Name: interphase fluorescence in situ hybridization of bone marrow smears of multiple myeloma
Uploaded: 2022-04-15T14:00:00
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Este projeto foi apoiado pelo Fundo de Inovação da WNLO 2018WNLOKF023.

Este estudo foi conduzido de acordo com os princípios da Declaração de Helsinque e aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital Zhongnan da Universidade de Wuhan (No. 2019065). Os espécimes foram coletados de um paciente mm no Departamento de Hematologia do Hospital Zhongnan da Universidade de Wuhan (China).
1. Preparação das manchas de BM
<ol><li>Coloque os primeiros 0,2 mL de solução BM em um slide de vidro descartável limpo.</li>
	<li>Espalhe as manchas de BM para...

<ol>
	<li>Sonneveld, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+multiple+myeloma+with+high-risk+cytogenetics:+a+consensus+of+the+International+Myeloma+Working+Group.">Treatment of multiple myeloma with high-risk cytogenetics: a consensus of the International Myeloma Working Group.</a> Blood. 127, 2955-2962 (2016).</li><li>Radbruch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competence+and+competition:+the+challenge+of+becoming+a+long-lived+plasma+cell.">Competence and competition: the challenge of becoming a long-lived plasma cell.</a> Nature Reviews Immunology. 6, 741-750 (2006).</li><li>Lai, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+cytogenetics+in+multiple+myeloma:+a+study+of+151+patients+including+117+patients+at+diagnosis.">Improved cytogenetics in multiple myeloma: a study of 151 patients including 117 patients at diagnosis.</a> Blood. 85 (9), 2490-2497 (1995).</li><li>Hallek, M., Bergsagel, P. L., Anderson, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+myeloma:+increasing+evidence+for+a+multistep+transformation+process.">Multiple myeloma: increasing evidence for a multistep transformation process.</a> Blood. 91, 3-21 (1998).</li><li>Munsh, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+recommendations+for+risk+stratification+in+multiple+myeloma:+report+of+the+International+Myeloma+Workshop+Consensus+Panel+2.">Consensus recommendations for risk stratification in multiple myeloma: report of the International Myeloma Workshop Consensus Panel 2.</a> Blood. 117, 4696-4700 (2011).</li><li>Gole, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cIg-FISH+On+Patients+with+Multiple+Myeloma+-+A+Modified+and+Simple+Technique+Easily+Incorporated+Into+Routine+Clinical+Service.">cIg-FISH On Patients with Multiple Myeloma - A Modified and Simple Technique Easily Incorporated Into Routine Clinical Service.</a> Blood. 120, 4792-4792 (2012).</li><li>Lee, S. H., Erber, W., Porwit, A., Tomonaga, M., Peterson, L. I. C. S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematology,+ICSH+guidelines+for+the+standardization+of+bone+marrow+specimens+and+reports.">Hematology, ICSH guidelines for the standardization of bone marrow specimens and reports.</a> International Journal of Laboratory Hematology. 30, 349-364 (2008).</li><li>&#352;tifter, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+evaluation+of+bone+marrow+aspirate+and+biopsy+is+superior+in+the+prognosis+of+multiple+myeloma.">Combined evaluation of bone marrow aspirate and biopsy is superior in the prognosis of multiple myeloma.</a> Diagnostic Pathology. 5, 30 (2010).</li><li>Huegel, A., Coyle, L., McNeil, R., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+interphase+fluorescence+in+situ+hybridization+on+direct+hematological+bone+marrow+smears.">Evaluation of interphase fluorescence in situ hybridization on direct hematological bone marrow smears.</a> Pathology. 27, 86-90 (1995).</li><li>Jacobsson, B., Bernell, P., Arvidsson, I., Hast, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classical+morphology,+esterase+cytochemistry,+and+interphase+cytogenetics+of+peripheral+blood+and+bone+marrow+smears.">Classical morphology, esterase cytochemistry, and interphase cytogenetics of peripheral blood and bone marrow smears.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 44, 1303-1309 (1996).</li><li>Dunning, K., Safo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ultimate+Wright-Giemsa+stain:+60+years+in+the+making.">The ultimate Wright-Giemsa stain: 60 years in the making.</a> Biotechnic &amp; Histochemistry. 86, 69-75 (2011).</li><li>Woronzoff-Dashkoff, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+wright-giemsa+stain.+Secrets+revealed.">The wright-giemsa stain. Secrets revealed.</a> Clinics in Laboratory Medicine. 22, 15-23 (2002).</li><li>McPherson, R. A., Pincus, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Henry's+Clinical+diagnosis+and+Management+by+Laboratory+Methods+E-book.">Henry's Clinical diagnosis and Management by Laboratory Methods E-book.</a> Elsevier Health Sciences. , (2017).</li><li>Ross, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Report+from+the+European+Myeloma+Network+on+interphase+FISH+in+multiple+myeloma+and+related+disorders.">Report from the European Myeloma Network on interphase FISH in multiple myeloma and related disorders.</a> Haematologica. 97, 1272-1277 (2012).</li></ol>

A aplicação de PEIXEs à estratificação de risco genético em MM é essencial. A parte crítica dos relatórios fish não são todas as células nucleadas, mas os PCs clonais especificamente purificados ou identificados por classificação com contas magnéticas anti-CD138 ou marcação com cadeia de luz de imunoglobulina citoplasmática κ ou λ. Peixes interfásicos após a classificação do PC ou cIg-FISH foram considerados significativos no diagnóstico de MM devido à proporção relativamente menor de PCs no B...

O mieloma múltiplo (MM) é uma doença maligna de células plasmáticas (PC) com forte heterogeneidade biológica e grandes diferenças individuais na eficácia clínica, com períodos de sobrevivência que variam de meses a décadas. Características citogenéticas são indicadores prognósticos importantes da MM. O sistema de estratificação de risco e os tratamentos individualizados baseados em características genéticas tornaram-se temas de intenso interesse em pesquisas clínicas sobre MM1. As aberrações de PCs testados em fluorescência no painel de hibridização situ (FISH) da medula óssea (BM) incluem del 13q14 (RB1), del 17p13 (TP53), t(4;14) (IGH/FGFR3), t(11;14) (IGH/MYEOV), t(14;16) (IGH/MAF), t(14:20) (IGH/MAFB), 1q21 (CKS1B) de ganho/amplificação e exclusão de 1p (CDKN2C).
A citogenética metafase padrão deve ser incluída na avaliação inicial dos pacientes com MM. Embora o karyotipping convencional de banda G ofereça o benefício de uma análise de cromossomo inteiro, o baixo rendimento deste método leva a muitos resultados falsos negativos2. Tradicionalmente, os PCs têm sido vistos como em grande parte incapazes de se dividir porque são os produtos em estágio final da diferenciação de linfócitos B. Isso dificulta a obtenção de imagens divididas. A análise citogenética aprimorada em MM com culturas de longo prazo (6 dias) e estimulação de culturas por citocinas pode ser um método promissor para identificar anormalidades citogenéticas em pacientes recém-diagnosticados em MM3. Mesmo quando o tempo de cultura foi prolongado para 6 dias, no entanto, anormalidades citogenéticas foram relatadas com precisão em 30%-50% dos pacientes com MM4. Além disso, a MM é caracterizada por complexas aberrações citogenéticas que refletem sua heterogeneidade prognóstica. No entanto, a resolução da tecnologia tradicional de banda cromossomo é baixa, o que pode facilmente levar à detecção perdida de anormalidades cromossômicas em MM.
O PEIXE interfásico, preferencialmente após a classificação ou marcação de PC baseado em contas magnéticas cd138 positivos com cadeia de luz de imunoglobulina citoplasmática κ/λ, é indispensável na análise de MM5,6. Uma amostra selecionada com CD138 positivo é fortemente recomendada para o rendimento otimizado das células tumorais. No entanto, a quantitação precisa de aberrações citogenéticas requer pelo menos 4 mL de BM anticoagulado para classificação de PC. Além disso, as combinações de classificação de contas imunomagnéticas CD138 com mímulas citoplasmáticas de cadeia luminosa com teste de PEIXE (cIg-FISH) aumentam inúmeros custos experimentais e são demoradas.
Normalmente, a razão do PC é primeiramente avaliada a partir do exame morfológico de manchas manchadas de BM ou seções de biópsia BM7,8. Amostras de BM da mais alta qualidade (primeiras amostras de aspiração de medula) são utilizadas para testes morfológicos, enquanto aquelas enviadas para FISH ou outra detecção são muitas vezes as amostras secundárias aspiradas com altas proporções de diluição com sangue periférico.
Já na década de 1990, vários estudos mostraram que as manchas de MMC podem ser usadas diretamente para exames intersticiais de PEIXEs, o que provou ser um método confiável e repetível9. Um estudo elegante baseado na morfologia celular e citoquímica esterase combinado com peixes de sangue periférico e manchas de BM confirmou sua grande significância clínica para elucidar anormalidades cromossômicas em pacientes com leucemia granulócítica e linfocítica10.
Aqui, fornecemos um novo método para melhorar o sucesso da detecção de peixes interfasos em pacientes mm.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>automatic FISH machine</td>
			<td>Leica&#160; Corporation</td>
			<td>S500-24</td>
			<td>FINAL Assy Thermobrite 240V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Abbott Molecular Inc.</td>
			<td>06J49-001</td>
			<td>DAPI Counterstain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FISH Analysis Software</td>
			<td>IMSTAR&#160; Corporation</td>
			<td>IMSTAR</td>
			<td>FISH Analysis Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FISH Probe</td>
			<td>Abbott Molecular Inc.</td>
			<td>05N56-020</td>
			<td>Vysis Locus Specifc Identifer TP53 / CEP 17 FISH Probe Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed volume pipette</td>
			<td>Eppendorf China Ltd.</td>
			<td>M33768H</td>
			<td>10&#160; microliter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope</td>
			<td>Olympus Corporation</td>
			<td>BX53</td>
			<td>Forward Fluorescence Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Karyotype Analysis Software</td>
			<td>IMSTAR&#160; Corporation</td>
			<td>IMSTAR</td>
			<td>Karyotype Analysis Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Microscope</td>
			<td>Olympus&#160; Corporation</td>
			<td>BX41</td>
			<td>Forward Light Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Abbott Molecular Inc.</td>
			<td>07J05-001</td>
			<td>NP-40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic staining dyeing rack</td>
			<td>Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd.</td>
			<td>RSJ-501</td>
			<td>&#160;24 slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic staining dyeing tank</td>
			<td>Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd.</td>
			<td>RSJ-516</td>
			<td>&#160;24 slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber Cement</td>
			<td>Marabu&#160;GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>FixoGum&#160;</td>
			<td>Rubber Cement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSC</td>
			<td>Abbott Molecular Inc.</td>
			<td>02J10-032</td>
			<td>20&#215;SSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Shanghai Boxun Medical Bio-Instrument Co., Ltd.</td>
			<td>DK-8D</td>
			<td>Multiple Temperature Water bath</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

interphase fluorescence in situ hybridization of bone marrow smears of multiple myeloma

A fluorescência na detecção de hibridização situ (FISH) é um método indispensável na estratificação de risco genético em mieloma múltiplo (MM), que é uma das malignidades hematológicas mais comuns. A característica de identificação de MM são células plasmáticas malignas acumuladas na medula óssea. Os relatórios de PEIXEs para MM se concentram principalmente em células plasmáticas clonais purificadas ou identificadas, em vez de todas as células nucleadas, classificando-se com contas magnéticas anti-CD138 ou marcando com cadeia de luz de imunoglobulina citoplasmática κ ou λ. Os núcleos interfasos da medula óssea são geralmente obtidos a partir de células frescas da medula óssea. No entanto, o enriquecimento satisfatório das amostras de células plasmáticas requer grandes quantidades de medula óssea anticoagulada de heparina fresca, que não pode ser obtida no caso de difícil extração de medula óssea ou uma torneira seca de medula óssea. Aqui, estabelecemos um novo método para melhorar o sucesso da detecção de PEIXEs em manchas de medula óssea manchadas ou não manchadas. Manchas de medula óssea são mais fáceis de obter do que espécimes de medula óssea anticoagulados.

Na avaliação morfológica inicial de um paciente mm recém-diagnosticado, 15% dos PCs em uma mancha de BM foram encontrados com núcleos maiores e mais escuros, juntamente com quantidades maiores de citoplasma do que os PCs normais (Figura 2A). O primeiro tubo de BM anticoagulado de heparina detectado pela técnica do imunofenótipo revelou apenas 2,3% dos PCs aberrantes monoclonais. Cd138 de hidromassagem de contas imunomagnéticas em combinação com FISH ou a técnica cIg-FISH é essenc...

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Interphase Fluorescence in situ Hybridization of Bone Marrow Smears of Multiple Myeloma

Aqui, apresentamos um protocolo para melhorar o sucesso da fluorescência interfásico na detecção de hibridização in situ em manchas de medula óssea de múltiplos pacientes com mieloma.

Fluorescência interfásico in situ Hibridização de Manchas de Medula Óssea de Mieloma Múltiplo

Fluorescence in situ hybridization (FISH) detection is an indispensable method in genetic risk stratification in multiple myeloma (MM), which is one of ...

A aplicação da Fluorescência In Situ Hibridização chamada FISH à estratificação de risco genético em mieloma múltiplo é essencial. A parte crítica dos relatórios fish não são todas as células nucleadas, mas as células plasmáticas clonais especificamente purificadas ou identificadas por triagem com contas magnéticas anti-CD138 ou marcação com kappa citoplasmica ou imunoglobulina da cadeia de luz Lambda com teste de PEIXE chamado cIg FISH. Peixe interfáltico após a triagem de células plasmáticas ou cIg FISH acaba por ser significativo no diagnóstico de mieloma múltiplo, devido à proporção relativamente menor de células plasmáticas na medula óssea.No entanto, esses métodos têm algumas deficiências, incluindo processos complexos, altas demandas de espécimes e altos custos experimentais. As células plasmáticas podem ser rapidamente localizadas em uma mancha de medula óssea. Com base nisso, usamos peixes de difamação de medula óssea para a detecção de múltiplas células de mieloma.Este estudo foi conduzido de acordo com os princípios da Declaração de Helsinque e aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital Zhongnan da Universidade de Wuhan. Os espécimes foram coletados de um paciente de mieloma múltiplo no Departamento de Hematologia do Hospital Zhongnan da Universidade de Wuhan, na China. Coloque os primeiros 0,2 mililitros de solução de medula óssea em um deslizamento de vidro descartável limpo, espalhe as manchas de medula óssea para espessura uniforme e caudas afiadas, removendo rapidamente a medula óssea e depois seque-a naturalmente.Cubra os filmes de medula óssea com um mililitro da solução Wright-Giemsa por aproximadamente 10 segundos em temperatura ambiente. Adicione um mililitro de tampão fosfato aos slides, foi necessário cuidado para evitar que a solução de corante secasse ou fluísse dos slides. Misture a solução de corante suavemente e mantenha-a por 15 minutos em temperatura ambiente.Enxágüe os slides com água limpa e seque-a no ar à temperatura ambiente. Use microscopia de luz para a frente para detectar células plasmáticas malignas, as células plasmáticas devem estar bem dispersas. Agora o que vemos no campo são as células plasmáticas que estão bastante dispersas.Esta é uma típica célula de plasma nuclear binuclear. Cubra a área hibridizada com solução fixativa por 10 minutos para descolorir e fixar células plasmáticas. Enxágüe o escorregador com água desionizada e seque-a no ar à temperatura ambiente.Pré-aqueça um frasco contendo duas vezes o tampão SSC a 56 graus Celsius em um banho de água. Lave a mancha de medula óssea preparada no tampão pré-aquecido duas vezes SSC por 10 minutos seguido de mergulho em água deionizada à temperatura ambiente. Desidratar a mancha em um gradiente de etanol 70%85% e 100% etanol cada um por um minuto.Seque a mancha no ar por 10 minutos. Primeiro adicione TP53 no centromere da mistura de sonda cromossomo 17 à área de hibridização e cubra-a com um deslizamento de tampa pressione suavemente as pinças pontiagudas finas para remover bolhas de ar por baixo. Sele todos os lados da tampa com cimento de borracha para garantir um bom aperto.Após a solidificação do cimento de borracha, o slide foi colocado em uma máquina de peixe automática a desnaturação foi realizada a 78 graus Celsius por cinco minutos seguido de hibridização a 37 graus Celsius durante a noite. Pegue o slide da máquina FISH. Use uma pinça pontiaguda fina para remover o cimento de borracha suavemente.Mergulhe o slide em duas vezes O SSC à temperatura ambiente por aproximadamente um ou dois minutos para lavar a tampa. Lave o slide em 68 graus Celsius antes do dia-a-dia em um banho de água por dois minutos. Lave os slides com duas vezes SSC em um banho de água de 37 graus Celsius por um minuto.Coloque-o bem no escuro para secar completamente por 10 minutos a 10 microliter de DAPI até a área hibridizada, cubra com um deslizamento de cobertura. Veja o slide hibridizado usando um conjunto de filtro adequado em um microscópio de fluorescência, use filtro óptico fluorophore azul monocromático para observar a intensidade da fluorescência do núcleo celular. Tire imagens do núcleo celular sob um conjunto de filtro DAPI.O CEP17 foi rotulado com fluorescência verde. Use filtro óptico fluoróforo verde de espectro para observar a localização do CEP17. Pegue a imagem de sinais CEP17 em conjunto de filtro verde.O gene TP53 foi rotulado com fluorescência laranja. Use filtro óptico fluoróforo laranja de espectro para observar TP53, pegue sinais TP53 sob o conjunto, mescle essas três imagens em uma totalidade e examine para anormalidades numéricas. Em uma célula interfásico normal, dois sinais laranja e dois verdes são observados dentro de um núcleo com fluorescência azul indicando um par de cromossomos normais 17.Os resultados mostraram a morfologia e genética da medula óssea em um paciente com mieloma múltiplo. A Figura A mostrou que 15% das células plasmáticas em uma mancha de medula óssea foram encontradas com maiores e mais escuras e nucleares, juntamente com grandes quantidades de citoplasma do que o normal. A figura B mostrou uma imagem em escala cinza de representação por uma célula plasmática nucleada em uma mancha de medula óssea.A Figura C mostrou quatro sinais laranja e quatro verdes em um núcleo interfásico de células plasmáticas sugerindo que quatro cópias do cromossomo 17 foram localizadas em um núcleo. A Figura D mostrou que o karyograma de cromossomo anormal deste paciente confirmou dois pares de cromossomos 17 em um núcleo. As manchas de medula óssea são muito mais fáceis de obter do que as amostras de medula óssea anticoagulantes porque a obtenção de medula óssea anticoagulada requer procedimentos complexos para obter o núcleo.Assim, estabelecemos um método convincente para a detecção de múltiplas células de mieloma.

Research

JoVE Journal

Medicine

Interphase Fluorescence in situ Hybridization of Bone Marrow Smears of Multiple Myeloma

Oral Biofilm Analysis of Palatal Expanders by Fluorescence In-Situ Hybridization and Confocal Laser Scanning Microscopy

Análise de biofilme oral de Palatal Expansores por fluorescência de hibridização in situ e microscopia confocal a laser Scanning

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Medicina

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