Name: implantation and control of wireless, battery-free systems for peripheral nerve interfacing
Uploaded: 2021-10-20T15:00:00
Duration: 7 min 13 s
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这项工作使用了西北大学NUANCE中心的NUFAB设施，该中心得到了SHyNE资源（NSF ECCS-1542205），IIN和西北大学MRSEC计划（NSF DMR-1720139）的支持。这项工作利用了西北大学材料研究中心美国国家科学基金会 （DMR-1720139） 的 MRSEC 项目支持的 MatCI 设施。C.K.F 感谢美国国立卫生研究院 （NIH） 的 Eunice Kennedy Shriver 儿童健康与人类发展研究所（资助号 R03HD101090）和美国神经肌肉基金会（发展资助）的支持。Y.H. 感谢 NSF 的支持（授权号。CMMI1635443）。这项工作得到了西北大学Querrey Simpson生物电子学研究所的支持。

本协议中描述的所有程序均按照 NIH 实验动物护理和使用指南进行，并已获得西北大学机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 的批准。该协议遵循西北大学比较医学中心和 IACUC 的动物护理指南。在调整协议时，有必要咨询IACUC。
1. 无线电子刺激器的制造（图2）
<ol><li>使用铜/聚酰亚胺/铜（18 μm 厚的顶部和底部铜，75 μm 厚的聚酰亚胺）作为射频功率收集器线圈（即无线接收器天线）的基板。</li>
	<li>使用直接激光烧蚀为顶部和底部铜层上的电极图案化孔，并对设备进行整形。使用银浆通过孔电连接顶层和底层。</li>
	<li>通过焊接将电子元件与商业包装（例如二极管和电容器）连接在一起。</li>
	<li>使用生物可吸收的动态共价聚氨酯（b-DCPU;200 μm厚）封装的钼（Mo;15 μm厚;蛇形结构）作为可拉伸延伸电极19。</li>
	<li>使用聚（乳酸-乙醇酸共聚乙醇酸）（PLGA）薄膜（300 μm 厚）形成用于设备和神经之间界面的袖带电极。</li>
	<li>连接无线接收天线和可拉伸延伸电极后，将无线接收天线封装，并用商品化的防水环氧树脂或聚二甲基硅氧烷（PDMS）连接。请参阅 图 2 （右）了解完全组装的设备。</li>
	<li>确认设备的无线操作，使用波形发生器通过初级线圈（即传输线圈）产生单相电脉冲。 注：检查外周轴突的募集和单相和双相刺激诱导轴突再生，先前的研究报告了由于波形特征20 的差异而忽略不计的影响，并且该组已经能够在小鼠21 和大鼠18 中实现具有相同单相电流参数的治疗性电刺激增强。此外，先前的研究检查了 体内 和 体外 的生物相容性，没有发现任何因加热效应或材料本身而造成组织损伤的证据。由于这些发现以及本研究中治疗性电刺激的持续时间有限，因此在本方案中使用了单相而不是双相刺激。</li>
	<li>使用连接到袖带电极的示波器测量产生的直流输出电压。</li>
</ol>2. 植入设备准备
<ol><li>将植入装置放入无菌培养皿中，并用封口膜密封。</li>
	<li>用紫外线照射设备每侧 30 分钟。</li>
</ol>3.大鼠右坐骨神经植入无线、无电池周围神经接口进行电刺激的外科手术（图3）
注意：保持无菌条件。在动物手术室的指定手术区域内进行手术。外科医生将在手术期间戴上口罩、外套、帽子和无菌手套。如果进行多次手术，请在动物之间更换无菌手套，并在每次手术中使用干净、无菌的手术器械。通过热灭菌（高压灭菌器或玻璃珠灭菌器）在手术之间对工具进行灭菌。使用体重为200-250克的成年Sprague-Dawley大鼠。
<ol><li>使用氧气（2L / min）中的异氟烷气体麻醉（3%诱导，1-3%维持）诱导麻醉，皮下注射美洛昔康（1-2mg / kg）。用指定的眼药膏盖住大鼠的眼睛，以防止干燥。</li>
	<li>将大鼠俯卧在消毒的手术台上进行后续手术。在剩余的手术持续时间内，评估呼吸频率（应为 ~2/s）、组织颜色和麻醉深度，不少于每 15 分钟一次，并相应地维持异氟烷水平。通过检查踏板反射（对坚定的脚趾捏合缺乏反应）来确认适当的麻醉深度。监测粘膜，粘膜应保持粉红色和湿润。</li>
	<li>剃除手术部位，包括右腿和背部下半部分。用甜菜碱垫擦洗剃光的手术区域，然后用 70% 的医用乙醇拭子擦洗，然后重复此擦洗过程三次以进行皮肤消毒。</li>
	<li>使用组织剪刀在皮肤上做一个与右股骨平行的 1.5 – 2 厘米切口，然后钝性分离背部（切口直接内侧）的皮下结缔组织，以清除接收器线圈的皮下口袋（图 4A）。在右臀肌上做一个平行于皮肤切口的后续切口（1.2-1.5厘米）。</li>
	<li>用钝端的金属解剖探针轻轻隔离坐骨神经（图4B）。 注意：坐骨神经位于股二头肌深处，与股骨平行。建议使用剖析范围。</li>
	<li>通过将袖带缠绕在孤立的右坐骨神经上，将无线无电池设备植入坐骨神经（图 4C），而不会使神经处于紧张状态或扭曲其路径 18,19,20。在放置接收器线圈的皮肤上做标记，以进行进一步的电刺激。</li>
	<li>使用可吸收缝合线缝合臀肌切口（图4D）。 注意： 接收器线圈的上半部分位于臀肌上方，其下方的袖带接口。</li>
	<li>用伤口夹（或埋入缝合线; 图4E）。匹配皮肤边缘。</li>
	<li>在麻醉下提供1小时连续的术后20Hz电刺激，脉冲宽度为200μs（图4F）。在动物从麻醉中完全恢复后，将它们放回笼子。 注意：详细协议如下所述。接收器线圈如 图4F所示。</li>
	<li>术后治疗<ol><li>将大鼠放在没有床上用品的恢复笼中，内衬纸巾，将笼子的一半放在适当的温度调节热源（经批准的加热垫）上。</li>
		<li>仔细监测大鼠，直到它可以走动。一旦可以走动并评估为稳定，将大鼠放回笼子并观察重新融入社会。</li>
		<li>急性恢复后，监测大鼠切口部位感染和神经源性疼痛症状，包括但不限于守卫、扭动、抓挠和自残。在手术后5天恢复期每天监测大鼠，如果第5天没有处死大鼠，则至少每三天监测一次。</li>
		<li>手术后每天一次皮下注射美洛昔康（1-2mg / kg），持续两到三天，具体取决于动物表现出的疼痛/不适程度。如果怀疑持续性疼痛，术后继续使用美洛昔康，如果证明难治性，则尽早与兽医团队协商对大鼠实施安乐死。</li>
		<li>手术后 10-12 天取下皮肤缝合线或伤口夹。</li>
	</ol></li>
</ol>4.大鼠左膈神经植入无线刺激器的外科手术（图5A）
注意：保持无菌条件，如第 3 节所示。使用体重为200-250克的成年Sprague-Dawley大鼠。使用前对所有手术工具进行消毒。
<ol><li>使用氧气（2L / min）中的异氟烷气体麻醉（3%诱导，1-3%维持）诱导麻醉，皮下注射美洛昔康（1-2mg / kg）。用指定的眼药膏覆盖大鼠的眼睛，以防止干燥。</li>
	<li>将大鼠仰卧在消毒的手术台上进行后续手术。在剩余的手术持续时间内，评估呼吸频率、组织颜色和麻醉深度不少于每 15 分钟一次，并相应地维持异氟烷水平。通过检查踏板反射（对坚定的脚趾捏合缺乏反应）来确认适当的麻醉深度。监测粘膜，粘膜应保持粉红色和湿润。</li>
	<li>剃掉颈部腹侧的手术区域。用甜菜碱垫擦洗剃光的手术区域，然后用 70% 的医用乙醇拭子擦洗，然后重复此擦洗过程三次以进行皮肤消毒。</li>
	<li>在颈部中线皮下注射布比卡因（2 mg/kg，用不超过总体积 0.5mL 的盐水稀释），针对最浅层。在皮肤和颈浅筋膜上做一个3厘米的中线切口，以暴露胸舌骨和胸锁乳突肌（图5B）。 注意：建议使用解剖范围。</li>
	<li>用探头轻轻钝性解剖抬高胸锁乳突肌，并使用血管环将其横向缩回（图5C）。轻轻松开并缩回舌骨。接下来，轻轻释放并向内侧缩回迷走神经和舌骨肌下方的颈动脉束。 注意：这里的主要区别是迷走神经和膈神经之间的区别。如果有必要暴露下面的结构，请切割舌骨。</li>
	<li>隔离膈神经（图5D）。 注意：膈神经沿着前斜角肌的表面延伸，作为垂直于臂丛神经交叉的明显较小的纵神经运行。与坐骨神经不同，颈部膈神经周围的解剖结构更为复杂。在植入前进行电生理确认（步骤 4.7）以获得最佳效果。</li>
	<li>将记录电极皮下放置，刚好在肋骨的尾部，与孤立的膈神经同侧（图5E）。将刺激器放在膈神经上，并通过同步信号进行确认（图6）。 注意：典型情况下，刺激强度为 ~3-6 mA，刺激持续时间为 0.02 毫秒。</li>
	<li>当相对于横断部位在近端神经末端施加电刺激时，通过显示诱发反应的完全消除来验证膈神经的完全横断（图 6）。</li>
	<li>通过将植入装置的接收器线圈放置在胸骨舌骨上，相对于双侧胸锁乳突肌深，将袖带围绕膈神经，接触电极垂直于神经，在膈神经上植入无线无电池装置（图5F）。</li>
	<li>用简单的可吸收缝合线闭合浅表颈筋膜（图5G）。在真皮深层用间断的倒置可吸收缝合线封闭皮肤。只有在动物从麻醉中完全恢复后，才能将动物送回笼子。</li>
	<li>对于术后治疗，请遵循步骤3.10。</li>
</ol>5. 治疗性电刺激的无线输送
<ol><li>在全身麻醉下对大鼠施加电刺激1小时。对于无线刺激，将波形/函数发生器（电压：1-15 Vpp）和可选的放大器放在动物上方，为外部感应线圈（即传输线圈）（2 匝二维螺旋线圈;直径：2 厘米）提供电力，以确保与植入的接收器线圈有良好的电感耦合。以 20 Hz 提供单相 200 μs 脉冲，持续 1 小时。</li>
	<li>为了验证和量化电刺激传递，记录来自胫骨前肌的 CMAP，调整刺激电压以提供坐骨神经的超最大激活。使用同心针电极进行所有记录。 注意： 如果函数生成的最大电压不足以唤起最大响应，请使用 amp升压器。</li>
</ol>6. 安乐死
<ol><li>主要方法<ol><li>将笼子放在 CO2 输送室下方，设置为 8-12 LPM 的速率（或基于腔室大小的适当流速）。监测大鼠是否失去知觉，然后停止呼吸至少1分钟。</li>
	</ol></li>
	<li>二次法<ol><li>进行颈椎脱位或双侧开胸术。</li>
	</ol></li>
</ol>

作者没有利益冲突。

本文描述了在大鼠坐骨神经和膈神经模型中手术植入和操作无线、无电池和完全可植入的周围神经接口的步骤。我们展示了如何使用这种新型生物医学植入物来提供治疗性电刺激范式，在临床前和临床研究中显示可以增强轴突再生（有关审查，请参阅22）。该协议并不复杂，可以外推到较小的动物模型，例如小鼠21，以及其他具有光电和微流体周围神经接口18,23,24,25,26,27,28,29,30功能的无线，无电池和完全植入的设备.还展示了使用啮齿动物坐骨神经的方法，这是最常见的实验模型31。
当这种方法适应于与膈神经的接口时，这种方法的多功能性已经得到证明，膈神经很少被用作周围神经损伤的模型32，也许是因为它是一个被严重低估的临床问题33,34,35。在 COVID-19 大流行期间，膈神经损伤的诊断和康复已成为一个重要问题 36,37,38。目前尚不清楚这种简短的低频电刺激范式是否可以增强膈轴突的再生和膈肌麻痹的恢复。然而，膈神经电刺激膈肌起搏是高位颈脊髓损伤导致四肢瘫痪患者呼吸衰竭的既定选择39,40,41,42,43。其他适应症正在探索中，包括危重疾病后呼吸机脱机44.
应强调几个关键步骤，以确保植入系统的良好运行。首先，重要的是在处理设备时避免对设备的薄电子元件施加太大的力，以防止铅脱绝缘、扭结或断裂。接下来，重要的是要准确标记射频功率采集器线圈在覆盖皮肤上的位置。第三，用鹅颈夹将外部射频电源的传输线圈仔细对准植入装置的功率采集器线圈，以确保稳定运行。最后，除了目视观察肌肉抽搐外，为了确认电刺激，建议定期进行神经生理监测。在颈部膈神经解剖结构更复杂的情况下，电生理确认有助于证明正确的神经已被分离出来（图6）。
除了本文18,19,21 中所示的无线、无电池电刺激器外，许多其他设备可能共享相同的程序。例如，由于设计用于植入舌咽神经和迷走神经以长期记录来自交感神经和副交感神经系统 30,45,46 的电极与膈神经共享相似的手术区域，因此该协议可以适用于它们的植入。用于周围神经的无线长期生物相容性刺激器，例如 ReStore，是保持原位并根据需要刺激神经的绝佳工具 25,47,48,49,50。还报道了相关的多通道无线录音植入物51.总体而言，我们相信这些手术和电刺激方案可以作为与电刺激或记录相关的所有无线周围神经接口的标准。

创伤性周围神经损伤 （PNI） 在美国发生，年发病率约为每年 200,000 例1。大多数患有 PNI 的患者都会留下永久性功能障碍。在最坏的情况下，这可能会导致肌肉麻痹并引发治疗难治性神经性疼痛，以至于患者愿意接受截肢作为治疗2。改善PNI结果的最大障碍是轴突再生相对于它们必须再生的距离太慢。例如，成人轴突以 1 毫米/天的速度生长，但在近端肢体病变的情况下，可能需要在距离>1000 毫米的距离内再生。
在目前的临床实践中，~50% 的 PNI 需要手术修复3.为了成功进行神经再生，轴突必须 （i） 在病变部位生长（即间隙交叉），然后 （ii） 沿神经通路再生以到达终末器官靶标（即远端再生）（图 1）。目前尚无 FDA 批准的药物被证明可以加速神经再生。PNI 临床管理的现状在过去几十年中只是逐渐改变，并且仅限于对手术方法的技术改进，例如远端运动神经转移以减少再生轴突必须行进的距离4，或“现成的”合成神经导管，用于近端神经回缩且无法直接缝合在一起的情况5.然而，已经有四项关于术后神经治疗性电刺激的随机临床试验，这些试验是由阿尔伯塔大学的 K. Ming Chan 博士领导的单中心研究，显示肌肉6、7、8 或皮肤9 的神经再支配显着改善。该电刺激方案的基础工作是在啮齿动物 10,11 中进行的，其中已经表明电刺激通过增强间隙交叉（图 1）而不是远端再生 12,13,14,15 来特异性地起作用。
在所有四项电刺激随机临床试验中使用的经皮线电极的手术放置是必要的，因为它的效果取决于以 20 Hz 连续 1 小时11 小时 20 Hz 使神经元细胞体去极化的足够电流的传递。在临床实践中，由于疼痛，这种电刺激方案对于大多数患者来说是无法忍受的，因为皮肤上的表面刺激电极所需的强度。术后运行经皮电极存在不小的风险，例如深部伤口感染或在将患者从手术室 （OR） 转出时金属丝从神经上意外移位。此外，手术室时间的高成本本身阻碍了在那种情况下而不是在急性术后恢复期间尝试手术。一类新型的无线、无电池和完全植入式周围神经接口正在出现，以解决现有周围神经接口的这一缺点。
这种新型的无线植入式电子系统有望提高电刺激给药的便利性和灵活性，并打破阻碍其更广泛临床实施的障碍。本文描述了在成年大鼠坐骨神经和膈神经模型中 （i） 手术植入和 （ii） 无线供电和控制该系统的方法。它展示了周围神经接口如何唤起 CMAP，提供治疗性电刺激方案，甚至充当周围神经修复的管道。这里的方案可以适用于该技术的其他变体，这些变体可以为光遗传学介导的神经调控16，受控药物释放17或随时间重复的电刺激18,19提供光脉冲。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amplifier</td>
			<td>Electronics &#38; Innovation</td>
			<td>201L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arbitrary Waveform Generator</td>
			<td>RIGOL</td>
			<td>DG1032Z</td>
			<td>30 MHz, 2 Channel, 200 MS/s, 14bit Resolution, 8 Mpts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bupivacaine</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>655317</td>
			<td>Marcaine, 0.5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper/polyimide/copper</td>
			<td>Pyralux</td>
			<td>AP8535R</td>
			<td>18 &#181;m thick top and bottom copper, 75 &#181;m thick polyimide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMG recording device</td>
			<td>Natus</td>
			<td>Nicolet VikingQuest</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPOXY MARINE</td>
			<td>Loctite</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane, USP</td>
			<td>Butler Schein Animal Health</td>
			<td>1040603</td>
			<td>ISOTHESIA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam</td>
			<td>covetrus</td>
			<td></td>
			<td>5mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle electrodes</td>
			<td>Technomed USA Inc.</td>
			<td>TE/B50600- 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS (Silicone Elastomer Kit)</td>
			<td>DOW</td>
			<td>SYLGARD&#8482; 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProtoLaser U4</td>
			<td>LPKF</td>
			<td>U4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puralube Vet Ointment Sterile Ocular Lubricant</td>
			<td>Puralube</td>
			<td>83592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waveform generator</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>Agilent 33250A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

implantation and control of wireless, battery-free systems for peripheral nerve interfacing

周围神经接口经常用于实验神经科学和再生医学中的各种应用。此类接口可以是传感器、执行器或两者兼而有之。传统的周围神经接口方法必须连接到外部系统或依靠电池供电来限制操作时间。随着无线、无电池和完全植入式周围神经接口的最新发展，一类新型设备可以提供与其有线或电池供电的前体相匹配或超过其功能。本文描述了 （i） 手术植入和 （ii） 在成年大鼠中无线供电和控制该系统的方法。选择坐骨神经和膈神经模型作为示例，以突出这种方法的多功能性。这篇论文展示了周围神经接口如何唤起复合肌肉动作电位（CMAP），提供治疗性的电刺激方案，并结合用于修复周围神经损伤的导管。此类设备为单剂量或重复剂量治疗刺激提供了扩展的治疗选择，并且可以适应各种神经位置。

在坐骨神经损伤模型中，在对胫神经分支进行端到端修复之前，将植入物放置在右侧坐骨神经周围（图 3、 图 4A 和 图 7A）。将 30 G 同心针电极放置在右胫骨前肌中，以确定最大强度电刺激所需的刺激参数。这些实验包括提高刺激强度，直到响应幅度达到最大水平。由于胫骨前部由坐骨神经的腓支支配，因此在胫神经横断损伤中幸免于难。因此，从胫骨前部记录可以连续监测电刺激治疗。
对于由导线电极传递到右坐骨神经的单刺激脉冲（5 mA，0.02 ms），通过同侧胫骨前部记录的 5.4 mV 负峰值振幅引发最大 CMAP 响应（图 7B;黑色迹线）。对于无线、无电池植入物提供的类似刺激脉冲，可通过4.6 mV负峰值幅度引发可比的CMAP响应（图7B;橙色迹线）。这与最近的一份报告一致，即无线神经刺激平均从基于线的神经刺激中实现了 88% 的 CMAP21，远高于临床研究中治疗效果所需的阈值 6,7,8,9。在所示示例中，无线刺激器与有线刺激器相比延迟更长，这是由于它与记录的肌肉距离更大。
在膈神经模型中，植入物在横断之前放置在右膈神经周围（图 5）。为了确定最大强度电刺激所需的刺激参数，将 30 G 同心针电极皮下放置在右侧（同侧）前肋缘，以从右侧半膈肌记录。实验包括升高刺激电压，直到响应幅度达到最大值。由于膈神经很难与周围的神经血管结构分离，因此可以通过诱发抽搐反应来确认其身份（图6;橙色痕迹）。刺激的特异性可以通过横切神经远端到神经电极袖带并随后消除抽搐反应来进一步验证（图6;黑色痕迹）。
重复的低频电刺激治疗可以使用增强轴突再生的既定方案输送到坐骨神经 1 小时 （6,7,8,9,10,11;图8）。将无线植入物的袖带接口放置在右侧坐骨神经上，将30G同心针电极放置在右侧胫骨前肌上，以监测治疗情况。图 8A 显示了在 1 小时 20 Hz 电刺激开始（0 分钟）记录的肌电图中的四个连续尖峰。图8B显示了在1小时电刺激的40分钟处记录的其他四个尖峰，峰值振幅略有降低，这与基于线的电刺激疗法15,21所记录的疲劳模式一致。
周围神经再生的程度可以使用应用于神经病变部位远端的逆行示踪剂来评估。由于外周轴突萌发多个侧支芽，脊髓中运动神经元体的逆行追踪和计数可以比计算神经本身内的再生轴突更准确地评估再生神经元的数量31。为了证明这一点，坐骨神经干被挤压伤横断。恢复3周后，在坐骨神经的两个分支上施用两种不同的荧光逆行染料：分别是腓神经（绿色）和胫神经（红色）（图9A）。图9B-D显示了腰椎脊髓前角中形成胫神经（图9B）或腓神经（图9C）的下运动神经元亚群。叠加图像显示了脊髓前角中两列不同的标记神经元，可以根据空间分布和在病变部位远端再生轴突的运动神经元的数量进行量化（图9D）。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63085/63085fig01.jpg"> 图1：神经再生模型。 （A） 当修复后轴突从近端向远端神经末梢生长时，间隙交叉发生在神经修复后的早期。（B） 远端再生的持续时间与到目标终末器官（例如皮肤、肌肉）的距离和轴突再生的速度有关。大多数改善神经修复的疗法都针对这些过程中的一个或两个。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63085/63085fig01large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63085/63085fig02.jpg"> 图 2：无线电子刺激器制造图示。 左图是该装置结构的详细层，包括一个圆形射频功率采集器线圈、一个可拉伸的延伸电极和一个缠绕在目标神经周围的神经袖。右图是显示设备三个部分的简化图。缩写：PLGA = 聚（乳酸-co-乙醇酸）;b-DCPU = 生物可吸收动态共价聚氨酯。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63085/63085fig02large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63085/63085fig03.jpg"> 图 3：在大鼠坐骨神经模型中植入无线、无电池神经接口。 （A） 该图描绘了大鼠右坐骨神经中的完全植入系统。（B） 上图显示了位于坐骨神经上的电极界面，就在右胫神经端到端修复的近端。下图显示了一个电极接口，该接口在近端和远端神经残端之间具有扩展的神经袖桥接间隙修复。缩写：PLGA = 聚（乳酸-乙醇酸）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63085/63085fig03large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63085/63085fig04.jpg"> 图 4：坐骨神经植入手术。 （A） 在皮肤、皮下结缔组织和臀肌上切开以暴露腘绳肌。（B）孤立的坐骨神经（黑色箭头）。（C） 植入后带有神经袖带、导线（白色星号）和可见植入物（星形）的装置。（D） 通过缝合闭合结缔组织。（E） 用伤口夹闭合切口。（F） 由皮肤上方的线圈产生的无线电刺激。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63085/63085fig04large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63085/63085fig05.jpg"> 图 5：膈神经植入手术。 （A） 仰卧位颈部腹面视图。（B） 在皮肤和皮下结缔组织上切开，露出胸舌肌。（C） 通过舌骨肌和胸锁乳突肌之间的潜在空间进行解剖。（D）膈神经（箭头），从臂丛神经中分离出来。（E） 膈神经的膈肌电图确认。黑色箭头，记录电极。红色箭头，刺激器。（f） 植入。（G） 用深层真皮缝合皮肤。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63085/63085fig05large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63085/63085fig06.jpg"> 图 6：通过膈肌诱发的复合肌肉动作电位确认完全膈神经横断损伤。 在膈神经横断术（ORANGE）之前，对膈神经的电刺激会引起同侧横膈膜上的复合肌肉动作电位，这被膈神经横断术（BLACK）消除。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63085/63085fig06large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63085/63085fig07.jpg"> 图 7：比较无线和有线电刺激的代表性神经传导研究。 （A） 无线 （BLACK） 和有线 （ORANGE） 设备放置在坐骨神经上的图示。将记录电极放置在胫骨前部。（B） 有线植入物 （ORANGE） 与无线植入物 （BLACK） 引起的复合肌肉动作电位。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63085/63085fig07large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63085/63085fig08.jpg"> 图 8：从植入物进行 20 Hz 重复电刺激 1 小时的 TA 肌肉的 EMG 记录。 （A） e-stim 分钟 1 处的 EMG 轨迹。（B） e-stim min 40 处的 EMG 痕迹。缩写：EMG = 肌电图;TA = 胫骨前;e-stim = 电刺激;min = 分钟。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63085/63085fig08large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63085/63085fig09.jpg"> 图9：坐骨神经再生的代表性图像。 （A） 坐骨神经损伤和荧光逆行标记的图示。坐骨神经轴突因挤压伤横切。恢复 3 周后，其远端分支——腓神经（绿色）和胫神经（红色）——被逆行标记。（B-D）腰椎脊髓图像显示前角内的神经元胞体。比例尺 = 30 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63085/63085fig09large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>

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Implantation and Control of Wireless, Battery-free Systems for Peripheral Nerve Interfacing

这是一种用于外科植入和操作周围神经无线供电接口的协议。我们通过放置在大鼠坐骨神经或膈神经上的神经刺激器的例子来证明这种方法的实用性。

用于周围神经接口的无线、无电池系统的植入和控制

Peripheral nerve interfaces are frequently used in experimental neuroscience and regenerative medicine for a wide variety of applications. Such interfaces ...

周围神经损伤很常见。电刺激对神经再生有治疗作用。因此，在这里我们展示了一种关于植入神经接口和设备利用的通用方法。这种技术避免了导线穿过皮肤，皮肤可能是感染部位。植入式刺激器可以无线供电，并根据治疗需求进行调整。这种电刺激装置具有很高的治疗潜力，可以增强受伤或疾病后的周围神经再生，帮助恢复失去的功能，否则可能会受到损害。隔离神经并实现与袖带的良好接触需要精细。切勿用器械直接抓住神经，而是用钝器操纵神经并保持无张力的位置。在开始外科手术之前，将大鼠置于准备台上的俯卧位，并通过检查耳廓反射确认适当的麻醉深度。在整个手术过程中，每 15 分钟评估一次呼吸频率、组织颜色和麻醉深度，并相应地维持异氟水平。监测粘膜，粘膜应保持粉红色和湿润。将大鼠放在准备台上。剃除手术部位，包括右腿和背部下半部分。完成后，将动物移至手术台上，用Betadine垫擦洗剃光的手术区域，然后用70%乙醇拭子擦洗三次。使用组织剪刀在皮肤上做一个平行于右股骨的切口，然后钝性地分离背部的皮下结缔组织，直接在切口内侧，为接收器线圈清除皮下口袋。然后在与皮肤切口平行的右臀肌上做一个后续切口。在钝端金属解剖探头的帮助下，隔离坐骨神经，然后通过缠绕袖带将无线无电池设备植入隔离的坐骨神经上，而不会使神经处于紧张状态或扭曲其路径。完成后，在放置接收器线圈的皮肤上做标记，以进行进一步的电刺激。使用可吸收缝合线缝合臀肌切口。通过匹配皮肤边缘，用伤口夹封闭皮肤切口。手术后一小时，向麻醉下的动物提供连续的 20 赫兹电刺激和 200 微秒的脉冲宽度。麻醉完全恢复后，将动物放回笼子。如前所述，为外科手术准备包裹后，剃掉颈部腹侧的手术区域。将动物移至手术台上，用Betadine垫擦洗剃光的手术区域，然后用70%乙醇拭子擦洗三次。接下来，在麻醉大鼠的浅表颈筋膜中的皮肤上做一个三厘米的中线切口，以暴露胸骨舌骨和胸锁乳突肌。使用探头进行血液解剖以抬高胸锁乳突肌，然后使用血管环横向缩回胸锁乳突肌。然后，释放并缩回舌骨肌，然后释放并向内侧缩回迷走神经和舌骨肌下方的颈动脉束。隔离膈神经。将无线无电池设备植入膈神经上，方法是将设备的接收器线圈放在胸骨舌骨上，相对于双侧胸锁乳突肌深，袖带围绕膈神经，接触电极垂直于神经。在真皮深层用倒置的可吸收缝合线封闭皮肤。手术后一小时，向麻醉下的动物提供连续的 20 赫兹电刺激和 200 微秒的脉冲宽度。麻醉完全恢复后，将动物放回笼子。对于无线刺激，使用波形函数发生器为外部感应传输线圈提供电力。匹配植入的接收线圈的谐振频率和位置，以确保良好的电感耦合。设置完成后，以 20 赫兹提供单相 200 微秒脉冲，持续一小时。为了验证和量化电刺激传递，记录来自胫骨前肌的复合肌肉动作电位 （CMAP），同时调整刺激电压以提供坐骨神经的最大激活。该研究通过诱发抽搐反应证实了完全的膈神经横断损伤。横断前，膈神经的电刺激在同侧膈肌上引起复合肌肉动作电位，膈神经横断消除了这种电位。将线电极向右侧坐骨神经痛传递单个刺激脉冲后引发的最大CMAP反应与无线电电极进行比较。据观察，无线神经刺激平均可以达到基于有线神经刺激的 CMAP的 88%。代表性肌电图分析显示，在开始和 40 分钟的 1 小时 20 赫兹电刺激中，有四个连续的尖峰。在40 min时，注意到峰值振幅略有下降。使用应用于神经病变部位远端的逆行示踪剂评估周围神经再生的程度。观察腰椎脊髓前角中胫神经或腓神经的再生亚群。请记住，发射线圈必须与接收线圈很好地对齐，以便在调整距离、方向或位置时为设备供电，以实现全部功效。该方法还可以在其他优选的神经界面上进行，例如药物释放和光遗传学。该技术可用于研究电刺激对不同神经产生不同影响的各种机制。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Organotypic Slice Culture of GFP-expressing Mouse Embryos for Real-time Imaging of Peripheral Nerve Outgrowth

Organotypic Slice Culture of GFP-expressing Mouse Embryos for Real-time Imaging of Peripheral Nerve Outgrowth Video (Video) | JoVE

器官型切片文化绿色荧光蛋白表达的实时成像周围神经生长的小鼠胚胎

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in ...

科研

神经科学

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