoff, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+wright-giemsa+stain.+Secrets+revealed.">The wright-giemsa stain. Secrets revealed.</a> Clinics in Laboratory Medicine. 22, 15-23 (2002).</li><li>McPherson, R. A., Pincus, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Henry's+Clinical+diagnosis+and+Management+by+Laboratory+Methods+E-book.">Henry's Clinical diagnosis and Management by Laboratory Methods E-book.</a> Elsevier Health Sciences. , (2017).</li><li>Ross, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Report+from+the+European+Myeloma+Network+on+interphase+FISH+in+multiple+myeloma+and+related+disorders.">Report from the European Myeloma Network on interphase FISH in multiple myeloma and related disorders.</a> Haematologica. 97, 1272-1277 (2012).</li></ol>

MM에서 유전 적 위험 계층화에 FISH를 적용하는 것이 필수적입니다. FISH 보고의 중요한 부분은 모든 유핵세포가 아니라, 항-CD138 마그네틱 비드로 분류하거나 세포질 면역글로불린 경쇄 κ 또는 λ로 마킹함으로써 특이적으로 정제되거나 확인된 클론 PC이다. PC 분류 후 상간 FISH 또는 cIg-FISH는 BM에서 PC의 상대적으로 낮은 비율로 인해 MM의 진단에 유의한 것으로 밝혀졌다. 그러나 이러한 방법에는 복잡?...

다발성 골수종 (MM)은 생물학적 이질성이 강하고 임상 효능이 큰 개인차를 가진 악성 혈장 세포 (PC) 질환으로 생존 기간은 수개월에서 수십 년 사이입니다. 세포유전학적 특성은 MM의 중요한 예후 지표이다. 위험 계층화 시스템과 유전 적 특성에 기반한 개별화 된 치료법은 MM1에 대한 임상 연구에 대한 강렬한 관심의 주제가되었습니다. 골수 (BM)의 형광 계내 혼성화 (FISH) 패널에서 테스트 된 PC의 수차에는 del 13q14 (RB1), del 17p13 (TP53), t (4;14) (IGH / FGFR3), t (11;14) (IGH / MYEOV), t (14;16) (IGH / MAF), t (14 : 20) (IGH / MAFB), 1q21 (CKS1B) 이득 / 증폭 및 1p (CDKN2C) 결실이 포함됩니다.
표준 형이상상 세포유전학은 MM 환자의 초기 평가에 포함되어야 한다. 기존의 G 밴드 핵형이 전체 염색체 분석의 이점을 제공하지만,이 방법의 낮은 수율은 많은 위음성 결과를 초래합니다2. 전통적으로, PC는 B 림프구 분화의 최종 단계 생성물이기 때문에 분할이 불가능한 것으로 간주되어 왔다. 이로 인해 분할 이미지를 얻기가 어렵습니다. 장기 배양(6일)을 통한 MM에서의 개선된 세포유전학적 분석 및 사이토카인에 의한 배양의 자극은 새로 진단된 MM 환자에서 세포유전학적 이상을 확인하기 위한 유망한 방법일 수 있다3. 그러나 배양 시간이 6일로 연장되었을 때조차도, 세포유전학적 이상은 MM 환자의 30%-50%에서 정확하게 보고되었다4. 또한, MM은 그의 예후 이질성을 반영하는 복잡한 세포유전학적 수차를 특징으로 한다. 그러나 전통적인 염색체 밴딩 기술의 해상도가 낮기 때문에 MM에서 염색체 이상을 쉽게 탐지하지 못할 수 있습니다.
세포질 면역글로불린 경쇄 κ/λ로 CD138 양성 자기 비드 기반 PC 분류 또는 마킹 후, 바람직하게는 상간 FISH는 MM5,6의 분석에 없어서는 안 될 필수 요소이다. CD138 양성 선별 샘플은 종양 세포의 최적화된 수율을 위해 강력하게 권장된다. 그러나, 세포유전학적 수차의 정확한 정량화는 PC 분류를 위해 적어도 4mL의 항응고된 BM을 필요로 한다. 또한, CD138 면역자기 비드 분류와 FISH 또는 세포질 κ/λ 경쇄 면역글로불린과 FISH 테스트(cIg-FISH)의 조합은 수많은 실험 비용을 증가시키고 시간이 많이 걸립니다.
보통, PC 비율은 염색된 BM 도말 또는 BM 생검 섹션7,8의 형태학적 검사로부터 먼저 평가된다. 최고 품질의 BM 표본 (첫 번째 골수 흡인물 샘플)은 형태 학적 테스트에 사용되는 반면, FISH 또는 기타 검출을 위해 보내진 샘플은 종종 말초 혈액으로 희석 비율이 높은 보조 흡인물 샘플입니다.
1990년대 초, 여러 연구에 따르면 BM 도말들은 간질성 FISH 검사에 직접 사용될 수 있으며, 이는 신뢰할 수 있고 반복 가능한 방법인 것으로 입증되었습니다9. 말초 혈액 및 BM 도말의 FISH와 결합 된 세포 형태학 및 에스테라제 세포 화학에 기초한 우아한 연구는 과립 및 림프구성 백혈병 환자의 염색체 이상을 밝히는 데 큰 임상 적 중요성을 확인했습니다10.
본원에서, 우리는 MM 환자에서 상간 FISH 검출의 성공을 개선하기 위한 신규한 방법을 제공한다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>automatic FISH machine</td>
			<td>Leica&#160; Corporation</td>
			<td>S500-24</td>
			<td>FINAL Assy Thermobrite 240V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Abbott Molecular Inc.</td>
			<td>06J49-001</td>
			<td>DAPI Counterstain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FISH Analysis Software</td>
			<td>IMSTAR&#160; Corporation</td>
			<td>IMSTAR</td>
			<td>FISH Analysis Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FISH Probe</td>
			<td>Abbott Molecular Inc.</td>
			<td>05N56-020</td>
			<td>Vysis Locus Specifc Identifer TP53 / CEP 17 FISH Probe Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed volume pipette</td>
			<td>Eppendorf China Ltd.</td>
			<td>M33768H</td>
			<td>10&#160; microliter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope</td>
			<td>Olympus Corporation</td>
			<td>BX53</td>
			<td>Forward Fluorescence Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Karyotype Analysis Software</td>
			<td>IMSTAR&#160; Corporation</td>
			<td>IMSTAR</td>
			<td>Karyotype Analysis Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Microscope</td>
			<td>Olympus&#160; Corporation</td>
			<td>BX41</td>
			<td>Forward Light Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Abbott Molecular Inc.</td>
			<td>07J05-001</td>
			<td>NP-40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic staining dyeing rack</td>
			<td>Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd.</td>
			<td>RSJ-501</td>
			<td>&#160;24 slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic staining dyeing tank</td>
			<td>Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd.</td>
			<td>RSJ-516</td>
			<td>&#160;24 slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber Cement</td>
			<td>Marabu&#160;GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>FixoGum&#160;</td>
			<td>Rubber Cement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSC</td>
			<td>Abbott Molecular Inc.</td>
			<td>02J10-032</td>
			<td>20&#215;SSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Shanghai Boxun Medical Bio-Instrument Co., Ltd.</td>
			<td>DK-8D</td>
			<td>Multiple Temperature Water bath</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

interphase fluorescence in situ hybridization of bone marrow smears of multiple myeloma

형광 계내 혼성화 (FISH) 검출은 가장 흔한 혈액학적 악성 종양 중 하나인 다발성 골수종 (MM)의 유전 적 위험 계층화에 없어서는 안될 방법입니다. MM의 식별 특성은 골수에 악성 혈장 세포가 축적되어 있다는 것이다. MM에 대한 FISH 보고서는 항-CD138 자기 비드로 분류하거나 세포질 면역 글로불린 경쇄 κ 또는 λ로 마킹함으로써 모든 유핵 세포보다는 정제되거나 확인된 클론 혈장 세포에 주로 초점을 맞춥니다. 골수 간 상 핵은 일반적으로 신선한 골수 세포로부터 얻어집니다. 그러나, 혈장 세포 표본의 만족스러운 농축은 다량의 신선한 헤파린 항응고 골수를 필요로 하며, 이는 어려운 골수 추출 또는 골수 건조 탭의 경우에는 얻을 수 없다. 여기에서, 우리는 염색 또는 염색되지 않은 골수 도말에 대한 FISH 검출의 성공을 개선하기 위한 새로운 방법을 확립한다. 골수 얼룩은 항응고 된 골수 표본보다 쉽게 얻을 수 있습니다.

새로 진단된 MM 환자의 초기 형태학적 평가에서, BM 도말에서 PC의 15%는 정상 PC보다 더 많은 양의 세포질과 함께 더 크고 어두운 핵을 갖는 것으로 밝혀졌다(도 2A). 면역표현형 기술에 의해 검출된 헤파린 항응고된 BM의 첫 번째 튜브는 모노클로날 비정상적 PC의 2.3%만을 밝혀냈다. FISH 또는 cIg-FISH 기술과 조합된 CD138 면역자기 비드 분류는 정확한 FISH 결과를 얻기 위해 필수적이?...

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Interphase Fluorescence in situ Hybridization of Bone Marrow Smears of Multiple Myeloma

여기에서, 우리는 다발성 골수종 환자로부터의 골수 도말에 대한 계내 혼성화 검출에서 위상간 형광의 성공을 개선하기 위한 프로토콜을 제시한다.

다발성 골수종의 골수 얼룩의 계내 형광 혼성화

Fluorescence in situ hybridization (FISH) detection is an indispensable method in genetic risk stratification in multiple myeloma (MM), which is one of ...

다발성 골수종에서 유전 적 위험 계층화에 FISH라고 불리는 Situ Hybridization의 형광 적용은 필수적입니다. FISH 보고서의 중요한 부분은 모든 유핵세포가 아니라 항-CD138 마그네틱 비드로 분류하거나 세포질 카파 또는 람다 경쇄 면역글로불린으로 마킹하여 cIg FISH라고 불리는 FISH 테스트를 통해 특이적으로 정제되거나 확인된 클론 혈장 세포입니다. 혈장 세포 분류 후 상간 FISH 또는 cIg FISH는 골수에서 혈장 세포의 상대적으로 낮은 비율로 인해 다발성 골수종의 진단에 중요한 것으로 밝혀졌습니다.그러나 이러한 방법에는 복잡한 공정, 높은 시편 요구 및 높은 실험 비용을 포함한 몇 가지 단점이 있습니다. 혈장 세포는 골수 얼룩에 신속하게 위치 할 수 있습니다. 이를 바탕으로 우리는 다발성 골수종 세포의 검출을 위해 골수 도말 FISH를 사용합니다.이 연구는 헬싱키 선언의 원칙에 따라 수행되었으며 우한 대학의 중난 병원 윤리위원회의 승인을 받았습니다. 표본은 중국 우한 대학의 중난 병원 혈액학과의 다발성 골수종 환자로부터 수집되었다. 첫 번째 0.2 밀리리터의 골수 용액을 깨끗한 일회용 유리 슬라이드에 놓고 골수를 신속하게 제거하여 골수 얼룩을 균일 한 두께와 날카로운 꼬리로 퍼뜨린 다음 자연스럽게 말립니다.골수 필름을 실온에서 약 10 초 동안 Wright-Giemsa 용액 1 밀리리터로 덮으십시오. 한 밀리리터의 인산염 완충액을 슬라이드에 첨가하면, 염료 용액이 건조되거나 슬라이드에서 흘러내리는 것을 방지하기 위해 주의가 요구되었다. 염료 용액을 부드럽게 혼합하고 실온에서 15 분 동안 유지하십시오.슬라이드를 깨끗한 물로 헹구고 실온에서 공기 중에서 건조시킵니다. 순방향 광 현미경을 사용하여 악성 혈장 세포를 감지하면 혈장 세포가 잘 분산되어야합니다. 이제 우리가 현장에서 보는 것은 상당히 분산 된 혈장 세포입니다.이것은 전형적인 이중 핵 혈장 세포입니다. 혼성화 된 영역을 10 분 동안 고정 용액으로 덮어 혈장 세포를 변색시키고 고정시킵니다. 슬라이드를 탈이온수로 헹구고 실온에서 공기 중에서 건조시킵니다.두 번 SSC 버퍼가 들어있는 항아리를 수조에서 섭씨 56도까지 예열하십시오. 제조된 골수 도말기를 예열된 SSC 완충액에서 두 번 10분 동안 세척한 다음, 실온에서 탈이온수에 침지시킨다. 에탄올 구배에 도말기를 각각 70%85%와 100%에탄올로 1분 동안 탈수시킨다.얼룩을 공기 중에 10 분 동안 말립니다. 먼저 17번 염색체 프로브 혼합물의 센트로미어에 TP53을 하이브리디제이션 영역에 추가하고 커버 슬립 프레스로 미세한 뾰족한 핀셋으로 부드럽게 덮어 아래에서 기포를 제거합니다. 커버 슬립의 모든면을 고무 시멘트로 밀봉하여 우수한 견고성을 보장합니다.고무 시멘트를 응고시킨 후 슬라이드를 자동 FISH 기계에 올려 놓고 5분 동안 섭씨 78도에서 변성을 수행한 후 섭씨 37도에서 하룻밤 사이에 혼성화를 수행하였다. FISH 기계에서 슬라이드를 가져옵니다. 미세한 뾰족한 핀셋을 사용하여 고무 시멘트를 부드럽게 제거하십시오.슬라이드를 실온에서 SSC에 두 번 담그고 약 한 분 또는 두 분 동안 커버 슬립을 세척합니다. 슬라이드를 섭씨 68도 예열 완충액으로 수조에서 두 분 동안 세척하십시오. 슬라이드를 섭씨 37도 수조에서 두 번 SSC로 한 분 동안 씻으십시오.어둠 속에서 바로 설치하여 혼성화 된 부위에 10 마이크로 리터의 DAPI에서 10 분 동안 완전히 건조시키고 커버 슬립으로 덮으십시오. 형광 현미경 상에 적합한 필터 세트를 사용하여 혼성화 슬라이드를 보고, 단색 청색 형광단 광학 필터를 사용하여 세포 핵의 형광 강도를 관찰한다. DAPI 필터 세트에서 세포 핵 이미지를 촬영합니다.CEP17은 녹색 형광으로 표지되었다. 스펙트럼 녹색 형광단 광학 필터를 사용하여 CEP17의 위치를 관찰하십시오. CEP17 신호 이미지를 녹색 필터 세트에서 가져옵니다.TP53 유전자를 주황색 형광으로 표지하였다. 스펙트럼 오렌지 형광단 광학 필터를 사용하여 TP53을 관찰하고, TP53 신호 이미지를 세트 아래에서 촬영하고,이 세 이미지를 전체로 병합하고 수치 이상을 검사하십시오. 정상 간상 세포에서 두 개의 주황색 및 두 개의 녹색 신호가 핵 내부에서 관찰되고 청색 형광은 한 쌍의 정상 염색체 17을 나타낸다.결과는 다발성 골수종 환자에서 골수의 형태학 및 유전학을 보여주었다. 그림 A는 골수 도말에서 혈장 세포의 15 %가 정상보다 많은 양의 세포질과 함께 더 크고 어둡고 핵을 갖는 것으로 나타났습니다. 도 B는 골수 번짐에서 유핵혈장 세포를 대표하여 대표적인 그레이스케일 이미지를 나타내었다.그림 C는 혈장 세포의 한 상간 핵에서 네 개의 주황색과 네 개의 녹색 신호를 보여 주었으며, 이는 염색체 17의 네 사본이 핵에 국한되어 있음을 시사한다. 도 D는 이 환자의 비정상적인 염색체 핵조영이 하나의 핵에서 두 쌍의 염색체 17을 확인한 것을 보여주었다. 골수 얼룩은 항응고제 골수 표본보다 훨씬 쉽게 얻을 수 있는데, 항응고 골수를 얻기 위해서는 핵을 얻기 위한 복잡한 절차가 필요하기 때문입니다.따라서, 우리는 다발성 골수종 세포의 검출을 위해 골수 도말 FISH에 대한 설득력있는 방법을 확립했습니다.

Research

JoVE Journal

Medicine

Interphase Fluorescence in situ Hybridization of Bone Marrow Smears of Multiple Myeloma

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형광에 원위치 하이브리드화 및 공촛점 레이저 스캐닝 현미경에 의해 맛이 좋은 확장기의 사정 Biofilm 분석

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연구

의학

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