Name: interphase fluorescence in situ hybridization of bone marrow smears of multiple myeloma
Uploaded: 2022-04-15T14:00:00
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Este proyecto fue apoyado por el Fondo de Innovación de WNLO 2018WNLOKF023.

Este estudio se realizó de acuerdo con los principios de la Declaración de Helsinki y fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital Zhongnan de la Universidad de Wuhan (No. 2019065). Los especímenes fueron recolectados de un paciente mm en el Departamento de Hematología del Hospital Zhongnan de la Universidad de Wuhan (China).
1. Preparación de los frotis de BM
<ol><li>Coloque los primeros 0,2 ml de solución de BM en un portaobjetos de vidrio desechable limpio.</l...

<ol>
	<li>Sonneveld, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+multiple+myeloma+with+high-risk+cytogenetics:+a+consensus+of+the+International+Myeloma+Working+Group.">Treatment of multiple myeloma with high-risk cytogenetics: a consensus of the International Myeloma Working Group.</a> Blood. 127, 2955-2962 (2016).</li><li>Radbruch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competence+and+competition:+the+challenge+of+becoming+a+long-lived+plasma+cell.">Competence and competition: the challenge of becoming a long-lived plasma cell.</a> Nature Reviews Immunology. 6, 741-750 (2006).</li><li>Lai, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+cytogenetics+in+multiple+myeloma:+a+study+of+151+patients+including+117+patients+at+diagnosis.">Improved cytogenetics in multiple myeloma: a study of 151 patients including 117 patients at diagnosis.</a> Blood. 85 (9), 2490-2497 (1995).</li><li>Hallek, M., Bergsagel, P. L., Anderson, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+myeloma:+increasing+evidence+for+a+multistep+transformation+process.">Multiple myeloma: increasing evidence for a multistep transformation process.</a> Blood. 91, 3-21 (1998).</li><li>Munsh, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+recommendations+for+risk+stratification+in+multiple+myeloma:+report+of+the+International+Myeloma+Workshop+Consensus+Panel+2.">Consensus recommendations for risk stratification in multiple myeloma: report of the International Myeloma Workshop Consensus Panel 2.</a> Blood. 117, 4696-4700 (2011).</li><li>Gole, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cIg-FISH+On+Patients+with+Multiple+Myeloma+-+A+Modified+and+Simple+Technique+Easily+Incorporated+Into+Routine+Clinical+Service.">cIg-FISH On Patients with Multiple Myeloma - A Modified and Simple Technique Easily Incorporated Into Routine Clinical Service.</a> Blood. 120, 4792-4792 (2012).</li><li>Lee, S. H., Erber, W., Porwit, A., Tomonaga, M., Peterson, L. I. C. S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematology,+ICSH+guidelines+for+the+standardization+of+bone+marrow+specimens+and+reports.">Hematology, ICSH guidelines for the standardization of bone marrow specimens and reports.</a> International Journal of Laboratory Hematology. 30, 349-364 (2008).</li><li>&#352;tifter, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+evaluation+of+bone+marrow+aspirate+and+biopsy+is+superior+in+the+prognosis+of+multiple+myeloma.">Combined evaluation of bone marrow aspirate and biopsy is superior in the prognosis of multiple myeloma.</a> Diagnostic Pathology. 5, 30 (2010).</li><li>Huegel, A., Coyle, L., McNeil, R., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+interphase+fluorescence+in+situ+hybridization+on+direct+hematological+bone+marrow+smears.">Evaluation of interphase fluorescence in situ hybridization on direct hematological bone marrow smears.</a> Pathology. 27, 86-90 (1995).</li><li>Jacobsson, B., Bernell, P., Arvidsson, I., Hast, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classical+morphology,+esterase+cytochemistry,+and+interphase+cytogenetics+of+peripheral+blood+and+bone+marrow+smears.">Classical morphology, esterase cytochemistry, and interphase cytogenetics of peripheral blood and bone marrow smears.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 44, 1303-1309 (1996).</li><li>Dunning, K., Safo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ultimate+Wright-Giemsa+stain:+60+years+in+the+making.">The ultimate Wright-Giemsa stain: 60 years in the making.</a> Biotechnic &amp; Histochemistry. 86, 69-75 (2011).</li><li>Woronzoff-Dashkoff, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+wright-giemsa+stain.+Secrets+revealed.">The wright-giemsa stain. Secrets revealed.</a> Clinics in Laboratory Medicine. 22, 15-23 (2002).</li><li>McPherson, R. A., Pincus, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Henry's+Clinical+diagnosis+and+Management+by+Laboratory+Methods+E-book.">Henry's Clinical diagnosis and Management by Laboratory Methods E-book.</a> Elsevier Health Sciences. , (2017).</li><li>Ross, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Report+from+the+European+Myeloma+Network+on+interphase+FISH+in+multiple+myeloma+and+related+disorders.">Report from the European Myeloma Network on interphase FISH in multiple myeloma and related disorders.</a> Haematologica. 97, 1272-1277 (2012).</li></ol>

La aplicación de FISH a la estratificación del riesgo genético en MM es esencial. La parte crítica de los informes fish no son todas las células nucleadas, sino los PC clonales específicamente purificados o identificados mediante la clasificación con perlas magnéticas anti-CD138 o el marcado con inmunoglobulina citoplasmática de cadena ligera κ o λ. Se encontró que la interfase FISH después de la clasificación de PC o cIg-FISH era significativa en el diagnóstico de MM debido a la proporción relativamente ...

El mieloma múltiple (MM) es una enfermedad maligna de células plasmáticas (PC) con una fuerte heterogeneidad biológica y grandes diferencias individuales en la eficacia clínica, con períodos de supervivencia que van desde meses hasta décadas. Las características citogenéticas son importantes indicadores pronósticos de la MM. El sistema de estratificación del riesgo y los tratamientos individualizados basados en características genéticas se han convertido en temas de intenso interés en la investigación clínica sobre MM1. Las aberraciones de los PC probados en un panel de hibridación fluorescente in situ (FISH) de médula ósea (BM) incluyen del 13q14 (RB1), del 17p13 (TP53), t(4;14) (IGH/FGFR3), t(11;14) (IGH/MYEOV), t(14;16) (IGH/MAF), t(14:20) (IGH/MAFB), 1q21 (CKS1B) ganancia/amplificación y deleción 1p (CDKN2C).
La citogenética metafásica estándar debe incluirse en la evaluación inicial de los pacientes con MM. Aunque el cariotipo convencional con banda G ofrece el beneficio de un análisis cromosómico completo, el bajo rendimiento de este método conduce a muchos resultados falsos negativos2. Tradicionalmente, las PC han sido vistas como en gran medida incapaces de dividirse porque son los productos de la etapa final de la diferenciación de linfocitos B. Esto dificulta la obtención de imágenes divididas. La mejora del análisis citogenético en MM con cultivos a largo plazo (6 días) y la estimulación de cultivos por citoquinas pueden ser un método prometedor para identificar anomalías citogenéticas en pacientes con MM recién diagnosticados3. Sin embargo, incluso cuando el tiempo de cultivo se prolongó a 6 días, las anomalías citogenéticas se informaron con precisión en el 30%-50% de los pacientes con MM4. Además, la MM se caracteriza por aberraciones citogenéticas complejas que reflejan su heterogeneidad pronóstica. Sin embargo, la resolución de la tecnología tradicional de bandas cromosómicas es baja, lo que puede conducir fácilmente a la detección errónea de anomalías cromosómicas en MM.
La interfase FISH, preferiblemente después de la clasificación o marcado de PC basada en perlas magnéticas CD138 positivas con cadena ligera de inmunoglobulina citoplasmática κ/λ, es indispensable en el análisis de MM5,6. Se recomienda encarecidamente una muestra seleccionada CD138 positiva para el rendimiento optimizado de las células tumorales. Sin embargo, la cuantificación precisa de las aberraciones citogenéticas requiere al menos 4 ml de BM anticoagulado para la clasificación de PC. Además, las combinaciones de clasificación de perlas inmunomagnéticas CD138 con FISH o inmunoglobulina de cadena ligera citoplasmática κ/λ con pruebas FISH (cIg-FISH) aumentan numerosos costos experimentales y consumen mucho tiempo.
Por lo general, la relación de PC se evalúa primero a partir del examen morfológico de frotis de BM teñido o secciones de biopsia de BM7,8. Las muestras BM de la más alta calidad (primeras muestras de aspirado de médula) se utilizan para pruebas morfológicas, mientras que las enviadas para FISH u otra detección son a menudo las muestras de aspirado secundario con altas proporciones de dilución con sangre periférica.
Ya en la década de 1990, múltiples estudios demostraron que los frotis de BM se pueden usar directamente para los exámenes intersticiales de FISH, lo que ha demostrado ser un método confiable y repetible9. Un elegante estudio basado en la morfología celular y la citoquímica de la esterasa combinado con FISH de sangre periférica y frotis de BM confirmó su gran importancia clínica para dilucidar anomalías cromosómicas en pacientes con leucemia granulocítica y linfocítica10.
Aquí, proporcionamos un método novedoso para mejorar el éxito de la detección de FISH interfásico en pacientes con MM.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>automatic FISH machine</td>
			<td>Leica&#160; Corporation</td>
			<td>S500-24</td>
			<td>FINAL Assy Thermobrite 240V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Abbott Molecular Inc.</td>
			<td>06J49-001</td>
			<td>DAPI Counterstain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FISH Analysis Software</td>
			<td>IMSTAR&#160; Corporation</td>
			<td>IMSTAR</td>
			<td>FISH Analysis Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FISH Probe</td>
			<td>Abbott Molecular Inc.</td>
			<td>05N56-020</td>
			<td>Vysis Locus Specifc Identifer TP53 / CEP 17 FISH Probe Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed volume pipette</td>
			<td>Eppendorf China Ltd.</td>
			<td>M33768H</td>
			<td>10&#160; microliter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope</td>
			<td>Olympus Corporation</td>
			<td>BX53</td>
			<td>Forward Fluorescence Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Karyotype Analysis Software</td>
			<td>IMSTAR&#160; Corporation</td>
			<td>IMSTAR</td>
			<td>Karyotype Analysis Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Microscope</td>
			<td>Olympus&#160; Corporation</td>
			<td>BX41</td>
			<td>Forward Light Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Abbott Molecular Inc.</td>
			<td>07J05-001</td>
			<td>NP-40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic staining dyeing rack</td>
			<td>Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd.</td>
			<td>RSJ-501</td>
			<td>&#160;24 slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic staining dyeing tank</td>
			<td>Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd.</td>
			<td>RSJ-516</td>
			<td>&#160;24 slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber Cement</td>
			<td>Marabu&#160;GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>FixoGum&#160;</td>
			<td>Rubber Cement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSC</td>
			<td>Abbott Molecular Inc.</td>
			<td>02J10-032</td>
			<td>20&#215;SSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Shanghai Boxun Medical Bio-Instrument Co., Ltd.</td>
			<td>DK-8D</td>
			<td>Multiple Temperature Water bath</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

interphase fluorescence in situ hybridization of bone marrow smears of multiple myeloma

La detección de hibridación fluorescente in situ (FISH) es un método indispensable en la estratificación del riesgo genético en el mieloma múltiple (MM), que es una de las neoplasias hematológicas malignas más comunes. La característica identificativa de MM son las células plasmáticas malignas acumuladas en la médula ósea. Los informes FISH para MM se centran principalmente en células plasmáticas clonales purificadas o identificadas, en lugar de todas las células nucleadas, mediante la clasificación con perlas magnéticas anti-CD138 o el marcado con cadena ligera de inmunoglobulina citoplasmática κ o λ. Los núcleos de interfase de la médula ósea generalmente se obtienen de células frescas de la médula ósea. Sin embargo, el enriquecimiento satisfactorio de las muestras de células plasmáticas requiere grandes cantidades de médula ósea fresca anticoagulada con heparina, que no se puede obtener en el caso de una extracción difícil de la médula ósea o un grifo seco de médula ósea. Aquí, establecemos un método novedoso para mejorar el éxito de la detección de FISH en frotis de médula ósea teñidos o no manchados. Los frotis de médula ósea son más fáciles de obtener que las muestras de médula ósea anticoaguladas.

En la evaluación morfológica inicial de un paciente MM recién diagnosticado, se encontró que el 15% de los PC en un frotis de BM tenían núcleos más grandes y oscuros junto con mayores cantidades de citoplasma que los PC normales (Figura 2A). El primer tubo de BM anticoagulante de heparina detectado por la técnica del inmunofenotipo reveló solo el 2,3% de los PC aberrantes monoclonales. La clasificación inmunomagnética de perlas CD138 en combinación con FISH o la técnica cIg-FISH...

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Interphase Fluorescence in situ Hybridization of Bone Marrow Smears of Multiple Myeloma

Aquí, presentamos un protocolo para mejorar el éxito de la detección de hibridación de fluorescencia in situ interfásica en frotis de médula ósea de pacientes con mieloma múltiple.

Hibridación de fluorescencia in situ interfásica de frotis de médula ósea de mieloma múltiple

Fluorescence in situ hybridization (FISH) detection is an indispensable method in genetic risk stratification in multiple myeloma (MM), which is one of ...

La aplicación de la Hibridación Fluorescente In Situ llamada FISH a la estratificación del riesgo genético en el mieloma múltiple es esencial. La parte crítica de los informes fish no son todas las células nucleadas, sino las células plasmáticas clonales específicamente purificadas o identificadas mediante la clasificación con perlas magnéticas anti-CD138 o el marcado con kappa citoplasmático o inmunoglobulina de cadena ligera Lambda con pruebas FISH llamadas cIg FISH. La interfase FISH después de la clasificación de células plasmáticas o cIg FISH resulta ser significativa en el diagnóstico de mieloma múltiple, debido a la proporción relativamente menor de células plasmáticas en la médula ósea.Sin embargo, estos métodos tienen algunas deficiencias, incluidos procesos complejos, altas demandas de muestras y altos costos experimentales. Las células plasmáticas se pueden localizar rápidamente en un frotis de médula ósea. En base a esto, utilizamos el frotis de médula ósea FISH para la detección de células de mieloma múltiple.Este estudio se realizó de acuerdo con los principios de la Declaración de Helsinki y fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital Zhongnan de la Universidad de Wuhan. Los especímenes fueron recolectados de un paciente con mieloma múltiple en el Departamento de Hematología del Hospital Zhongnan de la Universidad de Wuhan de China. Coloque los primeros 0,2 mililitros de solución de médula ósea en un portaobjetos de vidrio desechable limpio, extienda los frotis de médula ósea a un grosor uniforme y colas afiladas retirando rápidamente la médula ósea y luego séquela naturalmente.Cubra las películas de médula ósea con un mililitro de solución de Wright-Giemsa durante aproximadamente 10 segundos a temperatura ambiente. Agregue un mililitro de tampón de fosfato a las diapositivas, se requirió cuidado para evitar que la solución de tinte se seque o fluya fuera de las diapositivas. Mezcle la solución de tinte suavemente y manténgala durante 15 minutos a temperatura ambiente.Enjuague los toboganes con agua limpia y séquelos en el aire a temperatura ambiente. Use microscopía de luz hacia adelante para detectar células plasmáticas malignas, las células plasmáticas deben estar bien dispersas. Ahora lo que vemos en el campo son las células plasmáticas que están bastante dispersas.Esta es una célula de plasma nuclear binuclear típica. Cubra el área hibridada con solución fijadora durante 10 minutos para decolorar y fijar las células plasmáticas. Enjuague el portaobjetos con agua desionizada y séquelo al aire a temperatura ambiente.Precaliente un frasco que contenga dos veces el tampón SSC a 56 grados Celsius en un baño de agua. Lave el frotis de médula ósea preparado en el tampón SSC precalentado dos veces durante 10 minutos, seguido de sumergirlo en agua desionizada a temperatura ambiente. Deshidrate el frotis en un gradiente de etanol 70%85% y 100% etanol cada uno durante un minuto.Seque el frotis al aire durante 10 minutos. Primero agregue TP53 en el centrómero de la mezcla de sonda del cromosoma 17 al área de hibridación y cúbralo con una cubierta deslizante presione suavemente las pinzas puntiagudas finas para eliminar las burbujas de aire de debajo. Selle todos los lados del deslizamiento de la cubierta con cemento de goma para garantizar una buena estanqueidad.Después de la solidificación del cemento de caucho, la corredera se colocó en una máquina automática FISH, la desnaturalización se realizó a 78 grados centígrados durante cinco minutos, seguida de hibridación a 37 grados centígrados durante la noche. Recoja la diapositiva de la máquina FISH. Use unas pinzas puntiagudas finas para quitar el cemento de goma suavemente.Sumerja la corredera en dos veces SSC a temperatura ambiente durante aproximadamente uno o dos minutos para lavar el deslizamiento de la cubierta. Lave el tobogán en un tampón de precalentamiento de 68 grados Celsius en un baño de agua durante dos minutos. Lave los toboganes con dos veces SSC en un baño de agua de 37 grados Celsius durante un minuto.Configure justo en la oscuridad para que se seque bien durante 10 minutos a 10 microlitros de DAPI en el área hibridada, cubra con un resbalón de cubierta. Vea la diapositiva hibridada utilizando un conjunto de filtros adecuado en un microscopio de fluorescencia, use un filtro óptico de fluoróforo azul monocromático para observar la intensidad de fluorescencia del núcleo celular. Tome imágenes del núcleo celular bajo un conjunto de filtros DAPI.CEP17 fue etiquetado con fluorescencia verde. Utilice el filtro óptico de fluoróforo verde de espectro para observar la ubicación de CEP17. Tome la imagen de las señales CEP17 bajo el conjunto de filtros verdes.El gen TP53 fue marcado con fluorescencia naranja. Utilice el filtro óptico de fluoróforo naranja de espectro para observar TP53, tome la imagen de señales TP53 debajo del conjunto, fusione estas tres imágenes en su totalidad y examine las anomalías numéricas. En una célula interfase normal se observan dos señales naranjas y dos verdes dentro de un núcleo con fluorescencia azul que indica un par de cromosomas normales 17.Los resultados mostraron la morfología y genética de la médula ósea en un paciente con mieloma múltiple. La Figura A mostró que se encontró que el 15% de las células plasmáticas en un frotis de médula ósea tenían cantidades más grandes y oscuras y nucleares junto con grandes cantidades de citoplasma de lo normal. La figura B mostró una imagen en escala de grises representativa por una célula plasmática nucleada en un frotis de médula ósea.La Figura C mostró cuatro señales naranjas y cuatro verdes en un núcleo interfase de células plasmáticas, lo que sugiere que cuatro copias del cromosoma 17 se localizaron en un núcleo. La Figura D mostró que el cariograma cromosómico anormal de este paciente confirmó dos pares de cromosomas 17 en un núcleo. Los frotis de médula ósea son mucho más fáciles de obtener que las muestras de médula ósea anticoagulantes porque la obtención de médula ósea anticoagulada requiere procedimientos complejos para obtener el núcleo.En consecuencia, establecimos un método convincente para el frotis de médula ósea FISH para la detección de células de mieloma múltiple.

Research

JoVE Journal

Medicine

Interphase Fluorescence in situ Hybridization of Bone Marrow Smears of Multiple Myeloma

Oral Biofilm Analysis of Palatal Expanders by Fluorescence In-Situ Hybridization and Confocal Laser Scanning Microscopy

Análisis de biofilm oral del paladar Expansores por fluorescencia de hibridación in situ y microscopía de escaneo láser confocal

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) of natural heterogeneous biofilm is today facilitated by a comprehensive range of staining techniques, one of ...

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Medicina

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